Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Методы подтверждения электропорации и трансформации Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65463
Automatic Translation
1, 1
1University of Toronto Mississauga

Summary

Здесь мы представляем протоколы работы с DSM20016 Limosilactobacillus reuteri , подробно описывающие рост, трансформацию плазмиды, ПЦР колоний, измерение флуоресцентного репортерного белка и ограниченную мини-подготовку плазмиды, а также распространенные проблемы и устранение неполадок. Эти протоколы позволяют измерять репортерные белки в DSM20016 или подтверждать с помощью колонии ПЦР, если репортер не участвует.

Abstract

Lactobacillus были невероятно большим, разнообразным родом бактерий, включающим 261 вид, некоторые из которых были комменсальными штаммами с потенциалом для использования в качестве шасси для синтетических биологических исследований в желудочно-кишечном тракте. Широкая фенотипическая и генотипическая изменчивость, наблюдаемая в пределах рода, привела к недавней реклассификации и введению 23 новых родов.

Из-за широты вариаций в старых родах протоколы, продемонстрированные в одном члене, могут не работать так, как рекламируется с другими членами. Отсутствие централизованной информации о том, как именно манипулировать конкретными штаммами, привело к появлению ряда специальных подходов, часто адаптированных из других семейств бактерий. Это может усложнить ситуацию для исследователей, начинающих работать в этой области, которые могут не знать, какая информация относится или не относится к выбранному ими штамму.

В этой статье мы стремимся централизовать набор протоколов с продемонстрированным успехом, в частности, в обозначении штамма Limosilactobacillus reuteri F275 (другие коллекционные номера: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), а также советы по устранению неполадок и общие проблемы, с которыми можно столкнуться. Эти протоколы должны позволить исследователю, практически не имеющему опыта работы с L. reuteri , DSM20016 трансформировать плазмиду, подтверждать трансформацию и измерять обратную связь системы в считывателе планшетов с помощью репортерного белка.

Introduction

Род Lactobacillus исторически классифицировался как грамположительные, палочковидные, неспорообразующие, факультативные анаэробы или микроаэрофилы, которые расщепляют сахара с образованием молочной кислоты1. Эти свободные критерии привели к тому, что Lactobacillus фенотипически и генотипически является чрезвычайно разнообразным родом. Эта широкая категоризация привела к тому, что род был реклассифицирован, и в 2020 году было введено 23 новых рода2.

Старый, более широкий род включал основные комменсальные и пробиотические виды, которые обычно считаются безопасными (GRAS) для потребления3. Семейство Lactobacillaceae поддерживает общественное восприятие как «хороших бактерий» из-за многих сообщений о пользе для здоровья, получаемой за счет потребления различных штаммов4,5,6,7. Легкость, с которой они могут перемещаться по желудочно-кишечному тракту8, и их общественное признание в совокупности позиционируют штаммы Lactobacillaceae как сильных кандидатов в качестве организмов-шасси для приема внутрь в медицинских, терапевтических или диагностических целях.

Широкий спектр характеристик, присутствующих в семействе Lactobacillaceae , привел к ситуации, в которой де-факто нет штамма модельного организма; Исследовательские группы, как правило, отбирают виды со свойствами, наиболее соответствующими их конкретным целям. (Например, лаборатории молочной ферментации могут выбрать L. lactis; исследования ферментации овощей могут выбрать L. plantarum; исследования пробиотиков могут быть сосредоточены на L. acidophilus; и так далее.)

Этот же широкий диапазон характеристик у разных видов привел к накоплению протоколов и процедур, которые могут хорошо работать для одного подмножества семейства Lactobacillaceae , но требуют оптимизации для эффективной работы (или, возможно, для функционирования вообще) в других9. Эта потребность в оптимизации между членами семьи и даже внутри членов одного и того же вида может свести на нет усилия незнакомых исследователей. Протоколы, опубликованные в разделах статей, посвященных методам, могут также включать свои собственные модификации10, что приводит к фрагментированным, децентрализованным коллекциям протоколов.

