Summary
여기에서는 리 모실락토바실러스 루테리 DSM20016 작업을 위한 프로토콜, 성장, 플라스미드 형질전환, 콜로니 PCR, 형광 리포터 단백질 측정, 제한된 플라스미드 미니 프렙, 일반적인 문제 및 문제 해결을 자세히 설명합니다. 이러한 프로토콜을 통해 DSM20016에서 리포터 단백질을 측정하거나 리포터가 관여하지 않는 경우 콜로니 PCR을 통해 확인할 수 있습니다.
Abstract
락토바실러스 는 261종으로 구성된 믿을 수 없을 정도로 크고 다양한 박테리아 속으로, 그 중 일부는 위장관 내에서 합성 생물학적 노력을 위한 섀시로 사용할 수 있는 공생 균주였습니다. 속 내에서 관찰된 광범위한 표현형 및 유전형 변이로 인해 최근 재분류와 23개의 새로운 속이 도입되었습니다.
이전 속의 다양한 변형으로 인해 한 구성원에서 입증된 프로토콜이 다른 구성원과 함께 광고된 대로 작동하지 않을 수 있습니다. 특정 균주를 정확히 조작하는 방법에 대한 중앙 집중식 정보가 부족하여 종종 다른 박테리아 계열에서 채택된 다양한 임시 접근 방식이 도입되었습니다. 이것은 현장에서 시작하는 연구자들에게 문제를 복잡하게 만들 수 있으며, 어떤 정보가 자신이 선택한 균주에 적용되는지 또는 적용되지 않는지 모를 수 있습니다.
이 백서에서는 특히 리모실락토바실러스 루테리 균주 명칭 F275(기타 수집 번호: DSM20016, ATCC23272, CIP109823)에서 입증된 성공 프로토콜 세트와 함께 문제 해결 조언 및 발생할 수 있는 일반적인 문제를 중앙 집중화하는 것을 목표로 합니다. 이러한 프로토콜은 L. 루테리 DSM20016 사용한 경험이 거의 또는 전혀 없는 연구자가 플라스미드를 형질전환하고, 형질전환을 확인하고, 리포터 단백질을 통해 플레이트 판독기에서 시스템 피드백을 측정할 수 있도록 해야 합니다.
Introduction
락토바실러스(Lactobacillus) 속은 역사적으로 그람 양성, 막대 모양, 포자 형성이 없는 통성 혐기성 세균 또는 주로 젖산1을 생성하기 위해 당을 분해하는 미세호기성 미생물로 분류되었습니다. 이러한 느슨한 기준으로 인해 락토바실러스는 표현형적으로나 유전형적으로 매우 다양한 속이 되었습니다. 이러한 광범위한 분류로 인해 속이 재분류되어 2020년에 23개의 새로운 속이 도입되었습니다2.
오래되고 더 넓은 속(genus)에는 일반적으로 섭취하기에 안전한 것으로 간주되는(GRAS) 주요 공생 및 프로바이오틱 종(probiotic species)이 포함되었다3. 락토바실라과(Lactobacillaceae)는 다양한 균주 4,5,6,7의 섭취를 통해 제공되는 많은 보고된 건강상의 이점으로 인해 '좋은 박테리아'라는 대중의 인식을 유지하고 있습니다. 위장관을 쉽게 탐색할 수 있는 방법8과 대중의 인정은 락토바실라과(Lactobacillaceae) 균주를 섭취 가능한 의약, 치료 또는 진단 응용 분야를 위한 섀시 유기체와 같은 강력한 후보로 포지셔닝합니다.
Lactobacillaceae 계통에 존재하는 광범위한 특성으로 인해 사실상의 모델-유기체 균주가 없는 상황이 발생했습니다. 연구 그룹은 특정 목표와 가장 관련이있는 특성을 가진 종을 선택하는 경향이 있습니다. (예를 들어, 유제품 발효 실험실은 L. lactis를 선택할 수 있고, 식물성 발효 연구는 L. plantarum을 선택할 수 있으며, 프로바이오틱스에 대한 연구는 L. acidophilus에 초점을 맞출 수 있습니다.)
