Summary
Hier presenteren we protocollen voor het werken met Limosilactobacillus reuteri DSM20016, met details over groei, plasmidetransformatie, kolonie-PCR, fluorescerende reporter-eiwitmeting en beperkte plasmide mini-prep, evenals veelvoorkomende problemen en probleemoplossing. Deze protocollen maken het mogelijk om reportereiwitten in DSM20016 te meten, of bevestiging via kolonie-PCR als er geen reporter bij betrokken is.
Abstract
Lactobacillus was een ongelooflijk groot, divers geslacht van bacteriën bestaande uit 261 soorten, waarvan er verschillende commensale stammen waren met het potentieel voor gebruik als een chassis voor synthetische biologische inspanningen in het maagdarmkanaal. De grote fenotypische en genotypische variatie die binnen het geslacht werd waargenomen, leidde tot een recente herclassificatie en de introductie van 23 nieuwe geslachten.
Vanwege de breedte van de variaties binnen de oude geslachten, werken protocollen die in één lid worden gedemonstreerd mogelijk niet zoals geadverteerd met andere leden. Een gebrek aan gecentraliseerde informatie over hoe specifieke stammen precies moeten worden gemanipuleerd, heeft geleid tot een reeks ad-hocbenaderingen , vaak aangepast van andere bacteriële families. Dit kan de zaken bemoeilijken voor onderzoekers die in het veld beginnen, die misschien niet weten welke informatie wel of niet van toepassing is op de door hen gekozen soort.
In dit artikel willen we een reeks protocollen centraliseren met aantoonbaar succes, met name in de Limosilactobacillus reuteri-stamaanduiding F275 (andere verzamelnummers: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), samen met advies voor probleemoplossing en veelvoorkomende problemen die men kan tegenkomen. Deze protocollen moeten een onderzoeker met weinig tot geen ervaring met het werken met L. reuteri DSM20016 in staat stellen om een plasmide te transformeren, transformatie te bevestigen en systeemfeedback in een plaatlezer te meten via een reporter-eiwit.
Introduction
Het geslacht Lactobacillus werd historisch geclassificeerd als gram-positieve, staafvormige, niet-sporenvormende, ofwel facultatieve anaëroben of microaerofielen die suikers afbreken om voornamelijk melkzuurte produceren 1. Deze losse criteria leidden ertoe dat Lactobacillus , fenotypisch en genotypisch, een zeer divers geslacht was. Deze brede indeling resulteerde in een herindeling van het geslacht, waarbij in 2020 23 nieuwe geslachten werden geïntroduceerd2.
Het oude, bredere geslacht omvatte belangrijke commensale en probiotische soorten die over het algemeen als veilig worden beschouwd (GRAS) voor consumptie3. De Lactobacillaceae-familie handhaaft een publieke perceptie van 'goede bacteriën' vanwege de vele gerapporteerde gezondheidsvoordelen die worden toegekend via de consumptie van verschillende stammen 4,5,6,7. Het gemak waarmee ze door het maagdarmkanaalkunnen navigeren 8 en hun publieke acceptatie combineren om Lactobacillaceae-stammen te positioneren als sterke kandidaten als chassisorganismen voor inneembare medicinale, therapeutische of diagnostische toepassingen.
Het brede scala aan kenmerken binnen de Lactobacillaceae-familie heeft geleid tot een situatie waarin er geen de facto modelorganismestam is; Onderzoeksgroepen hebben de neiging om soorten te selecteren met de eigenschappen die het meest relevant zijn voor hun specifieke doelen. (Zuivelfermentatielaboratoria kunnen bijvoorbeeld L. lactis kiezen; studies van plantaardige fermentatie kunnen L. plantarum selecteren; onderzoek naar probiotica kan zich richten op L. acidophilus; enzovoort.)
