Summary
ここでは、 Limosilactobacillus reuteri DSM20016を使用するためのプロトコル、増殖、プラスミド形質転換、コロニーPCR、蛍光レポータータンパク質測定、および限定的なプラスミドミニプレップ、および一般的な問題とトラブルシューティングについて詳しく説明します。これらのプロトコルにより、DSM20016中のレポータータンパク質の測定、またはレポーターが関与しない場合はコロニーPCR による 確認が可能になります。
Abstract
Lactobacillus は、261種からなる信じられないほど大きく多様な細菌属であり、そのうちのいくつかは、胃腸管内の合成生物学的努力のシャーシとして使用する可能性のある共生株でした。属内で観察された幅広い表現型と遺伝子型の多様性は、最近の再分類と23の新規属の導入につながりました。
古い属内のバリエーションの幅が広いため、あるメンバーで示されたプロトコルは、他のメンバーと宣伝されているように機能しない場合があります。特定の菌株を正確に操作する方法に関する一元化された情報の欠如は、しばしば他の細菌ファミリーから適応されたさまざまな アドホック アプローチにつながりました。これは、どの情報が選択した株に適用されるか、または適用されないかを知らない可能性のある、この分野に参入する研究者にとって問題を複雑にする可能性があります。
この論文では、特に Limosilactobacillus reuteri 株指定F275(その他のコレクション番号:DSM20016、ATCC23272、CIP109823)で、成功が実証された一連のプロトコルを、トラブルシューティングのアドバイスと発生する可能性のある一般的な問題とともに一元化することを目指しています。これらのプロトコルにより、 L. reuteri DSM20016を使用した経験がほとんどまたはまったくない研究者でも、プラスミドの形質転換、形質転換の確認、およびレポータータンパク質 を介した プレートリーダーでのシステムフィードバックの測定が可能になります。
Introduction
ラクトバチルス属は歴史的に、グラム陽性、棒状、非胞子形成、通性嫌気性菌または糖を分解して主に乳酸を生成する微好気性菌のいずれかに分類されていました1。これらの緩い基準により、ラクトバチルスは表現型的にも遺伝子型的にも非常に多様な属になりました。この大まかな分類により、属は再分類され、2020年に23の新規属が導入されました2。
古くてより広い属には、一般的に消費に安全であると考えられている主要な共生種とプロバイオティクス種(GRAS)が含まれていました3。乳酸菌科は、さまざまな菌株の消費によってもたらされる多くの報告された健康上の利点により、「善玉菌」であるという一般の認識を維持しています4,5,6,7。彼らが胃腸管をナビゲートできることの容易さ8と彼らの一般の受け入れは、Lactobacillaceae株を摂取可能な薬用、治療、または診断アプリケーションのためのシャーシ生物としての強力な候補として位置付けるために組み合わされます。
ラクトバチルス科内に存在する幅広い特性は、事実上のモデル生物株が存在しない状況につながっています。研究グループは、特定の目的に最も関連する特性を持つ種を選択する傾向がありました。(例えば、酪農発酵ラボでは L. lactis、野菜発酵の研究では L. plantarum 、プロバイオティクスの研究では L. acidophilus などが考えられます。
種間のこの同じ幅広い特性は、 Lactobacillaceae科 の1つのサブセットではうまく機能するかもしれないが、他のサブセットで効率的に機能するために(またはおそらくまったく機能するために)最適化を必要とするプロトコルと手順の蓄積につながりました9。家族間、そして同じ種のメンバー内でさえも最適化のこの必要性は、なじみのない研究者の努力を挫折させる可能性があります。論文のメソッドセクションに掲載されたプロトコルは、それら自身の修正10を含むこともでき、断片化された分散型プロトコルコレクションにつながる。
L. reuteriは広く脊椎動物の共生動物と考えられており、哺乳類、鳥類11および魚類12の胃腸(GI)管で一貫して見られます。L. reuteri亜株は、粘液接着タンパク質の適応を介して、特定の天然宿主により恒久的にコロニーを形成するために遺伝的に特殊化されることがよくあります8,11,13。消化管リモシラクトバチルス種は、天然宿主以外の宿主で分離することができますが、一過性の性質に向かう傾向があります8。
ヒトと宿主の特殊化により、 L. reuteri DSM20016は、ヒト消化管の任意の時点で診断または治療アプリケーションのためのシャーシとしての地位を非常によく位置付けており、より一時的な株と比較して、DSM20016株は介入の効果のより長い持続性ウィンドウを提供する可能性があります。