종에 걸친 이와 같은 광범위한 특성으로 인해 락토바실라과(Lactobacillaceae ) 계열의 한 하위 집합에서는 잘 작동할 수 있지만 다른 부분집합에서는 효율적으로 작동하기 위해(또는 전혀 기능하지 않는) 최적화가 필요한 프로토콜과 절차가 축적되었습니다9. 가족 구성원 간, 심지어 같은 종의 구성원 내에서도 최적화에 대한 이러한 필요성은 익숙하지 않은 연구자의 노력을 좌절시킬 수 있습니다. 논문의 방법 섹션에 발표된 프로토콜은 또한 그들 자신의 수정(10)을 포함할 수 있으며, 이는 단편화되고 분산된 프로토콜 모음으로 이어진다.
L. 루테리(L. reuteri)는 포유류, 조류11 및 어류12 위장관(GI)에서 일관되게 발견되는 널리 척추동물 공생동물로 여겨진다. L. 루테리 하위 균주는 종종 점액 접착 단백질 적응을 통해 유전적으로 특수화되어 특정 토착 숙주를 보다 영구적으로 식민지화합니다 8,11,13. 위장관 리모실락토바실러스(Limosilactobacillus) 종은 본래 숙주 외부의 숙주에서 분리될 수 있지만, 일시적인 성질을 띠는 경향이 있다8.
인간-숙주 전문화로 인해 L. 루테리 DSM20016는 인간 위장관의 어느 지점에서든 진단 또는 치료 적용을 위한 섀시로 매우 잘 자리 잡았으며, 균주 DSM20016은 더 일시적인 균주와 비교할 때 중재에 더 오래 지속되는 효과 창을 제공할 수 있습니다.
이 논문에서는 분자 및 시스템 생물학 응용 분야에 도움이 되는 다른 출처의 균주에 대한 중앙 집중식 정보와 함께 Limosilactobacillus reuteri( 균주 명칭: F275, 기타 수집 번호: DSM20016, ATCC23272, CIP109823)에서 효과가 입증된 일련의 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 여기에 제시된 절차는 L. reuteri를 배양하고, 전기적격 스톡을 생성하고, 형질전환된 콜로니를 선택하고, 콜로니 중합효소 연쇄 반응(PCR) 을 통해 형질을 확인하고, 형광 리포터 단백질을 통해 설계된 시스템 반응을 측정할 수 있도록 해야 합니다.
관련 프로토콜은 L. 루테리(L. reuteri, 균주: ATCC-PTA-6475)14에서 CRISPR-Cas9 보조 ssDNA 게놈 재조합 및 여러 non-L에서 CRSIPR-Cas9 nickase-assisted genome editing을 다루었습니다. 루테리, 락토바실라과(Lactobacillaceae) 계열 염색15,16; 그러나 이것들은 여기서 우리가 초점을 맞추는 L. reuteri DSM20016 균주를 다루지 않습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. L. 루테리 DSM20016 전기적격 전지 준비
참고: 이것은 Berthier et al.17의 프로토콜을 기반으로 하며 원심분리 속도는 Rattanachaikunsopon et al.에서 알려줍니다.18.
- 50mL 원심분리기 튜브에서 글리세롤 스톡의 L. 루테리 를 6mL의 deMan Rogosa Sharpe(MRS) 브로스에 접종합니다. 정적 인큐베이터에서 37°C에서 하룻밤 동안 호기적으로 배양합니다.
- 다음날 아침, 하룻밤 배양액 4mL를 MRS 브로스 200mL에 접종합니다(1:50 희석).
- 600nm 광학 밀도 값(OD600)이 0.5-0.85에 도달할 때까지 정적 37°C 인큐베이터에서 호기성으로 성장하도록 합니다. 대략 2-3시간이 소요됩니다.
- 적절한 OD600 값에 도달하면 매체를 50mL 원심분리기 튜브에 디캔팅하고 튜브의 균형을 맞추면서 얼음 위에 놓습니다.