Ditzelfde brede scala aan kenmerken tussen soorten heeft geleid tot een opeenstapeling van protocollen en procedures die goed kunnen werken voor één subset van de Lactobacillaceae-familie , maar optimalisatie vereisen om efficiënt te werken (of misschien überhaupt te functioneren) in andere9. Deze behoefte aan optimalisatie tussen familieleden en zelfs binnen leden van dezelfde soort kan de inspanningen van onbekende onderzoekers frustreren. Protocollen die in de methodensecties van papers worden gepubliceerd, kunnen ook hun eigen wijzigingen10 bevatten, wat leidt tot gefragmenteerde, gedecentraliseerde protocolverzamelingen.
L. reuteri wordt beschouwd als een op grote schaal gewervelde commensaal, consequent gevonden in zoogdieren, aviaire11 en vis12 gastro-intestinale (GI) kanalen. L. reuteri-substammen zijn vaak genetisch gespecialiseerd, via aanpassing van slijmadhesie-eiwitten, om specifieke inheemse gastheren permanenter te koloniseren 8,11,13. GI tract Limosilactobacillus soorten kunnen worden geïsoleerd in gastheren buiten hun inheemse gastheer, maar neigen meer naar een voorbijgaande aard8.
Vanwege de specialisatie tussen mens en gastheer positioneert L. reuteri zich DSM20016 zeer goed als een chassis voor diagnostische of therapeutische toepassingen op elk punt in het menselijke maagdarmkanaal, en de stam DSM20016 zou een langduriger effectvenster voor interventies kunnen bieden in vergelijking met meer voorbijgaande stammen.
In dit artikel schetsen we een reeks protocollen met aangetoonde effectiviteit in Limosilactobacillus reuteri (stamaanduiding: F275; andere verzamelnummers: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), samen met gecentraliseerde informatie over de stam uit andere bronnen om te helpen bij moleculaire en systeembiologische toepassingen. De hierin beschreven procedures moeten een onderzoeker zonder eerdere ervaring in staat stellen om L. reuteri te kweken, elektrocompetente voorraden te creëren, getransformeerde kolonies te selecteren, transformatie via koloniepolymerasekettingreactie (PCR) te bevestigen en ontworpen systeemrespons te meten via fluorescerende reportereiwitten.
We merken op dat gerelateerde protocollen betrekking hebben op CRISPR-Cas9 geassisteerde ssDNA-genoomrecombineering in L. reuteri (stam: ATCC-PTA-6475)14, en CRSIPR-Cas9 nickase-geassisteerde genoombewerking in meerdere niet-L. reuteri, Lactobacillaceae familie vlekken15,16; deze gaan echter niet in op de L. reuteri DSM20016 stam die hier onze focus is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prepareren van L. reuteri DSM20016 elektrocompetente cellen
OPMERKING: Dit is gebaseerd op een protocol van Berthier et al.17, met centrifugatiesnelheden geïnformeerd door Rattanachaikunsopon et al.18.
- In een centrifugebuis van 50 ml ent u L. reuteri uit glycerolbouillon tot 6 ml deMan Rogosa Sharpe (MRS) bouillon. Incubeer aeroob gedurende een nacht bij 37 °C in een statische incubator.
- De volgende ochtend ent u 4 ml van de nachtcultuur in 200 ml MRS-bouillon (1:50 verdunning).
- Laat aeroob groeien in een statische incubator van 37 °C totdat de optische dichtheidswaarde van 600 nm (OD600) 0,5-0,85 bereikt; Dit duurt ongeveer 2-3 uur.
- Zodra een adequate OD600-waarde is bereikt, decanteert u de media in centrifugebuizen van 50 ml en plaatst u deze op ijs terwijl u de buizen balanceert.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 5.000 x g in een voorgekoelde centrifuge van 4 °C.
- Gooi het supernatant weg, resuspensie van elke pellet in 50 ml voorgekoeld (0 °C tot 4 °C) ddH2O en centrifugeer opnieuw met dezelfde instellingen als de vorige stap. Houd de cellen zoveel mogelijk op ijs.