この論文では、 Limosilactobacillus reuteri (菌株名:F275、その他の収集番号:DSM20016、ATCC23272、CIP109823)で有効性が実証された一連のプロトコルの概要と、分子生物学およびシステム生物学のアプリケーションを支援するために、他のソースからの菌株に関する一元化された情報について説明します。ここに記載されている手順は、 L. reuteriの培養、電気コンピテントストックの作成、形質転換コロニーの選択、コロニーポリメラーゼ連鎖反応(PCR) による 形質転換の確認、および蛍光レポータータンパク質 を介した 設計されたシステム応答の測定を可能にするはずです。
関連するプロトコルは、L. reuteri (株: ATCC-PTA-6475)14 における CRISPR-Cas9 支援 ssDNA ゲノム再構成、および複数の非 L. ロイテリにおける CRSIPR-Cas9 ニッカーゼ支援ゲノム編集をカバーしていることに注目する。 ロイテリ、ラクトバチルス科の染色15,16;ただし、これらは、ここで焦点を当てているL.ロイテリDSM20016株には対応していません。
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Protocol
1. L. ロイテリDSM20016 エレクトロコンピテントセルの作製
注:これはBerthierらによるプロトコルに基づいています17、遠心分離速度はRattanachaikunsoponらによって知らされています。18.
- 50 mL 遠心チューブで、グリセロールストックから L. ロイテリ を 6 mL のデマンロゴサシャープ(MRS)ブロスに接種します。静的インキュベーター内で37°Cで一晩好気的にインキュベートします。
- 翌朝、一晩培養した4 mLをMRSブロス200 mL(1:50希釈)に接種します。
- 600 nmの光学密度値(OD600)が0.5〜0.85に達するまで、静的な37°Cインキュベーターで好気的に成長させます。これには約2〜3時間かかります。
- 適切なOD600値に達したらすぐに、培地を50 mLの遠沈管にデカントし、管のバランスを取りながら氷上に置きます。
- 予冷した4°Cの遠心分離機で5,000 x g で5分間遠心分離します。
- 上清を捨て、各ペレットを予め冷却した(0°C〜4°C)ddH2Oの50mLに再懸濁し、前の工程と同じ設定で再度遠心分離する。細胞をできるだけ氷の上に保ちます。
- 手順 1.6 を繰り返します。
- 各ペレットを25mLのddH2O:0.5Mスクロース、10%グリセロールに再懸濁する。5,000 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。上清を捨て、細胞を氷の上に戻します。
- 全てのペレットを同じ2mLのddH2O:0.5Mスクロース、10%グリセロールに再懸濁する。
- 予冷した微量遠心チューブで50 μLから100 μLの部分に分注します。後で使用するために-80°Cで保管してください。
2. ロイテリのエレクトロポレーション
注: 次の手順では、ピペッティングをできるだけ避けてください。プラスミドを添加していないコントロールエレクトロポレーションを含めることは、抗生物質の選択が適切であることを確認することをお勧めします。
- 電気能力のある L.ロイテリ アリコート全体を取り、氷上で解凍します。
- 5 μLから10 μLのプラスミド(最終プラスミド濃度>6 nM)を解凍したアリコートに穏やかに混合し、ピペッティングをできるだけ避けます。
- 氷冷した1mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに移します。
- 1.25 kV、400 Ω、および25 μFでエレクトロポレートします。
- 室温(RT)MRSブロス1 mLを加え、キュベットを1回または2回反転させて混合します。
- キュベットを37°Cの静的インキュベーターに2.5〜3時間入れて、回復させます。
- 適切な選択で複数のMRS寒天プレートに全量をプレートします。
- プレートを、小さな火のともったろうそく(「ティーライト」)と嫌気性雰囲気を生成する小袋を備えた完全に気密な容器に入れます。
- 37°Cで2〜3日間、または目に見えるコロニーが存在するまで成長させます。
3. 耐酸性蛍光レポータータンパク質mCherry2の測定
- 測定に必要なコロニーを選択し、1ウェルあたり1.5 mLのフィルター滅菌(非オートクレーブ)MRSブロスと適切な選択抗生物質を96ウェル保存マイクロプレートに接種します。
- 振とうせずに37°Cで24時間好気的に一晩インキュベートします。
注意: この保存マイクロプレートは、セクション4(コロニーPCR)で使用するために保管する必要があります。 - L. reuteri は、固定期にあるときに培地から沈殿します。ピペッティング を介して 一晩培養を再懸濁します。