- 미리 냉각된 4°C 원심분리기에서 5,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 버리고, 각각의 펠릿을 50 mL의 예비냉각된(0°C 내지 4°C)ddH2O에 재현탁하고, 이전 단계와 동일한 설정으로 다시 원심분리한다. 세포를 가능한 한 얼음 위에 보관하십시오.
- 1.6단계를 반복합니다.
- 각각의 펠릿을 25 mL의ddH2O:0.5 M 수크로오스, 10% 글리세롤에 재현탁시킨다. 4°C에서 5,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 세포를 다시 얼음 위에 놓습니다.
- 모든 펠릿을 동일한 2 mL의ddH2O:0.5 M 수크로오스, 10% 글리세롤로 재현탁시킨다.
- 50 μL 내지 100 μL 분취액을 미리 냉각된 미세원심분리 튜브에 넣는 단계; 나중에 사용할 수 있도록 -80 °C에서 보관하십시오.
2. L. 루테리 의 전기천공법
참고: 다음 단계에서 가능한 한 피펫팅을 피하십시오. 플라스미드가 추가되지 않은 대조군 전기천공을 포함하는 것은 항생제 선택이 적절한지 확인하는 것이 좋습니다.
- 전기 능력이 있는 L. 루테리 분취량을 통째로 취하여 얼음 위에서 해동합니다.
- 5 μL에서 10 μL의 플라스미드(최종 플라스미드 농도 >6 nM)를 해동된 분취량에 부드럽게 혼합하여 피펫팅을 최대한 피합니다.
- 얼음으로 식힌 1mm 간격의 전기천공 큐벳으로 옮깁니다.
- 1.25kV, 400 Ω 및 25μF에서 전기증착.
- 실온(RT) MRS 육수 1mL를 넣고 큐벳을 한두 번 뒤집어 섞습니다.
- 큐벳을 37°C의 정적 인큐베이터에 2.5-3시간 동안 넣어 회복을 허용합니다.
- 적절한 선택으로 전체 양을 여러 MRS 한천 플레이트에 플레이트합니다.
- 작은 불이 켜진 양초("티라이트")와 혐기성 대기 생성 향 주머니가 있는 완전히 밀폐된 용기 안에 접시를 넣습니다.
- 37 °C에서 2-3일 동안 또는 눈에 보이는 집락이 나타날 때까지 성장시킵니다.
3. 내산성 형광 리포터 단백질 mCherry2의 측정
- 측정에 필요한 콜로니를 선택하고 웰당 1.5mL의 필터 멸균(비오토클레이브) MRS 브로스와 적절한 선택 항생제가 포함된 96웰 보관 마이크로플레이트에 접종합니다.
- 흔들리지 않고 37°C에서 하룻밤 동안 24시간 동안 호기적으로 배양합니다.
참고: 이 보관 마이크로플레이트는 섹션 4(콜로니 PCR)에서 사용하기 위해 보관해야 합니다. - L. reuteri 는 정지 단계에 있을 때 배지 밖으로 침전됩니다. 피펫팅을 통해 하룻밤 배양을 다시 중단합니다.
- 200 μL를 평평하고 깨끗한 바닥의 96 웰 플레이트에 옮기고, 플레이트를 플레이트 리더로 옮기고, mCherry2 (여기 [Ex] : 589 nm; 방출 [Em] : 610 nm) 또는 기타 관련 리포터의 OD 및 형광을 측정합니다.
4. 콜로니 PCR을 통한 플라스미드 흡수 확인
- 섹션 3의 96웰 보관 마이크로플레이트에서 5μL를 PCR 튜브로 옮깁니다.
알림: >5분이 경과하면 L. 루테리 를 두 번째로 다시 중단해야 할 수도 있습니다. - 휴대용 탁상용 미세 원심분리기에서 펠릿이 보일 때까지 회전하고(2,000 x g에서 약 2분), 상층액을 버리고, 펠릿을 20mM NaOH 20μL에 재현탁합니다.
- 95°C에서 5분간 끓이다가 소용돌이치고 두 번 끓인다.