L. reuteri считается широко распространенным комменсалом позвоночных, постоянно встречающимся в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) млекопитающих,11 птиц ирыб 12. Субштаммы L. reuteri часто генетически специализированы посредством адаптации белка адгезии слизи, чтобы более постоянно колонизировать конкретных местных хозяев 8,11,13. Виды Limosilactobacillus желудочно-кишечного тракта могут быть изолированы у хозяев за пределами их родного хозяина, но больше тяготеют к преходящему характеру8.

Из-за специализации человека и хозяина L. reuteri DSM20016 очень хорошо позиционирует себя в качестве шасси для диагностического или терапевтического применения в любой точке желудочно-кишечного тракта человека, и штамм DSM20016 может обеспечить более длительное окно эффекта для вмешательств по сравнению с более преходящими штаммами.

В этой статье мы описываем ряд протоколов с продемонстрированной эффективностью в отношении Limosilactobacillus reuteri (обозначение штамма: F275; другие коллекционные номера: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), а также централизованную информацию о штамме из других источников, чтобы помочь в приложениях молекулярной и системной биологии. Процедуры, изложенные в настоящем документе, должны позволить исследователю, не имеющему предшествующего опыта, культивировать L. reuteri, создавать электрокомпетентные запасы, отбирать трансформированные колонии, подтверждать трансформацию с помощью колониальной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и измерять сконструированный системный ответ с помощью флуоресцентных репортерных белков.

Мы отмечаем, что соответствующие протоколы охватывали рекомбинацию генома ssDNA с помощью CRISPR-Cas9 у L. reuteri (штамм: ATCC-PTA-6475)14 и редактирование генома с помощью никазы CRSIPR-Cas9 в нескольких не-L. reuteri, окрашивание семейства Lactobacillaceae 15,16; они, однако, не относятся к штамму L. reuteri DSM20016, на котором мы сосредоточены здесь.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка L. reuteri DSM20016 электрокомпетентных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Это основано на протоколе Berthier et al.17 со скоростями центрифугирования, указанными Rattanachaikunsopon et al.18.

  1. В пробирке центрифуги объемом 50 мл инокулируют L. reuteri из запаса глицерина в 6 мл бульона deMan Rogosa Sharpe (MRS). Аэробная инкубация в течение ночи при 37 ° C в статическом инкубаторе.
  2. На следующее утро привите 4 мл ночной культуры в 200 мл бульона MRS (разведение 1:50).
  3. Разрешить аэробный рост в статическом инкубаторе с температурой 37 °C до тех пор, пока значение оптической плотности 600 нм (OD600) не достигнет 0,5-0,85; Это займет примерно 2-3 часа.
  4. Как только будет достигнуто адекватное значение OD600, сцедите среду в центрифужные пробирки объемом 50 мл и поместите на лед, балансируя пробирки.
  5. Центрифуга в течение 5 мин при 5 000 x g в предварительно охлажденной центрифуге с температурой 4 °C.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте каждую гранулу в 50 мл предварительно охлажденного (от 0 ° C до 4 ° C) ddH2O и снова центрифугу с теми же настройками, что и на предыдущем этапе. Держите клетки на льду как можно дольше.
  7. Повторите шаг 1.6.
  8. Ресуспендировать каждую гранулу в 25 мл ddH2O: 0,5 М сахарозы, 10% глицерина. Центрифуга при 5 000 x g при 4 °C в течение 10 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и положите клетки обратно на лед.
  9. Ресуспендируют все гранулы в тех же 2 млddH2O: 0,5 М сахарозы, 10% глицерина.
  10. Аликвоту на порции от 50 мкл до 100 мкл в предварительно охлажденных микроцентрифужных пробирках; хранить при температуре -80 °C для последующего использования.