- 200 μLを平坦で底の透明な96ウェルプレートに移し、プレートリーダーに移し、mCherry2(励起[例]:589 nm、発光[Em]:610 nm)またはその他の関連するレポーターのODと蛍光を測定します。
4. コロニーPCR による プラスミド取り込みの確認
- セクション3の96ウェル保存用マイクロプレートから、5 μLをPCRチューブに移します。
注:>5分が経過した場合は、 L.ロイテリ をもう一度再懸濁する必要がある場合があります。 - ポータブルベンチトップマイクロ遠心分離機で、ペレットが見えるまでスピンダウンし(2,000 x gで約2分間)、上清を廃棄し、ペレットを20 μLの20 mM NaOHに再懸濁します。
- 95°Cで5分間煮沸し、ボルテックスし、もう一度沸騰させます。
- すぐにサンプルを冷やします。以下の手順では、テンプレートの分解とPCR阻害の可能性を下げるために、サンプルをできるだけ氷上に保つようにしてください。
- ポータブルベンチトップマイクロ遠心機で2,000 x g で細胞破片がペレットになるまで2分間スピンダウンし、次に1 μLの上清を取り、99 μLの氷冷DNaseおよびRNaseを含まないddH2O(100倍希釈)に希釈します。
- プラスミド特異的プライマーを用いた標準的なPCR反応では、鋳型DNAとして100倍希釈を使用します。 大腸菌 ミニプレップ由来のプラスミドを有するポジティブコントロールを含む。
- サンプルを氷上に戻し、適切なローディング染料を1倍の濃度で加えます。
- 1%アガロースゲルをTAEバッファー(トリス酢酸エチレンジアミン四酢酸[EDTA])中で110 Vで30分間分析します。必要に応じて画像。
5. L. reuteri のミニ分取プロトコルとそれに続く PCR によるプラスミドの存在の確認
メモ: 材料表に記載されているミニ準備キットで使用することを目的としたプロトコル。
- 適切な抗生物質を含むMRSブロス10 mLに L. reuteri を接種し、静的インキュベーター内で37°Cで一晩好気的にインキュベートします。
- あらかじめ冷却した4°Cの遠心分離機で5,000 x g で10分間遠心分離します。
- 後のステップを妨げる可能性のある酸性度を無効にするために、ペレットを2 mLの標準P1バッファー(キットに付属)で洗浄し、前述と同じ設定で遠心分離し、上清を廃棄します。
- 細菌細胞を溶解するために、10 mg/mLリゾチームと100 U/mLムタノリシンを含む250 μLの改変P1バッファーにペレットを再懸濁します。37°Cで1〜2時間インキュベートします。
- 250 μLのバッファーP2を加え、4〜6回反転させて混合し、RTで5分以内インキュベートします。
- 350 μLのバッファーN3(キットに付属)を加え、すぐに4〜6回穏やかに反転させて混合します。
- 10,000 x g で10分間遠心分離します。
- できるだけ多くの上清をスピンカラムに移し、10,000 x g で60秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
- スピンカラムを500 μLのバッファーPB(キットに付属)で洗浄し、10,000 x g で60秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。
- スピンカラムを750 μLのバッファーPE(キットに付属)で洗浄し、10,000 x g で60秒間遠心分離します。フロースルーを廃棄し、60秒間遠心分離して、残留バッファーを除去します。
- スピンカラムを1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。20〜30 μLのDNAaseおよびRNAseを含まないddH 2 Oをスピンカラムのフィルターに塗布し、1〜2分間放置してから、10,000 x g で60秒間遠心分離します。
- プラスミド特異的プライマー(pTRKH3_pTUSeq_F:CACCCGTTCTCGGAGCA、pTRKH3_pTUSeq_R:CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA)を用いて標準的なPCR反応を行い、溶出液から鋳型DNAを提供します。 大腸菌 ミニプレップ由来のプラスミドを有するポジティブコントロールを含む。
注:この研究で使用されたPCR設定は、98°Cで5分間、(98°Cで30秒間、55°Cで30秒間、72°Cで45秒間)30サイクル、72°Cで2分間、4°Cホールドです。パラメータは、使用するポリメラーゼ、フラグメント長、およびこのプロトコルを利用する人が使用する正確なプライマーに大きく依存します。
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Representative Results
トランスフォーメーションの効率化