- 즉시 샘플을 식히십시오. 주형 분해 및 PCR 억제 가능성을 낮추기 위해 다음 단계에서 샘플을 가능한 한 얼음에 보관하십시오.
- 세포 파편이 펠릿화될 때까지 2,000 x g 의 휴대용 벤치탑 미세 원심분리기에서 2분 동안 스핀다운한 다음 상층액 1μL를 취하여 얼음처럼 차가운 DNase 및 RNase가 없는 ddH2O99μL로 희석합니다(100x 희석).
- 플라스미드 특이적 프라이머를 사용하는 표준 PCR 반응에서 100x 희석액을 주형 DNA로 사용합니다. 양성 대조군을 E. coli mini-prep 유래의 플라스미드로 포함시킨다.
- 샘플을 얼음 위에 놓고 1x 농도로 적절한 로딩 염료를 추가합니다.
- TAE 완충액(트리스-아세테이트-에틸렌디아민테트라아세트산[EDTA])의 1% 아가로스 겔에서 110V에서 30분 동안 실행합니다. 필요한 경우 이미지.
5. L. 루테리 에 대한 미니 프렙 프로토콜, 플라스미드 존재를 확인하기 위한 PCR이 뒤따랐습니다.
알림: 재료 표에 나열된 미니 준비 키트와 함께 사용하기 위한 프로토콜입니다.
- 적절한 항생제가 들어 있는 MRS 브로스 10mL에 L. 루테리 를 접종하고 정적 배양기에서 37°C에서 하룻밤 동안 호기적으로 배양합니다.
- 미리 냉각된 4°C 원심분리기에서 10분 동안 5,000 x g 로 원심분리합니다.
- 이후 단계를 방해할 수 있는 산도를 무효화하기 위해 표준 P1 완충액 2mL(키트에 포함)로 펠릿을 세척하고, 이전에 설명한 것과 동일한 설정으로 원심분리하고, 상층액을 버립니다.
- 박테리아 세포를 용해하기 위해 10mg/mL 리소자임과 100U/mL 뮤타놀리신을 포함하는 변형된 P250 완충액 250μL에 펠릿을 재현탁합니다. 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.
- 250 μL의 완충액 P2를 첨가하고, 4-6회 반전하여 혼합하고, 5분 이상 RT에서 배양한다.
- 350 μL의 완충액 N3(키트에 포함)를 넣고 즉시 4-6회 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.
- 10,000 x g 에서 10분 동안 원심분리기.
- 가능한 한 많은 상청액을 스핀 컬럼으로 옮기고 10,000 x g 에서 60초 동안 원심분리합니다. 흐름을 버립니다.
- 스핀 컬럼을 500μL의 완충액 PB(키트에 포함)로 세척하고 10,000 x g 에서 60초 동안 원심분리기를 사용합니다. 흐름을 버립니다.
- 750μL의 완충액 PE(키트에 포함)로 스핀 컬럼을 세척하고 10,000 x g 에서 60초 동안 원심분리합니다. 흐름을 버리고 60초 동안 원심분리하여 잔류 버퍼를 제거합니다.
- 스핀 컬럼을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 20-30 μL의 DNAse- 및 RNAse-freeddH2O를 스핀 컬럼의 필터에 적용하고 1-2분 동안 방치한 후 10,000 x g 에서 60초 동안 원심분리합니다.
- 플라스미드 특이적 프라이머(pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGACA)를 사용하여 표준 PCR 반응을 수행하고, 주형 DNA를 제공하는 용출액을 사용합니다. 양성 대조군을 E. coli mini-prep 유래의 플라스미드로 포함시킨다.