2. Электропорация L. reuteri

ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пипетирования, насколько это возможно, на следующих шагах. Рекомендуется включить контрольную электропорацию без добавления плазмиды, чтобы обеспечить адекватный выбор антибиотиков.

  1. Возьмите целую электрокомпетентную аликвоту L. reuteri и разморозьте ее на льду.
  2. Аккуратно смешайте от 5 мкл до 10 мкл плазмиды (конечная концентрация плазмиды >6 нМ) с размороженной аликвотой, максимально избегая пипетирования.
  3. Переложите в охлажденную льдом электропорационную кювету с зазором 1 мм.
  4. Электропорат при напряжении 1,25 кВ, 400 Ω и 25 мкФ.
  5. Добавьте 1 мл бульона MRS комнатной температуры (RT) и перемешайте, перевернув кювету один или два раза.
  6. Поместите кюветы в статический инкубатор при температуре 37 °C на 2,5-3 часа, чтобы обеспечить восстановление.
  7. Нанесите все количество на несколько агаровых пластин MRS с соответствующим выбором.
  8. Поместите тарелки в полностью герметичный контейнер с небольшой зажженной свечой («чайным светом») и анаэробным пакетиком, создающим атмосферу.
  9. Выращивайте при 37 ° C в течение 2-3 дней или до появления видимых колоний.

3. Измерение кислотостойкого флуоресцентного репортерного белка mCherry2

  1. Выберите все колонии, необходимые для измерения, и инокулируйте в 96-луночную микропланшет для хранения 1,5 мл стерилизованного фильтром (неавтоклавированного) бульона MRS на лунку и соответствующего антибиотика.
  2. Аэробно инкубировать в течение 24 часов в течение ночи при 37 ° C без встряхивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта микропланшет для хранения должна храниться для использования в разделе 4 (колония ПЦР).
  3. L. reuteri выпадает в осадок из среды в стационарной фазе; Ресуспендировать ночную культуру с помощью пипетки.
  4. Перенесите 200 мкл в плоскую пластину с прозрачным дном и 96 лунками, перенесите пластину на считыватель пластин и измерьте OD и флуоресценцию mCherry2 (возбуждение [Ex]: 589 нм; излучение [Em]: 610 нм) или других соответствующих отчетов.

4. Подтверждение поглощения плазмид с помощью колониальной ПЦР

  1. Из 96-луночной накопительной микропланшетки из секции 3 перенесите 5 мкл в ПЦР-пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По прошествии >5 минуты может потребоваться повторное суспендирование L. reuteri во второй раз.
  2. В портативной настольной микроцентрифуге вращайте до тех пор, пока гранула не станет видимой (примерно 2 минуты при 2,000 x g), выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 20 мкл 20 мМ NaOH.
  3. Кипятить при 95 °C в течение 5 минут, встряхивать, и повторить кипячение второй раз.
  4. Немедленно охладите образцы; постарайтесь как можно дольше держать образцы на льду на следующих этапах, чтобы снизить вероятность деградации шаблона и ингибирования ПЦР.
  5. Вращайте в переносной настольной микроцентрифуге при 2000 x g в течение 2 мин, пока клеточный мусор не будет гранулирован, затем возьмите 1 мкл надосадочной жидкости и разбавьте до 99 мкл ледяного DDH 2 O без ДНКазы и РНКазы (100-кратное разведение).
  6. Используйте 100-кратное разведение в качестве матричной ДНК в стандартной реакции ПЦР с использованием плазмид-специфических праймеров. Включите положительный контроль с плазмидой, полученной из мини-препарата E. coli.
  7. Верните образцы на лед и добавьте соответствующий загрузочный краситель в концентрации 1x.
  8. Запускайте в 1% агарозном геле в буфере TAE (трис-ацетат-этилендиаминтетрауксусная кислота [ЭДТА]) при 110 В в течение 30 мин. Изображение при необходимости.

5. Протокол мини-подготовки для L. reuteri с последующей ПЦР для подтверждения наличия плазмиды

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол предназначен для использования с набором для мини-подготовки, указанным в таблице материалов.