L. reuteriは、他のラクトバチルス科19,20で観察されるようなdcm-/dam-非メチル化プラスミドを必要としません(図1を参照)。10 μLの8.5 kbプラスミドpTRKH3_mCherry2(pAMβ1シータ複製起点)を用いたL. reuteri DSM20016のエレクトロポレーションは、プラスミドメチル化条件に関係なく、約80コロニー形成単位(CFU)/μg(200 μLメッキあたり5〜8コロニー)の形質転換効率をもたらすはずです。選択的硬化と再形質転換により、約4 x 103 CFU/μg(200 μLあたり200-250コロニー)のpTRKH3_mCherry2で観察された、はるかに高い形質転換効率21を持つ変異L. reuteri株を得ることができ、より高いスループットのアプリケーションが可能になります。同様の結果は、レポーターmTFP1についても観察された。また、外因性の構成的レポータータンパク質を持たないpNZ123(pSH71ローリングサークル起点)でも形質転換を行い、3 x 104 CFU/μg DNAの形質転換効率を達成しました(補足図1)。
図1:エレクトロポレーション効率。合計10 nM pTRKH3_mTFP1および80 nM pTRKH3_mCherry2プラスミドストックを、DH10β大腸菌およびdcm-/dam-メチラーゼノックアウト大腸菌の2つの供給源から取得しました。次に、L. reuteriを2つの異なるメチル化パターンプラスミド10 μLでエレクトロポレーションし、コロニーをカウントしました。エラーバーは標準偏差を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
形質転換成長条件
L. reuteri は耐空性があり、通常の大気条件下ではブロスおよび寒天で増殖させることができます。ただし、形質転換の成功は、プレーティング時の嫌気性成長環境の生成に大きく依存します。これはおそらく、変革を成功させるための最も重要な条件です。O2 漏出は、形質転換 されていないL. reuteriのプレートを含むことによって検出することができる。コロニーの形態は、酸素の存在下で著しく変化します( 図2を参照)。あるいは、嫌気性指示薬を使用することができる( 材料表参照)。
図2:L. reuteriコロニーの形態。 コロニーはpTRKH3_mCherry2プラスミドで形質転換した。(A)低O2条件を不正確にすると、コロニーは白く、不透明で、滑らかで、丸く、凸状で、光沢があります。(B)部分的または漏れのあるO2条件下では、コロニーは白く、不透明で、うねり(波状)、丸く、臍帯(丸みを帯びた/こぶのある)、および光沢があります。(c)大気圧O2レベル下でプラスミド形質転換を伴わないL.ロイテリコロニー。コロニーは不透明または半透明のいずれかに見え、臍状または平らのいずれかです。それらは常に葉状で、丸く、乾燥しているように見えます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
レポータータンパク質測定
野生型 L. reuteri DSM20016レポータータンパク質の発現と増殖はコロニー間で異なるため( 図3Aを参照)、システム活性の正確な推定が困難になっています。正しく形質転換された野生型 L. reuteri DSM20016を選択して治癒することが可能である。再形質転換は、より高い形質転換効率を可能にする突然変異を有する株を生じさせる可能性がある。 この方法で 開発された1つの株は、レポータータンパク質発現の点ではるかに安定しているように見えました( 図3Bを参照)。このような変異は、調整されたタンパク質発現を必要とする作業を行う前に、プラスミドの硬化および再形質転換 を介して 探すことをお勧めします。
図3:形質転換L.ロイテリの成長、レポーター蛍光、およびコロニーPCRの結果。 どちらの実験もpTRKH3_mCherry2 80 nMのプラスミドを使用します。(A,B)3つのサブプロットのそれぞれにわたる各列は、同じコロニーのOD値、蛍光値(例:589 nm;Em:610 nm)、PCR結果(固体ブロックは正しいバンドが観察されたことを示す)。(a)L. reuteri DSM20016形質転換から全コロニーを摘み取った(コントロール形質転換=ゼロコロニー)。コロニーを濾過MRSブロス中で24時間インキュベートした後、ゲイン100で測定した。(B)L. reuteri DSM20016株から選択した合計88コロニーは、形質転換効率が高く、レポータータンパク質産生の一貫性が高く、PCR阻害が低い(コントロール形質転換=ゼロコロニー)。コロニーを濾過MRSブロス中で24時間インキュベートした後、ゲイン200で測定した。コントロールは青色、C = 非形質転換DSM20016細胞コントロール、M = ろ過MRSブロスのみの培地コントロール、エラーバーは標準偏差を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