참고: 이 연구에 사용된 PCR 설정은 다음과 같습니다: 98°C에서 5분, (98°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 45초) 30주기, 72°C에서 2분, 4°C 유지. 매개변수는 사용된 중합효소, 단편 길이 및 이 프로토콜을 사용하는 모든 사람이 사용하는 정확한 프라이머에 크게 의존합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
혁신 효율성
L. 루테리는 다른 락토바실라과(Lactobacillaceae) 19,20에서 관찰된 바와 같이 dcm-/dam- 비메틸화 플라스미드를 필요로 하지 않습니다(그림 1 참조). 8.5kb 플라스미드 pTRKH3_mCherry2(pAMβ1 세타 복제 기점) 10μL를 사용한 L. 루테리 DSM20016의 전기천공법은 플라스미드 메틸화 조건에 관계없이 약 80 콜로니 형성 단위(CFU)/μg(도금된 200μL당 5-8개의 콜로니)의 형질전환 효율을 제공해야 합니다. 선택적 경화 및 재형질전환을 통해 훨씬 더 큰 형질전환 효율을 가진 돌연변이 L. 루테리 균주를 얻을 수 있으며21, 약 4 x 103 CFU/μg(도금된 200 μL당 200-250 콜로니)의 pTRKH3_mCherry2으로 관찰되어 더 높은 처리량의 응용 분야가 가능합니다. 리포터 mTFP1에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다. 형질전환은 또한 pNZ123(pSH71 롤링 서클 기원)으로 수행되었으며, 외인성 구성 리포터 단백질을 운반하지 않아 3 x 104 CFU/μg DNA의 형질전환 효율을 가져왔습니다(보충 그림 1).
그림 1: 전기천공 효율. 총 10 nM pTRKH3_mTFP1 및 80 nM pTRKH3_mCherry2 플라스미드 스톡은 DH10β E. coli 및 dcm-/dam-methylase knockout E. coli의 두 가지 공급원으로부터 수득되었다. 그런 다음 L. reuteri를 10 μL의 두 가지 다른 메틸화 패턴 플라스미드로 전기천공하고 콜로니를 계수했습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
변환 성장 조건
L. 루테리는 공기에 내성이 있으며 정상적인 대기 조건에서 국물과 한천으로 자랄 수 있습니다. 그러나 형질전환 성공은 도금 시 혐기성 성장 환경의 생성에 크게 의존합니다. 아마도 변환 성공을위한 가장 중요한 조건 일 것입니다. O2 누출은 형질전환되지 않은 L. 루테리의 플레이트를 포함시킴으로써 검출될 수 있다. 콜로니 형태는 산소의 존재 하에서 눈에 띄게 변화합니다 (그림 2 참조). 또는 혐기성 지표를 사용할 수 있습니다 (재료 표 참조).
그림 2: L. 루테리 군체 형태. 콜로니는 pTRKH3_mCherry2 플라스미드로 형질전환되었습니다. (A) 낮은 O2 조건이 정확하지 않으면 콜로니가 흰색, 불투명, 매끄럽고 둥글고 볼록하고 광택이 있는 것처럼 보입니다. (B) 부분적 또는 새는 O2 조건 하에서, 콜로니는 흰색, 불투명, 물결 모양 (물결 모양), 둥글고, 배꼽 모양 (둥근 / 뾰족한) 및 광택으로 보입니다. (C) 대기 중O2 수준에서 플라스미드 형질전환이 없는 L. 루테리 콜로니. 식민지는 불투명하거나 반투명하고 umbonate 또는 flat으로 보입니다. 그들은 항상 엽상, 둥글고 건조한 것처럼 보입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
리포터 단백질 측정
야생형 L. 루테리 DSM20016 리포터 단백질 발현 및 성장은 콜로니마다 다르기 때문에( 그림 3A 참조) 시스템 활성에 대한 정확한 추론이 어렵습니다. 올바르게 형질전환된 야생형 L. 루테리 DSM20016를 선택하고 치료할 수 있습니다. 재형질전환은 돌연변이가 있는 균주를 생성하여 형질전환 효율을 높일 수 있습니다. 이 방법을 통해 개발된 한 균주는 리포터 단백질 발현 측면에서 훨씬 더 안정적인 것으로 나타났습니다( 그림 3B 참조). 조정된 단백질 발현을 필요로 하는 작업을 수행하기 전에 플라스미드 경화 및 재형질전환을 통해 이러한 돌연변이를 찾는 것이 좋습니다.