  1. Инокулируют L. reuteri в 10 мл бульона MRS, содержащего соответствующий антибиотик, и инкубируют в течение ночи аэробно при 37 ° C в статическом инкубаторе.
  2. Центрифуга при 5 000 x g в течение 10 мин в предварительно охлажденной центрифуге с температурой 4 °C.
  3. Промойте гранулы в 2 мл стандартного буфера P1 (входит в комплект), чтобы свести на нет кислотность, которая может помешать более поздним этапам, центрифугу с той же настройкой, что и описано ранее, и выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Ресуспендируют гранулу в 250 мкл модифицированного буфера P1, содержащего 10 мг/мл лизоцима и 100 ЕД/мл мутанолизина, для лизиса бактериальных клеток. Выдерживать 1-2 ч при 37 °C.
  5. Добавьте 250 мкл буфера P2, перемешайте, перевернув четыре-шесть раз, и инкубируйте при RT не более 5 минут.
  6. Добавьте 350 мкл буфера N3 (входит в комплект) и сразу же аккуратно переверните четыре-шесть раз, чтобы перемешать.
  7. Центрифуга в дозе 10 000 x g в течение 10 мин.
  8. Перенесите как можно больше надосадочной жидкости в спиновую колонну и центрифугу при 10 000 x g в течение 60 с. Откажитесь от потока.
  9. Промыть отжимную колонну 500 мкл буферного PB (входит в комплект) и центрифугу при 10 000 x g в течение 60 с. Откажитесь от потока.
  10. Промыть отжимную колонну 750 мкл буферного полиэтилена (входит в комплект) и центрифугу при 10 000 x g в течение 60 с. Откажитесь от потока и центрифуги в течение 60 с, чтобы удалить остаточный буфер.
  11. Поместите спиновую колонку в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Нанесите 20-30 мклddH2Oбез ДНК и РНК на фильтр спиновой колонки и оставьте на 1-2 мин перед центрифугированием при 10 000 x g в течение 60 с.
  12. Проведите стандартную реакцию ПЦР с использованием плазмид-специфических праймеров (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA) с элюатом, обеспечивающим матричную ДНК. Включите положительный контроль с плазмидой, полученной из мини-препарата E. coli.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки ПЦР, используемые в этом исследовании: 98 °C в течение 5 мин (98 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 45 с) 30 циклов, 72 °C в течение 2 мин, 4 °C выдержка. Параметры сильно зависят от используемой полимеразы, длины фрагмента и точных праймеров, используемых любым человеком, использующим этот протокол.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эффективность трансформации
L. reuteri не требует dcm-/dam-неметилированной плазмиды, как это наблюдается для других Lactobacillaceae19,20 (см. рис. 1). Электропорация DSM20016 L. reuteri с 10 мкл плазмидного pTRKH3_mCherry2 размером 8,5 кб (тета-происхождение репликации pAMβ1) должна дать эффективность трансформации примерно 80 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мкг (от пяти до восьми колоний на 200 мкл пластины), независимо от условий метилирования плазмиды. При селективном отверждении и ретрансформации можно получить мутировавшие штаммы L. reuteri с гораздо большей эффективностью трансформации21, наблюдаемой при pTRKH3_mCherry2 примерно 4 x 103 КОЕ/мкг (200-250 колоний на 200 мкл пластины), что позволяет применять их с более высокой пропускной способностью. Аналогичные результаты наблюдались и для репортера mTFP1. Трансформации также проводились с pNZ123 (происхождение круга качения pSH71), не несущим экзогенного конститутивного репортерного белка, что приводило к эффективности трансформации 3 x 10 4 КОЕ/мкг ДНК (дополнительный рисунок 1).