- Herhaal stap 1.6.
- Resuspendie van elke pellet in 25 ml ddH2O: 0,5 M sucrose, 10% glycerol. Centrifugeer bij 5.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min. Gooi het supernatant weg en leg de cellen terug op ijs.
- Resuspensie van alle pellets in dezelfde 2 ml ddH2O: 0,5 M sucrose, 10% glycerol.
- Aliquot in porties van 50 μl tot 100 μl in voorgekoelde microcentrifugebuizen; bewaren bij -80 °C voor later gebruik.
2. Elektroporatie van L. reuteri
OPMERKING: Vermijd pipetteren zoveel mogelijk in de volgende stappen. Opname van een controle-elektroporatie, zonder toevoeging van plasmide, wordt geadviseerd om ervoor te zorgen dat de antibioticaselectie voldoende is.
- Neem een hele elektrocompetente L. reuteri aliquot en ontdooi deze op ijs.
- Meng voorzichtig 5 μL tot 10 μL plasmide (uiteindelijke plasmideconcentratie >6 nM) in het ontdooide aliquot, waarbij pipetteren zoveel mogelijk wordt vermeden.
- Breng over in een ijsgekoelde, 1 mm gap elektroporatiecuvette.
- Elektroporaat bij 1,25 kV, 400 Ω en 25 μF.
- Voeg 1 ml MRS-bouillon op kamertemperatuur (RT) toe en meng door de cuvette een of twee keer om te keren.
- Plaats de cuvetten gedurende 2,5-3 uur in een statische incubator bij 37 °C om herstel mogelijk te maken.
- Plak de volledige hoeveelheid op meerdere MRS-agarplaten met de juiste selectie.
- Plaats de platen in een volledig luchtdichte container met een kleine brandende kaars ("theelicht") en een anaeroob atmosfeergenererend sachet.
- Groei bij 37 °C gedurende 2-3 dagen of totdat zichtbare kolonies aanwezig zijn.
3. Meting van het zuurbestendige fluorescerende reportereiwit mCherry2
- Kies alle kolonies die nodig zijn voor meting en ent in een 96-well opslagmicroplaat met 1,5 ml filter gesteriliseerde (niet-geautoclaveerde) MRS-bouillon per put en een geschikt selectieantibioticum.
- Incubeer aeroob gedurende 24 uur 's nachts bij 37 °C zonder te schudden.
OPMERKING: Deze opslagmicroplaat moet worden bewaard voor gebruik in sectie 4 (kolonie-PCR). - L. reuteri zal in de stationaire fase uit de media neerslaan; resuspensie van de nachtcultuur via pipetteren.
- Breng 200 μL over in een vlakke plaat met 96 putten met een vlakke bodem, breng de plaat over naar een plaatlezer en meet de OD en fluorescentie van mCherry2 (excitatie [Ex]: 589 nm; emissie [Em]: 610 nm) of andere relevante verslaggevers.
4. Bevestiging van plasmideopname via kolonie-PCR
- Breng van de 96-well opslagmicroplaat uit sectie 3 5 μL over naar een PCR-buis.
OPMERKING: Als >5 minuten zijn verstreken, kan het nodig zijn om de L. reuteri een tweede keer te resuspenseren. - In een draagbare tafelmicrocentrifuge, draai naar beneden totdat de pellet zichtbaar is (ongeveer 2 min bij 2.000 x g), gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 20 μL van 20 mM NaOH.
- Kook bij 95 °C gedurende 5 min, vortex, en herhaal de kook een tweede keer.
- Koel de monsters onmiddellijk af; probeer de monsters zoveel mogelijk op ijs te houden in de volgende stappen om de kans op sjabloondegradatie en PCR-remming te verkleinen.
- Draai in een draagbare tafelmicrocentrifuge op 2.000 x g gedurende 2 minuten totdat het celafval is gepelletiseerd, neem dan 1 μL van het supernatant en verdun tot 99 μL ijskoude DNase- en RNase-vrije ddH2O (100x verdunning).