그림 3: 형질전환된 L. 루테리에 대한 성장, 리포터 형광 및 콜로니 PCR 결과. 두 실험 모두 80 nM에서 pTRKH3_mCherry2 플라스미드를 사용한다. (ᄀ,ᄂ) 3개의 서브플롯 각각에 걸친 각 컬럼은 동일한 콜로니의 OD 값, 형광 값(예: 589nm; Em: 610 nm) 및 PCR 결과(고체 블록은 정확한 밴드가 관찰됨을 나타냄). (A) L. reuteri 의 모든 콜로니는 형질전환DSM20016 선택되었습니다(대조군 형질전환 = 제로 콜로니). 콜로니는 이득 100에서 측정하기 전에 24시간 동안 여과된 MRS 브로스에서 인큐베이션되었습니다. (B) L. reuteri DSM20016 균주에서 채취한 총 88개의 콜로니는 더 높은 형질전환 효율, 더 일관된 리포터 단백질 생산 및 더 낮은 PCR 억제(대조군 형질전환 = 제로 콜로니)를 위해 선택되었습니다. 콜로니는 이득 200에서 측정하기 전에 24시간 동안 여과된 MRS 브로스에서 배양되었습니다. 대조군은 파란색, C = 비형질전환 DSM20016 세포 대조군, M = 여과된 MRS 브로스만 배지 대조군, 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
콜로니 PCR
콜로니 PCR은 샘플을 희석하고 냉장 보관하는 경우에도 신뢰할 수 없기 때문에 올바른 형질전환을 추론하는 유일한 수단으로 사용해서는 안 됩니다( 그림 4 참조). 형질전환에 포함된 플라스미드 무함유 대조군이 콜로니가 0인 경우, 이는 모든 콜로니가 항생제 내성을 지닌 플라스미드를 갖는다는 것을 의미합니다. 그러나 콜로니 PCR이 필요한 경우 여기에 명시된 최적화된 조건이 성공을 크게 높일 수 있습니다.
그림 4: 형질전환된 L. 루테리의 콜로니 PCR. (A) L. 루테리 DSM20016 콜로니는 양성 PCR 밴드에 대해 스크리닝되었습니다. 6개를 얻어 신선한 고압증기멸균 MRS 브로스에 접종하였다. 접종 후 다양한 시점에서 채취한 5 μL의 샘플을 지시된 희석 수준에서 다시 PCR을 실시하였다. 각 시간/희석 상자의 색상은 PCR 회수의 성공을 나타냅니다: 녹색 = 올바른 밴드 관찰; 빨간색 = 관찰된 밴드가 없습니다. (B) 고정된 100x 희석에 대한 결과는 준비 온도를 변화시키면 PCR 성공률이 다르다는 것을 보여준다: 샘플을 얼음 상에서 즉시 제조하고 PCR-ed(89.77%), 실온에서 준비하고 PCR-ed(75%), 또는 RT에서 준비한 후 PCR 전에 30분 동안 37°C에서 배양(27.27%). (C) (1) 8개의 양성 100x 희석 샘플(R1-8)을 RT 조건에서. (2) 48시간 동안 RT에 방치한 후, 샘플을 두 번째로 PCR-ed하여 ~1.1kb에서 밴드가 없음을 보여주었습니다. 양성 및 음성 대조군(레인 +/-)은 C (2)에서 가장 오른쪽 레인입니다. 사용된 사다리는 1kb에 재료 표에 나열된 DNA 사다리에 더한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
L. 루테리 미니 프렙
L. 루테리에 대한 미니-프렙은 제한적이며, 대체 플라스미드 형질전환 확인 방법으로만 사용됩니다. 이전 간행물에서는 일부 균주가 mutanolysin22에 의해 더 효과적으로 용해된다고 언급했습니다. 이중 리소자임-무타놀리신 작용은 L. 루테리 DSM20016에 가장 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 아가로스 겔을 통해 미니 프렙 용출액을 실행하면 관찰 가능한 밴드가 아닌 도말이 발생합니다. 그러나 후속 PCR은 예상되는 밴드 크기를 생성해야 합니다(그림 5 참조).