Figure 1
Рисунок 1: Эффективность электропорации. Суммарные запасы плазмид 10 нМ pTRKH3_mTFP1 и 80 нМ pTRKH3_mCherry2 были получены из двух источников: DH10β E. coli и нокаута dcm-/dam-метилазы E. coli. Затем L. reuteri электропорировали 10 мкл двух различных плазмид метилирования и подсчитывали колонии. Полосы погрешности обозначают стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Трансформационные условия роста
L. reuteri устойчив к аэроциклам и может выращиваться в бульоне и на агаре в нормальных атмосферных условиях. Однако успех трансформации в значительной степени зависит от создания анаэробной среды роста при покрытии; Это, пожалуй, самое важное условие успеха трансформации. Утечки O2 можно обнаружить, включив пластину с нетрансформированным L. reuteri. Морфология колоний заметно изменяется в присутствии кислорода (см. рис. 2); в качестве альтернативы можно использовать анаэробные индикаторы (см. Таблицу материалов).

Figure 2
Рисунок 2: Морфология колонии L. reuteri. Колонии трансформировались с помощью pTRKH3_mCherry2 плазмиды. (A) При неправильных условиях с низким содержанием O2 колонии кажутся белыми, непрозрачными, гладкими, круглыми, выпуклыми и блестящими. (B) При частичном или негерметичном состоянии O2 колонии выглядят белыми, непрозрачными, волнистыми (волнистыми), круглыми, зонтичными (округлыми/узловатыми) и блестящими. (C) Колонии L. reuteri без плазмидной трансформации при атмосферных уровняхO2 . Колонии кажутся либо непрозрачными, либо полупрозрачными, либо зонтичными, либо плоскими; Они всегда кажутся лопастными, круглыми и сухими. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Измерение репортерного белка
Экспрессия и рост репортерного белка L. reuteri DSM20016 дикого типа варьируются между колониями (см. рис. 3A), что затрудняет точные выводы об активности системы. Можно отобрать и вылечить правильно трансформированный L. reuteri дикорастущего типа DSM20016; Ретрансформация может привести к появлению штаммов с мутациями, обеспечивающими большую эффективность трансформации. Один штамм, разработанный с помощью этого метода, оказался гораздо более стабильным с точки зрения экспрессии репортерного белка (см. рис. 3B). Желательно, чтобы такие мутации искали путем отверждения и ретрансформации плазмиды перед выполнением работы, требующей настроенной экспрессии белка.

Figure 3
Рисунок 3: Результаты ПЦР роста, репортерной флуоресценции и колонии для трансформированных L. reuteri. В обоих экспериментах используется плазмида pTRKH3_mCherry2 80 нМ. (А,Б) Каждый столбец на каждом из трех подграфиков относится к значению OD одной и той же колонии, значению флуоресценции (например: 589 нм; Em: 610 нм) и результат ПЦР (сплошной блок указывает на правильную наблюдаемую полосу). (A) Отобраны все колонии L. reuteri DSM20016 трансформации (контрольная трансформация = ноль колоний). Колонии инкубировали в фильтрованном бульоне MRS в течение 24 ч перед измерением при усилении 100. (B) В общей сложности 88 колоний, отобранных из штамма L. reuteri DSM20016, отобранного для более высокой эффективности трансформации, более стабильного производства репортерного белка и более низкого ингибирования ПЦР (контрольная трансформация = ноль колоний). Колонии инкубировали в фильтрованном бульоне MRS в течение 24 ч перед измерением при усилении 200. Элементы управления выделены синим цветом, C = управление непреобразованными DSM20016 ячейками, M = фильтрованное управление средой только из бульона MRS, а полосы погрешностей обозначают стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Колония ПЦР
ПЦР колоний не следует использовать в качестве единственного средства для определения правильной трансформации, поскольку они могут быть ненадежными, даже когда образцы разбавлены и хранятся в охлажденном состоянии (см. рис. 4). Если контроль без плазмиды, включенный в трансформацию, демонстрирует нулевые колонии, это означает, что все колонии имеют плазмиду, несущую устойчивость к антибиотикам. Однако, если требуется колониальная ПЦР, оптимизированные условия, изложенные здесь, могут значительно увеличить успех.