- Gebruik de 100x-verdunning als sjabloon-DNA in een standaard PCR-reactie met plasmide-specifieke primers. Neem een positieve controle op met een plasmide afgeleid van de E. coli mini-prep.
- Breng de monsters terug op ijs en voeg een geschikte ladingkleurstof toe in een concentratie van 1x.
- Voer 1% agarosegel in TAE-buffer (tris-acetaat-ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA]) in bij 110 V gedurende 30 minuten. Afbeelding indien nodig.
5. Mini-prep protocol voor L. reuteri , gevolgd door PCR om de aanwezigheid van plasmide te bevestigen
OPMERKING: Protocol bedoeld voor gebruik met de minivoorbereidingskit die wordt vermeld in de materiaaltabel.
- Ent L. reuteri in 10 ml MRS-bouillon met een geschikt antibioticum en incubeer 's nachts aeroob bij 37 °C in een statische incubator.
- Centrifugeer gedurende 10 minuten op 5.000 x g in een voorgekoelde centrifuge van 4 °C.
- Was de pellet in 2 ml standaard P1-buffer (meegeleverd met de kit) om de zuurgraad te verminderen die latere stappen kan verstoren, centrifugeer met dezelfde instelling als eerder beschreven en gooi het supernatant weg.
- Resuspendeer de pellet in 250 μL gemodificeerde P1-buffer met 10 mg/ml lysozym en 100 E/ml mutanolysine om bacteriële cellen te lyseren. Incubeer gedurende 1-2 uur bij 37 °C.
- Voeg 250 μL buffer P2 toe, meng door vier tot zes keer om te keren en incubeer bij RT gedurende niet langer dan 5 minuten.
- Voeg 350 μL buffer N3 toe (meegeleverd met de kit) en keer onmiddellijk vier tot zes keer voorzichtig om om te mengen.
- Centrifugeer op 10.000 x g gedurende 10 min.
- Breng zoveel mogelijk supernatant over in een spinkolom en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 60 s. Gooi de stroom door.
- Was de centrifugeerkolom met 500 μL buffer PB (meegeleverd met de kit) en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 60 s. Gooi de stroom door.
- Was de centrifugeerkolom met 750 μL buffer PE (meegeleverd met de kit) en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 60 s. Gooi de stroom door en centrifugeer gedurende 60 s om eventuele resterende buffer te verwijderen.
- Plaats de spinkolom in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Breng 20-30 μL DNAse- en RNAse-vrije ddH 2 O aan op het filter van de spinkolom en laat1-2minuten staan, voordat u gedurende 60 s centrifugeert bij 10.000 x g .
- Voer een standaard PCR-reactie uit met behulp van plasmide-specifieke primers (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), waarbij eluaat het sjabloon-DNA levert. Neem een positieve controle op met een plasmide afgeleid van de E. coli mini-prep.
OPMERKING: De PCR-instellingen die in dit onderzoek worden gebruikt, zijn: 98 °C gedurende 5 min, (98 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 45 s) 30 cycli, 72 °C gedurende 2 minuten, 4 °C vasthouden. De parameters zijn sterk afhankelijk van het gebruikte polymerase, de fragmentlengte en de exacte primers die worden gebruikt door elke persoon die dit protocol gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efficiëntie van transformatie
L. reuteri vereist geen dcm-/moeder- niet-gemethyleerd plasmide, zoals waargenomen voor andere Lactobacillaceae19,20 (zie figuur 1). Elektroporatie van L. reuteri DSM20016 met 10 μL van de 8,5 kb plasmide pTRKH3_mCherry2 (pAMβ1 theta oorsprong van replicatie) zou transformatie-efficiënties moeten geven van ongeveer 80 kolonievormende eenheden (CFU)/μg (vijf tot acht kolonies per 200 μL verguld), ongeacht de plasmidemethylatieconditie. Met selectieve uitharding en hertransformatie is het mogelijk om gemuteerde L. reuteri-stammen te verkrijgen met een veel grotere transformatie-efficiëntie21, waargenomen met pTRKH3_mCherry2 van ongeveer 4 x 103 CFU / μg (200-250 kolonies per 200 μL verguld), waardoor toepassingen met een hogere doorvoer mogelijk zijn. Vergelijkbare resultaten werden ook waargenomen voor de verslaggever mTFP1. Transformaties werden ook uitgevoerd met pNZ123 (pSH71 rolling circle origin), zonder exogene constitutieve reporter-eiwit, wat resulteerde in transformatie-efficiënties van 3 x 104 CFU/μg DNA (aanvullende figuur 1).