コロニーPCR法
コロニーPCRは、サンプルを希釈して冷やしても信頼性が低い可能性があるため、正しい形質転換を推測する唯一の手段として使用しないでください( 図4を参照)。形質転換に含まれるプラスミドなしコントロールがゼロコロニーを示す場合、それはすべてのコロニーが抗生物質耐性を有するプラスミドを有することを意味する。ただし、コロニーPCRが必要な場合は、ここに記載されている最適化された条件により、成功を大幅に高めることができます。
図4:形質転換 L.ロイテリのコロニーPCR。 (A) L.ロイテリ DSM20016コロニーを陽性のPCRバンドについてスクリーニングした。6つが得られ、新鮮なオートクレーブ処理されたMRSブロスに接種された。接種後のさまざまな時点で採取した5 μLのサンプルを、示された希釈レベルで再度PCRにかけました。各時間/希釈ボックスの色は、PCR回収の成功を示します:緑=観察された正しいバンド。赤 = バンドは観察されません。(B)固定100倍希釈の結果は、調製温度を変化させることでPCRの成功率が異なることを示しています:サンプルを氷上で調製し、すぐにPCRする(89.77%)、室温で調製してすぐにPCRする(75%)、またはRTで調製し、PCRの前に30分間37°Cでインキュベートする(27.27%)。(C)(1)RT条件からの8つの陽性100倍希釈サンプル(R1-8)。(2)RTで48時間放置した後、サンプルを2回PCRしたところ、~1.1kbでバンドがないことが示されました。ポジティブコントロールとネガティブコントロール(レーン+/-)は、 C (2)の右端のレーンです。使用したラダーは、 材料表に記載されている1kbとDNAラダーを加えたものでした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
L. ロイテリ ミニプレップ
L. reuteriのミニ分取は限定的であり、代替のプラスミド形質転換確認法としてのみ意図されています。以前の出版物では、いくつかの株はムタノリシン22によってより効果的に溶解されることが指摘されています。リゾチーム-ムタノリシンの二重作用がL. reuteri DSM20016に最も有効であることが分かった。ミニ分取溶出液をアガロースゲルに通すと、観察可能なバンドではなく塗抹標本が得られます。ただし、その後のPCRでは、予想されるバンドサイズが生成されるはずです(図5を参照)。
図5:PCRおよびミニ分取産物のアガロースゲル電気泳動。図4Aと同じ6つのコロニーを、この論文に記載されているプロトコルを使用してミニ調製した。(下段)ミニ分取溶出液は塗抹標本を示します。(上段)溶離液をDNA鋳型としてPCRを行った後、明瞭な陽性バンドが観察される。使用したラダーは、材料表に記載されている1kbとDNAラダーを加えたものでした。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:pNZ123プラスミドによるL.ロイテリDSM20016の形質転換効率。 形質転換はpNZ123(pSH71ローリングサークル起源)を用いて行い、外因性の構成的レポータータンパク質を担持しなかった。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:嫌気性チャンバーのCADファイル。 シート1:基本図面。シート2:長い壁画;シート3:小さな壁画。シート4:トップ図面;シート5:蓋の描画;シート6:リップ描画をロックします。シート7:クランプバーの描画;シート8:クランププレートの描画;シート9:アセンブリの概要。シート 10: 番号付き部品の概要。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
L. reuteri DSM20016の形質転換のための最も重要なステップは、形質転換がプレーティングされた後の嫌気性増殖条件の生成である。好気性条件で得られたコロニーはごくまれにしかなく、MRSブロスに接種すると一般に成長しません。コロニーの成長の可能性を最大化するために、回収量全体をプレーティングすることも実施する必要があります。これらの2つの重要なステップがあっても、形質転換中に予想されるコロニーの数がプレートあたり1つまたは2つまで少なくなる可能性があるため、形質転換効率は依然として実験の限界です(図1を参照)。
市販の食品容器が最初に使用され、一貫したO2排除には不十分であることが判明した。大学の機械工場が設計した嫌気性チャンバーのCADファイルは、補足ファイル1にあります。これらの箱は建具の小さな隙間から空気が浸透することがあるため、最初に使用する前に漏れがないか確認するために、水(密封されていない)で満たすことをお勧めします。通常、後続のチェックは必要ありません。これらのボックスには、加圧についてテストされていないため、O2隔離システムではなく、O2置換システムが必要です。