Figure 4
Рисунок 4: ПЦР колонии трансформированных L. reuteri. (A) Колонии L. reuteri DSM20016 были проверены на наличие положительных полос ПЦР; шесть были получены и инокулированы в свежий автоклавный бульон MRS. Образцы по 5 мкл, взятые в различные моменты времени после инокуляции, снова подвергались ПЦР при указанных уровнях разведения. Цвета в каждом поле времени/разведения указывают на успех восстановления ПЦР: зеленый = наблюдаемая правильная полоса; красный = полоса не наблюдается. (B) Результаты фиксированного 100-кратного разведения показывают, что изменение температуры подготовки приводило к различным показателям успеха ПЦР: образцы готовили на льду и сразу же вводили ПЦР-эд (89,77%), готовили при комнатной температуре и сразу же ПЦР-эд (75%) или готовили при ЛТ, а затем инкубировали при 37 °С в течение 30 мин перед ПЦР (27,27%). (C) (1) Восемь положительных образцов 100-кратного разбавления (R1-8) из условия RT. (2) После того, как образцы были оставлены в RT в течение 48 часов, образцы были подвергнуты ПЦР-обработке во второй раз, показав отсутствие полос на ~ 1,1 кб; положительные и отрицательные элементы управления (полосы +/-) являются крайними правыми полосами в C (2). Используемая лестница составляла 1 кб плюс лестница ДНК, указанная в Таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

L. reuteri mini-prep
Мини-подготовка для L. reuteri ограничена и предназначена только в качестве альтернативного метода подтверждения плазмидной трансформации. В предыдущей публикации отмечалось, что некоторые штаммы более эффективно лизируются мутанолизином22; Было обнаружено, что двойное лизоцим-мутанолизиновое действие является наиболее эффективным для L. reuteri DSM20016. Пропущение элюата mini-prep через агарозный гель приводит к мазку, а не к наблюдаемым полосам. Однако последующая ПЦР должна давать ожидаемые размеры полос (см. рис. 5).

Figure 5
Рисунок 5: Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР и мини-преп. Те же шесть колоний из рисунка 4А были мини-подготовлены с использованием протокола, изложенного в этом документе. (Нижний ряд) Мини-преп элюат показывает мазок. (Верхний ряд) После проведения ПЦР с использованием элюанта в качестве матрицы ДНК наблюдаются четкие положительные полосы. Используемая лестница составляла 1 кб плюс лестница ДНК, указанная в Таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Эффективность трансформации L. reuteri DSM20016 плазмидой pNZ123. Превращения, проводимые с pNZ123 (происхождение круга качения pSH71), не несущим экзогенного конститутивного репортерного белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Файлы САПР для анаэробных камер. Лист 1: Базовый чертеж; Лист 2: Длинный настенный рисунок; Лист 3: Маленький настенный рисунок; Лист 4: Верхний рисунок; Лист 5: Чертеж крышки; Лист 6: Рисунок губ замка; Лист 7: Чертеж зажимного стержня; Лист 8: Чертеж зажимной пластины; Лист 9: Обзор сборки; Лист 10: Обзор с пронумерованными частями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наиболее важным шагом для трансформации L. reuteri DSM20016 является создание анаэробных условий роста после нанесения покрытий на трансформацию; колонии, полученные в аэробных условиях, встречаются очень редко и, как правило, не растут при инокуляции в бульон MRS. Также следует практиковать покрытие всего объема восстановления, чтобы максимизировать вероятность роста колонии. Даже с учетом этих двух критических этапов эффективность трансформации по-прежнему является ограничением для экспериментов, поскольку ожидаемые колонии могут составлять всего одну или две на пластину во время превращений (см. рис. 1).