Figuur 1: Elektroporatie-efficiëntie. Totalen van 10 nM pTRKH3_mTFP1 en 80 nM pTRKH3_mCherry2 plasmidevoorraden werden verkregen uit twee bronnen: DH10β E. coli en dcm-/dam-methylase knockout E. coli. L. reuteri werd vervolgens geëlektropoeerd met 10 μL van de twee verschillende methylatiepatroonplasmiden en de kolonies geteld. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Groeivoorwaarden voor transformatie
L. reuteri is aerotolerant en kan in normale atmosferische omstandigheden in bouillon en op agar worden gekweekt. Het succes van transformatie is echter sterk afhankelijk van het genereren van een anaërobe groeiomgeving wanneer deze wordt verguld; Het is misschien wel de belangrijkste voorwaarde voor transformatiesucces. O2 lekken kunnen worden gedetecteerd door een plaat van niet-getransformeerde L. reuteri op te nemen. Koloniemorfologie verandert merkbaar in de aanwezigheid van zuurstof (zie figuur 2); als alternatief kunnen anaerobe indicatoren worden gebruikt (zie Materiaaltabel).
Figuur 2: L. reuteri koloniemorfologie. Kolonies getransformeerd met het pTRKH3_mCherry2 plasmide. (A) Onder correcte laag-O2-omstandigheden lijken kolonies wit, ondoorzichtig, glad, rond, bol en glanzend. (B) Onder gedeeltelijke of lekkende O2-omstandigheden lijken kolonies wit, ondoorzichtig, golvend (golvend), rond, umbonate (afgerond/knobbelig) en glanzend. (C) L. reuteri-kolonies zonder plasmidetransformatie onder atmosferische O2-niveaus . De kolonies lijken ondoorzichtig of doorschijnend en ofwel umbonate of plat; Ze lijken altijd gelobd, rond en droog. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Reporter eiwitmeting
Wild-type L. reuteri DSM20016 reporter eiwitexpressie en -groei variëren tussen kolonies (zie figuur 3A), waardoor nauwkeurige deducties op systeemactiviteit moeilijk zijn. Het is mogelijk om correct getransformeerde wild-type L. reuteri DSM20016 te selecteren en te genezen; Retransformatie kan aanleiding geven tot stammen met mutaties die een grotere transformatie-efficiëntie mogelijk maken. Eén stam die via deze methode werd ontwikkeld, bleek veel stabieler in termen van reporter-eiwitexpressie (zie figuur 3B). Het is raadzaam dat dergelijke mutaties worden gezocht, via plasmide-uitharding en retransformatie, voordat werkzaamheden worden uitgevoerd die afgestemde eiwitexpressie vereisen.