メディアの問題が発生する可能性があります。オートクレーブ処理されたMRSブロスは選択的ですが、高い自己蛍光特性を有し、低蛍光測定値の測定を妨げます。フィルター滅菌MRSブロスを使用するための変更は、この問題を改善しますが、選択性は低くなります。 L. reuteri は24時間後に培地のpHをpH 4付近に低下させるため( 図6を参照)、培地は酸感受性GFP23を検出するために緩衝剤を必要とします。この問題を回避し、代わりにより耐酸性のmCherry2を使用するようにこのプロトコルを変更しました。
図6:MRSブロス中の L.ロイテリ の経時的なpH。 L.ロイテリ DSM20016は経時的にpHを低下させる(破線);pKa値は、レポータータンパク質の蛍光が酸性度のために最大値の50%になるpHを示します(水平線)。EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4.3, mCherry2 pKa = 3.3.各レポータータンパク質は、酸性度が増す L. reuteri (縦線)内で産生される場合の酸感受性により、異なる時点で最大蛍光の50%にレポーター効果が低下します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
L. ロイテリ DSM20016コロニーPCRの努力を阻害し、この手順の有用性を著しく制限しているようです。ステップ4.3の後、37°Cでわずか30分でPCR失敗率を高めることができますが、RTで48時間でPCRが完全に失敗します( 図4B、Cを参照)。サンプルを希釈し、サンプルを常に氷上に保つための変更は、コロニーPCRの成功率を高めるために重要です。
L. reuteri DSM20016の内部機能については、多くのことがわかっていません。エレクトロポレーション中にプラスミドを添加しず、コロニーがゼロを示す形質転換コントロールプレートは、プラスミド状態に存在するコロニーがプラスミドを保有していることを意味するはずです。しかし、その後のコロニーPCRでは、改変を行ってもプラスミドの取り込みを確実に確認できないことが示されています。これは、制限エンドヌクレアーゼがPCR DNA断片を分解することが原因である可能性があります。エンドヌクレアーゼは他のラクトバチルス科種で遭遇しており、dam-/dcm-E.coli 19,20を使用して克服しています。L. ロイテリDSM20016には、計算分析24によって注釈が付けられたいくつかの推定制限修飾酵素があります。DSM20016の形質転換効率は、その制限修飾(RM)酵素認識部位を特徴付けて回避できれば、さらに高める可能性があります。さらなる調査が必要です。
この論文で述べられている修正エレクトロポレーション法は、AhrneらによってL . reuteri DSM20016について以前に説明した方法に代わる、より複雑ではない、より現代的な代替手段を提供する。25.この論文は、プラスミドの取り込みのためのダム/dcm- メチル化要件に関してAhrneらによってなされた重要な規定を調査しますが、それらは裏付けられていません。この論文に記載されている形質転換法は、メッキ後の重要な嫌気性成長要件も強調しており、Ahrneらによって明示的に伝えられていません。
本明細書に記載されるいくつかの方法およびアプローチは、他の Lactobacillaceae科 の操作の試み、特に形質転換コントロールプレートの包含、耐酸性レポーターmCherry2の使用、コロニーPCR温度要件、およびミニプレップムタノリシン包含を支援するための将来の用途において使用することができる。ただし、他の菌株で最適に機能するように変更が必要な場合もあります。
L. ロイテリDSM20016は、一般的な脊椎動物の共生動物(家畜飼料の添加物としての潜在的な用途)としてだけでなく、ヒトの腸内環境に本質的に関連する非常に少数の乳酸桿菌科株の1つとしても位置付けられているため、臨床的および農業的に重要です8。この微生物の効率的な操作は、消化管内での新しい治療法の将来の提供と炎症状態の非侵襲的モニタリングのためのシャーシとしてそれを開放します。この記事では、これらの方法を明示的に照合し、特に非モデルL.ロイテリ株DSM20016の修正を加えてまとめて実証しました。
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Disclosures
利益相反は存在しません。
Acknowledgments
J.P. van Pijkeren教授(ウィスコンシン大学マディソン校)の貴重なアドバイスには、 L. reuteri ATCC PTA 6475との連携に関するガイダンスが、ここで説明する方法の基礎を提供してくれたことに大いに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
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