Первоначально использовались коммерческие контейнеры для пищевых продуктов, которые оказались недостаточными для последовательного исключенияО2. Файлы САПР для анаэробных камер, разработанных механическим цехом университета, можно найти в дополнительном файле 1. Поскольку эти коробки могут иногда проникать воздухом через небольшие зазоры в столярных изделиях, рекомендуется наполнить их водой (негерметичной), чтобы проверить наличие утечек перед первым использованием; Последующие проверки, как правило, не нужны. Эти коробки должны иметь системы замены O 2, а не системы секвестрации O2, поскольку они не были испытаны на повышение давления.

Могут возникнуть проблемы со СМИ; Автоклавный бульон MRS селективен, но обладает сильными автофлуоресцентными свойствами, что затрудняет измерение низких флуоресцентных показаний. Модификация для использования стерилизованного фильтрованного бульона MRS улучшает эту проблему, но является менее избирательной. L. reuteri снижает рН среды примерно до рН 4 через 24 ч (см. рис. 6), поэтому среда требует буферизации для обнаружения чувствительного к кислоте GFP23. Мы модифицировали этот протокол, чтобы вместо этого использовать более кислотостойкий mCherry2, чтобы избежать этой проблемы.

Figure 6
Рисунок 6: рН L. reuteri с течением времени в бульоне MRS. L. reuteri DSM20016 снижает рН с течением времени (пунктирная линия); значение pKa указывает рН, при котором флуоресценция репортерного белка будет составлять 50% от максимального значения из-за кислотности (горизонтальные линии). EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4,3, mCherry2 pKa = 3,3. Каждый репортерный белок имеет репортерную эффективность, сниженную до 50% от максимальной флуоресценции в разные моменты времени из-за их кислотной чувствительности при продуцировании во все более кислых L. reuteri (вертикальные линии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

L. reuteri DSM20016, по-видимому, ингибирует усилия колонии ПЦР, серьезно ограничивая полезность этой процедуры. Всего 30 минут при 37 ° C после шага 4.3 могут увеличить частоту неудач ПЦР, в то время как 48 часов при ЛТ приводят к полному отказу ПЦР (см. рис. 4B, C). Модификация для разбавления образцов и постоянного хранения образцов на льду имеет решающее значение для повышения успеха ПЦР колоний.

Многое остается неизвестным о внутренних функциях L. reuteri DSM20016. Контрольные пластины трансформации без добавления плазмиды во время электропорации, показывающие нулевые колонии, должны подразумевать, что любые колонии, присутствующие в состоянии плазмиды, обладают плазмидой. Однако было показано, что последующая колонионная ПЦР не подтверждает достоверно поглощение плазмиды даже с модификациями. Это может быть связано с рестрикцией эндонуклеаз, разрушающей фрагменты ДНК ПЦР. Эндонуклеазы были обнаружены у других видов Lactobacillaceae и преодолены с помощью dam-/dcm-E.coli 19,20. L. reuteri DSM20016 имеет несколько предполагаемых ферментов рестрикционно-модификации, аннотированных с помощью вычислительного анализа24. Эффективность трансформации DSM20016 потенциально может быть повышена еще больше, если можно охарактеризовать и избежать сайтов распознавания ферментов рестрикционной модификации (RM). Необходимо дальнейшее расследование.

Модифицированный метод электропорации, изложенный в этой статье, предлагает менее сложную, более современную альтернативу методу, ранее описанному для L. reuteri DSM20016 Ahrne et al.25. В этой статье исследуются важные положения, сделанные Ahrne et al. в отношении требований к метилированию DAM-/dcm-для поглощения плазмид, которые не были подтверждены. Метод преобразования, изложенный в этой статье, также подчеркивает критическое требование анаэробного роста после нанесения покрытия, которое явно не указано Ahrne et al.