Figuur 3: Groei, reporterfluorescentie en kolonie-PCR-uitkomsten voor getransformeerde L. reuteri. Beide experimenten gebruiken pTRKH3_mCherry2 plasmide bij 80 nM. (A,B) Elke kolom in elk van de drie subplots verwijst naar de OD-waarde van dezelfde kolonie, fluorescentiewaarde (Ex: 589 nm; Em: 610 nm) en PCR-resultaat (effen blok geeft de juiste waargenomen band aan). (A) Alle kolonies van L. reuteri DSM20016 transformatie geplukt (controletransformatie = nul kolonies). Kolonies geïncubeerd in gefilterde MRS-bouillon gedurende 24 uur vóór meting bij winst 100. (B) Een totaal van 88 kolonies geplukt uit de L. reuteri DSM20016 stam geselecteerd voor hogere transformatie-efficiënties, consistentere reporter-eiwitproductie en lagere PCR-remming (controletransformatie = nulkolonies). Kolonies geïncubeerd in gefilterde MRS-bouillon gedurende 24 uur vóór meting bij winst 200. Besturingselementen zijn in blauw, C = niet-getransformeerde DSM20016 celcontrole, M = gefilterde MRS-bouillon alleen mediacontrole en foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Kolonie PCR
Kolonie-PCR mag niet worden gebruikt als het enige middel om de juiste transformatie af te leiden, omdat ze onbetrouwbaar kunnen zijn, zelfs wanneer monsters worden verdund en gekoeld worden bewaard (zie figuur 4). Als de no-plasmidecontrole die bij transformaties is inbegrepen, nul kolonies vertoont, impliceert dit dat alle kolonies het plasmide hebben dat antibioticaresistentie draagt. Als kolonie-PCR echter vereist is, kunnen de hier uiteengezette geoptimaliseerde omstandigheden het succes aanzienlijk vergroten.
Figuur 4: Kolonie PCR van getransformeerde L. reuteri. (A) L. reuteri DSM20016 kolonies werden gescreend op positieve PCR-banden; zes werden verkregen en ingeënt tot verse geautoclaveerde MRS-bouillon. Monsters van 5 μL die op verschillende tijdstippen na inenting werden genomen, werden opnieuw aan PCR onderworpen bij de aangegeven verdunningsniveaus. Kleuren in elk tijd-/verdunningsvak geven het succes van het PCR-herstel aan: groen = juiste waargenomen band; rood = geen band waargenomen. (B) Uit de resultaten voor een vaste verdunning van 100x blijkt dat het variëren van de bereidingstemperatuur resulteerde in verschillende percentages van PCR-succes: monsters werden op ijs bereid en onmiddellijk PCR-ed (89,77%), bereid bij kamertemperatuur en PCR-ed onmiddellijk (75%), of bereid bij RT en vervolgens geïncubeerd bij 37 °C gedurende 30 minuten vóór PCR (27,27%). (C) (1) Acht positieve 100x verdunningsmonsters (R1-8) uit de RT-toestand. (2) Na 48 uur bij RT te zijn gelaten, werden de monsters een tweede keer PCR-ed gemaakt, waarbij een afwezigheid van de banden bij ~ 1,1 kb werd getoond; positieve en negatieve controles (rijstroken +/-) zijn de meest rechtse rijstroken in C (2). De gebruikte ladder was 1 kb plus de DNA-ladder, opgenomen in de Materiaalopgave. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
L. reuteri mini-prep
Mini-prep voor L. reuteri is beperkt en alleen bedoeld als een alternatieve bevestigingsmethode voor plasmidetransformatie. Een eerdere publicatie merkte op dat sommige stammen effectiever worden gelyseerd door mutanolysine22; dubbele lysozym-mutanolysine-werking bleek het meest effectief te zijn voor L. reuteri DSM20016. Het uitvoeren van de mini-prep eluate door een agarose-gel resulteert in een uitstrijkje in plaats van waarneembare banden. Latere PCR moet echter de verwachte bandgroottes opleveren (zie figuur 5).
Figuur 5: Agarose gel elektroforese van PCR en mini-prep producten. Dezelfde zes kolonies uit figuur 4A werden mini-voorbereid met behulp van het protocol dat in dit artikel is uiteengezet. (Onderste rij) Mini-prep eluate toont een uitstrijkje. (Bovenste rij) Nadat PCR is uitgevoerd met behulp van het eluant als DNA-sjabloon, worden duidelijke positieve banden waargenomen. De gebruikte ladder was 1 kb plus de DNA-ladder, opgenomen in de Materiaalopgave. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Transformatie-efficiëntie van L. reuteri DSM20016 met pNZ123-plasmide. Transformaties uitgevoerd met pNZ123 (pSH71 rollende cirkeloorsprong), zonder exogene constitutieve reporter-eiwit. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 1: CAD-bestanden voor anaerobe kamers. Blad 1: Basistekening; Blad 2: Lange wandtekening; Blad 3: Kleine muurtekening; Blad 4: Bovenste tekening; Blad 5: Dekseltekening; Blad 6: Lock lip tekening; Blad 7: Klemstaaftekening; Blad 8: Klemplaattekening; Blad 9: Montageoverzicht; Blad 10: Overzicht met genummerde onderdelen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritieke stap voor de transformatie van L. reuteri DSM20016 is het genereren van anaërobe groeiomstandigheden nadat transformaties zijn verguld; kolonies die in aerobe omstandigheden zijn opgedaan, zijn slechts zeer incidenteel en groeien over het algemeen niet wanneer ze worden ingeënt in MRS-bouillon. Het beplaten van het volledige herstelvolume moet ook worden geoefend om de kans op koloniegroei te maximaliseren. Zelfs met deze twee kritieke stappen is transformatie-efficiëntie nog steeds een beperking voor experimenten, omdat verwachte kolonies tijdens transformaties zo laag als één of twee per plaat kunnen tellen (zie figuur 1).
Commerciële voedselcontainers werden aanvankelijk gebruikt en bleken onvoldoende te zijn voor consistente O2-uitsluiting. CAD-bestanden voor anaerobe kamers ontworpen door de machinewerkplaats van de universiteit zijn te vinden in Aanvullend Dossier 1. Omdat deze dozen af en toe luchtinfiltratie kunnen hebben door kleine openingen in het schrijnwerk, is het raadzaam om ze te vullen met water (niet afgesloten) om te controleren op eventuele lekken voorafgaand aan het eerste gebruik; Vervolgcontroles zijn over het algemeen niet nodig. Deze dozen moeten O 2-vervangingssystemen hebben in plaats van O 2-sekwestratiesystemen, omdat ze niet zijn getest op drukregeling.
Er kunnen mediaproblemen ontstaan; geautoclaveerde MRS-bouillon is selectief, maar bezit zeer auto-fluorescerende eigenschappen, waardoor de meting van lage fluorescerende waarden wordt belemmerd. Modificatie om filter gesteriliseerde MRS-bouillon te gebruiken verbetert dit probleem, maar is minder selectief. L. reuteri verlaagt de pH van de media tot ongeveer pH 4 na 24 uur (zie figuur 6), zodat de media moeten worden gebufferd om zuurgevoelige GFP23 te detecteren. We hebben dit protocol aangepast om in plaats daarvan meer zuurbestendige mCherry2 te gebruiken, waardoor dit probleem wordt vermeden.
Figuur 6: pH in de loop van de tijd van L. reuteri in MRS-bouillon. L. reuteri DSM20016 verlaagt de pH in de loop van de tijd (stippellijn); de pKa-waarde geeft de pH aan waarbij de reporter-eiwitfluorescentie 50% van de maximale waarde zou zijn vanwege de zuurgraad (horizontale lijnen). EGFP pKa = 6, mTFP1 pKa = 4,3, mCherry2 pKa = 3,3. Elk reporter-eiwit heeft een reportereffectiviteit die is verminderd tot 50% van de maximale fluorescentie op verschillende tijdstippen vanwege hun zuurgevoeligheden wanneer ze worden geproduceerd binnen steeds zuurder L. reuteri (verticale lijnen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
L. reuteri DSM20016 lijkt de PCR-inspanningen van de kolonie te remmen, waardoor het nut van deze procedure ernstig wordt beperkt. Slechts 30 minuten bij 37 °C na stap 4.3 kan het PCR-uitvalpercentage verhogen, terwijl 48 uur bij RT resulteert in volledige PCR-uitval (zie figuur 4B, C). De modificatie om de monsters te verdunnen en de monsters te allen tijde op ijs te houden, is van cruciaal belang voor het vergroten van het succes van de kolonie-PCR.
Over de interne functies van L. reuteri DSM20016 is nog veel onbekend. Transformatiecontroleplaten zonder plasmide toegevoegd tijdens elektroporatie, die nul kolonies vertonen, moeten impliceren dat alle kolonies die aanwezig zijn in de plasmideconditie het plasmide bezitten. Van latere kolonie-PCR is echter aangetoond dat het de opname van plasmide niet betrouwbaar bevestigt, zelfs niet met modificaties. Dit kan te wijten zijn aan restrictie-endonucleasen die PCR-DNA-fragmenten afbreken. Endonucleasen zijn aangetroffen in andere Lactobacillaceae-soorten en overwonnen door het gebruik van dam-/dcm-E.coli 19,20. L. reuteri DSM20016 heeft verschillende vermeende restrictie-modificatie-enzymen geannoteerd via computationele analyse24. De transformatie-efficiëntie van DSM20016 kan mogelijk verder worden verhoogd als de restrictiemodificatie (RM) enzymherkenningslocaties kunnen worden gekarakteriseerd en vermeden. Verder onderzoek is nodig.
De gemodificeerde elektroporatiemethode die in dit artikel wordt beschreven, biedt een minder complex, moderner alternatief voor een methode die eerder door Ahrne et al. is beschreven voor L. reuteri DSM20016.25. Dit artikel onderzoekt belangrijke bepalingen van Ahrne et al. met betrekking tot dam-/dcm-methylatievereisten voor plasmideopname, die niet zijn bevestigd. De transformatiemethode die in dit artikel wordt uiteengezet, benadrukt ook de kritische anaerobe groeivereiste na plating, niet expliciet overgebracht door Ahrne et al.
Sommige methoden en benaderingen die hierin worden uiteengezet, kunnen in toekomstige toepassingen worden gebruikt om andere pogingen tot manipulatie van de Lactobacillaceae-familie te ondersteunen, met name: de opname van transformatiecontroleplaten, het gebruik van de zuurbestendige reporter mCherry2, kolonie-PCR-temperatuurvereisten en mini-prep mutanolysine-inclusie. Sommige kunnen echter nog steeds aanpassingen nodig hebben om optimaal te werken in andere stammen.
L. reuteri DSM20016 is van klinisch en agrarisch belang vanwege zijn positie, niet alleen als een generiek gewerveld commensaal (met potentiële toepassingen als additief in veevoer), maar ook als een van een zeer klein aantal Lactobacillaceae-familiestammen die intrinsiek geassocieerd zijn met de menselijke darmomgeving8. Efficiënte manipulatie van deze microbe zal het openen als een chassis voor de toekomstige levering van nieuwe therapieën in het maagdarmkanaal en niet-invasieve monitoring van ontstekingsaandoeningen. In dit artikel zijn deze methoden expliciet verzameld en gezamenlijk gedemonstreerd met modificaties voor, in het bijzonder, de niet-model L. reuteri-stam DSM20016.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Wij waarderen het waardevolle advies van prof. J.P. van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), wiens begeleiding bij het werken met L. reuteri ATCC PTA 6475 een basis vormde voor de hier beschreven methoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
References
- Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
- Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
- Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
- Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
- Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
- Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
- Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
- Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
- Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F.
- Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
- Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
- Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
- MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
- Oh, J. H., van Pijkeren, J. P.
- Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
- Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
- Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
- Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
- Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M.
- Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
- Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
- O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
- Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, Database issue D298-D299 (2015).
- Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).