그림 5: PCR 및 mini-prep 제품의 아가로스 겔 전기영동. 그림 4A 의 동일한 6개 콜로니는 이 논문에 제시된 프로토콜을 사용하여 미니 프렙되었습니다. (아랫줄) 미니-프렙 용출액에 얼룩이 보인다. (맨 윗줄) DNA 주형으로 용리액을 사용하여 PCR을 수행한 후, 명확한 양성 밴드가 관찰된다. 사용된 사다리는 1kb에 재료 표에 나열된 DNA 사다리에 더한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: pNZ123 플라스미드를 사용한 L. 루테리 DSM20016의 형질전환 효율. pNZ123(pSH71 롤링 서클 기원)으로 수행된 형질전환은 외인성 구성 리포터 단백질을 운반하지 않습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 혐기성 챔버용 CAD 파일. 시트 1: 기본 도면; 시트 2: 긴 벽 도면; 시트 3 : 작은 벽 그림; 시트 4: 상단 도면; 시트 5: 뚜껑 도면; 시트 6: 잠금 립 드로잉; 시트 7: 클램프 바 도면; 시트 8: 클램프 플레이트 도면; 시트 9: 조립 개요; 시트 10: 번호가 매겨진 부품이 있는 개요. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L. 루테리 DSM20016의 형질전환을 위한 가장 중요한 단계는 형질전환이 도금된 후 혐기성 성장 조건의 생성입니다. 호기성 조건에서 얻은 콜로니는 매우 가끔씩만 발생하며 일반적으로 MRS 국물에 접종하면 성장하지 않습니다. 콜로니 성장 가능성을 최대화하기 위해 전체 회수량을 도금하는 것도 연습해야 합니다. 이 두 가지 중요한 단계에도 불구하고, 형질전환 효율은 여전히 실험의 한계이며, 형질전환 중에 예상되는 콜로니가 플레이트당 1개 또는 2개로 낮아질 수 있습니다(그림 1 참조).
상업용 식품 용기가 초기에 사용되었고, 일관된O2 배제를 위해 불충분한 것으로 밝혀졌다. 대학의 기계 공장에서 설계한 혐기성 챔버의 CAD 파일은 보충 파일 1에서 찾을 수 있습니다. 이 상자는 때때로 가구의 작은 틈을 통해 공기가 침투할 수 있으므로 처음 사용하기 전에 누출이 있는지 확인하기 위해 물(밀봉되지 않은)을 채우는 것이 좋습니다. 후속 검사는 일반적으로 필요하지 않습니다. 이 상자에는 가압 테스트를 거치지 않았기 때문에 O2 격리 시스템이 아닌 O2 교체 시스템이 있어야 합니다.
미디어 문제가 발생할 수 있습니다. 오토클레이브 MRS 브로스는 선택적이지만 높은 자동 형광 특성을 가지고 있어 낮은 형광 판독값의 측정을 방해합니다. 필터 멸균 MRS 국물을 사용하도록 수정하면 이 문제가 개선되지만 덜 선택적입니다. L. 루테리 는 24시간 후에 배지의 pH를 약 pH 4로 낮추므로( 그림 6 참조) 배지는 산에 민감한 GFP23을 검출하기 위해 완충이 필요합니다. 대신 내산성 mCherry2를 사용하여 이 문제를 방지하도록 이 프로토콜을 수정했습니다.
그림 6: MRS 배양액에서 L. 루테리의 시간 경과에 따른 pH. L. 루테리 DSM20016 시간이 지남에 따라 pH를 낮춥니다(점선). pKa 값은 리포터 단백질 형광이 산도(수평선)로 인해 최대값의 50%가 되는 pH를 나타냅니다. EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4.3, mCherry2 pKa = 3.3. 각 리포터 단백질은 점점 더 산성화되는 L. 루테리(수직선) 내에서 생성될 때 산성 민감성으로 인해 서로 다른 시점에서 최대 형광의 50%까지 리포터 효과가 감소합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
L. 루테리 DSM20016 콜로니 PCR 노력을 억제하는 것으로 보이며, 이 절차의 유용성을 심각하게 제한합니다. 4.3단계 후 37°C에서 30분만 투자하면 PCR 실패율이 증가할 수 있는 반면, RT에서 48시간 정도면 완전한 PCR 실패가 발생합니다( 그림 4B, C 참조). 샘플을 희석하고 샘플을 항상 얼음 위에 보관하는 변형은 콜로니 PCR 성공을 높이는 데 중요합니다.
L. reuteri DSM20016의 내부 기능에 대해서는 아직 많이 알려지지 않았습니다. 전기천공 동안 플라스미드가 첨가되지 않고 콜로니가 0인 형질전환 제어 플레이트는 플라스미드 조건에 존재하는 모든 콜로니가 플라스미드를 보유함을 의미해야 합니다. 그러나 후속 콜로니 PCR은 변형이 있더라도 플라스미드 흡수를 확실하게 확인하지 못하는 것으로 나타났습니다. 이는 PCR DNA 단편을 분해하는 제한 엔도뉴클레아제 때문일 수 있습니다. 엔도뉴클레아제는 다른 락토바실라과(Lactobacillaceae) 종에서 발생했으며 dam-/dcm-E.coli 19,20을 사용하여 극복했습니다. L. 루테리 DSM20016에는 계산 분석을 통해 주석이 달린 몇 가지 추정 제한 변형 효소가 있습니다24. DSM20016의 형질전환 효율은 제한 변형(RM) 효소 인식 부위를 특성화하고 피할 수 있다면 잠재적으로 더 높아질 수 있습니다. 추가 조사가 필요합니다.
이 논문에 제시된 수정된 전기천공 방법은 이전에 Ahrne et al.이 L. reuteri DSM20016에 대해 설명한 방법에 대한 덜 복잡하고 현대적인 대안을 제공합니다.25. 이 논문은 확증되지 않은 플라스미드 흡수를 위한 댐-/dcm- 메틸화 요구 사항에 관한 Ahrne et al.의 중요한 규정을 조사합니다. 이 논문에 제시된 형질전환 방법은 또한 Ahrne et al.에 의해 명시적으로 전달되지 않은 도금 후 중요한 혐기성 성장 요구 사항을 강조합니다.
본원에 제시된 일부 방법 및 접근법은 다른 락토바실라과(Lactobacillaceae ) 계열 조작 시도, 특히 형질전환 제어 플레이트의 포함, 내산성 리포터 mCherry2의 사용, 콜로니 PCR 온도 요구 사항 및 미니-프렙 뮤타놀리신 포함을 돕기 위해 향후 적용에 사용될 수 있습니다. 그러나 일부는 다른 균주에서 최적으로 작동하기 위해 여전히 수정이 필요할 수 있습니다.
L. 루테리 DSM20016은 일반적인 척추동물 공생(가축 사료의 첨가제로 사용될 가능성이 있음)일 뿐만 아니라 인간의장내 환경과 본질적으로 관련된 극소수의 락토바실라과(Lactobacillaceae) 계통 균주 중 하나이기 때문에 임상적, 농업적으로 중요하다8. 이 미생물의 효율적인 조작은 위장관 내에서 새로운 치료법의 미래 전달과 염증 상태의 비침습적 모니터링을 위한 섀시로 개방될 것입니다. 이 기사에서 이러한 방법은 명시적으로 대조되었으며 특히 비모델 L. 루테리 균주 DSM20016에 대한 수정을 통해 집합적으로 입증되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
이해 상충이 존재하지 않습니다.
Acknowledgments
L. 루테리 ATCC PTA 6475 사용에 대한 지침을 통해 여기에 설명된 방법의 기초를 제공한 J.P. van Pijkeren 교수(University of Wisconsin-Madison)의 귀중한 조언에 깊은 감사를 드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
References
- Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
- Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
- Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
- Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
- Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
- Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
- Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
- Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
- Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F.
- Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
- Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
- Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
- MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
- Oh, J. H., van Pijkeren, J. P.
- Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
- Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
- Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
- Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
- Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M.
- Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
- Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
- O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
- Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, Database issue D298-D299 (2015).
- Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).