Некоторые способы и подходы, изложенные в настоящем документе, могут быть использованы в будущих приложениях для оказания помощи другим попыткам манипулирования семейством Lactobacillaceae , а именно: включение контрольных пластин трансформации, использование кислотостойкого репортера mCherry2, требования к температуре колонии ПЦР и включение мини-преп-мутанолизина. Тем не менее, некоторые из них все еще могут нуждаться в модификациях для оптимальной работы в других штаммах.

L. reuteri DSM20016 имеет клиническое и сельскохозяйственное значение из-за его положения не только в качестве универсального комменсала позвоночных (с потенциальным использованием в качестве добавки в корм для скота), но и в качестве одного из очень небольшого числа штаммов семейства Lactobacillaceae, неразрывно связанных с кишечной средойчеловека 8. Эффективное манипулирование этим микробом откроет его в качестве шасси для будущей доставки новых методов лечения в желудочно-кишечном тракте и неинвазивного мониторинга воспалительных состояний. В этой статье эти методы были явно сопоставлены и коллективно продемонстрированы с модификациями, в частности, для немодельного штамма L. reuteri DSM20016.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Конфликта интересов не существует.

Acknowledgments

Мы высоко ценим ценные советы, предоставленные профессором Й.. ван Пейкереном (Университет Висконсин-Мэдисон), чье руководство по работе с L. reuteri ATCC PTA 6475 послужило основой для описанных здесь методов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb Plus DNA Ladder NEB N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes Thomas Scientific 1145J12
Agarose  BioShop AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) Beckman Allegra  N/A No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet Thermo Scientific OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system VWR 58017-984
Centrifuge tubes (50 mL) FroggaBio TB50-500
DNA gel x6 loading dye NEB B7024S
Electroporation cuvette Fisherbrand FB101
Erythromycin Millipore Sigma E5389-5G
Gel electroporation bath/dock VWR 76314-748
Glycerol  BioShop GLY001
Limosilactobacillus reuteri Leibniz Institute DSMZ DSM20016 Strain designation F275
Lysozyme BioShop LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) FroggaBio LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen) Qiagen 27106 slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein 
MRS Broth (Dehydrated) Thermo Scientific CM0359B
Mutanolysin Millipore Sigma M9901-5KU
NaOH  Millipore Sigma 1064691000
P100 Pipette Eppendorf 3123000047
P1000 Pipette Eppendorf 3123000063
P2.5 Pipette Eppendorf 3123000012
P20 Pipette Eppendorf 3123000039
P200 Pipette Eppendorf 3123000055
PCR tubes FroggaBio STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge Genlantis E200100
Petri dishes VWR 25384-088
PTC-150 Thermal Cycler MJ Research N/A No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified) Addgene 27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer Thermo Scientific 840-281700
Storage microplate Fisher Scientific 14-222-225
Sucrose BioShop SUC507
TAE Buffer 50x Thermo Scientific B49
Vortex VWR 58816-121 No longer in production
VWR 1500E incubator VWR N/A No longer in production

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
  2. Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
  3. Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
  4. Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
  5. Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
  6. Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
  7. Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
  8. Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
  9. Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. Transformation of Lactobacillus by electroporation. Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).
  10. Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
  11. Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
  12. Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
  13. MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
  14. Oh, J. H., van Pijkeren, J. P. CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic Acids Research. 42 (17), 131 (2014).
  15. Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
  16. Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
  17. Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
  18. Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
  19. Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M. Genetic engineering of Lactobacillus diolivorans. FEMS Microbiology Letters. 344 (2), 152-158 (2013).
  20. Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
  21. Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
  22. O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
  23. Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
  24. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, Database issue D298-D299 (2015).
  25. Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).

Tags

Биоинженерия выпуск 196
Методы подтверждения электропорации и трансформации <em>Limosilactobacillus reuteri</em> DSM20016
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duggan, A., McMillen, D. Methods for … More

Duggan, A., McMillen, D. Methods for Electroporation and Transformation Confirmation in Limosilactobacillus reuteri DSM20016. J. Vis. Exp. (196), e65463, doi:10.3791/65463 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter