Summary
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för användning av en luciferasbaserad reporteranalys i ett halvautomatiserat screeningformat med hög genomströmning.
Abstract
Växande bevis har visat att högt autofagiskt flöde är relaterat till tumörprogression och cancerterapiresistens. Analys av enskilda autofagiproteiner är en förutsättning för terapeutiska strategier som riktar sig mot denna signalväg. Hämning av autofagiproteaset ATG4B har visat sig öka den totala överlevnaden, vilket tyder på att ATG4B kan vara ett potentiellt läkemedelsmål för cancerbehandling. Vårt laboratorium har utvecklat en selektiv luciferasbaserad analys för övervakning av ATG4B-aktivitet i celler. För denna analys märks substratet för ATG4B, LC3B, vid C-terminalen med ett utsöndringsbart luciferas från den marina hoppkräftan Gaussia princeps (GLUC). Denna rapportör är kopplad till aktincytoskelettet och håller den på så sätt i cellernas cytoplasma när den är olöst. ATG4B-medierad klyvning resulterar i frisättning av GLUC genom icke-konventionell sekretion, som sedan kan övervakas genom att skörda supernatanter från cellodling som ett korrelat av cellulär ATG4B-aktivitet. Denna artikel presenterar anpassningen av denna luciferasbaserade analys till automatiserad screening med hög genomströmning. Vi beskriver arbetsflödet och optimeringen för exemplifierande analys av cellulär ATG4B-aktivitet med hög genomströmning.
Introduction
Autofagi är en konserverad metabolisk process som gör det möjligt för celler att behålla intracellulär homeostas och reagera på stress genom att bryta ner åldrat, defekt eller onödigt cellulärt innehåll via lysosomerna 1,2,3. Under vissa patofysiologiska förhållanden fungerar denna process som ett avgörande cellulärt svar på närings- och syrebrist, vilket resulterar i återvunna näringsämnen och lipider, vilket gör att cellerna kan anpassa sig till sina metaboliska behov 2,3,4. Autofagi har också identifierats som en cellulär stressreaktion relaterad till flera sjukdomar, såsom neurodegenerativa sjukdomar, patogeninfektion och olika typer av cancer. Autofagins funktion vid cancer är komplex och beroende av tumörens typ, stadium och status. Det kan undertrycka tumörbildning genom autofagisk nedbrytning av skadade celler, men kan också främja överlevnaden av avancerade tumörer genom att förbättra cellöverlevnaden under stressiga förhållanden, såsom hypoxi, näringsbrist och cytotoxisk skada 2,4,5,6.
Flera studier har visat att autofagihämning ger en fördel som en anticancerstrategi. Således kan hämning av kritiska steg, såsom autofagosombildning eller dess fusion med lysosomen, vara en effektiv metod för cancerkontroll 2,4,5,6. Växande bevis har visat att ATG4B är involverat i vissa patologiska tillstånd, och det har fått uppmärksamhet som ett potentiellt mål mot cancer 2,3,4. Till exempel observerades att kolorektala cancerceller och humana epidermala tillväxtfaktorreceptor 2 (HER2)-positiva bröstcancerceller hade signifikant högre ATG4B-uttrycksnivåer än intilliggande normala celler 2,4. I prostatacancerceller resulterade hämning av ATG4B i en cellinjespecifik känslighet för kemoterapi och strålbehandling7. På senare tid har det framkommit starka bevis för att bukspottkörtelcancer (PDAC) är särskilt sårbart för ATG4B-hämning. Till exempel, i en genetiskt modifierad musmodell, visades det att intermittent förlust av ATG4B-funktion minskar PDAC-tumörtillväxt och ökar överlevnaden 3,4. Sammantaget är ATG4B kraftigt överuttryckt i vissa cancertyper, är relaterat till tumörprogression och är kopplat till cancerterapiresistens 2,4,8.
ATG4-cysteinproteaserna hos däggdjur har fyra familjemedlemmar, ATG4A-ATG4D. Dessa proteiner uppvisar en viss målselektivitet mot LC3/GABARAP (ATG8)-familjen av proteiner 9,10,11 och kan ha ytterligare funktioner som inte är kopplade till deras proteasaktivitet12,13. Dessutom fungerar ATG4 för att reglera en ny typ av posttranslationell modifiering, ATG8-ylering av proteiner11,12. Medan ATG4B och dess huvudsubstrat LC3B är de mest studerade, framträder en bild som tyder på en komplex roll för varje underfamiljemedlem i regleringen av autofagiska och icke-autofagiska processer. Detta bekräftas ytterligare av ett komplext nätverk av posttranslationella modifieringar som reglerar ATG4B-aktivitet via fosforylering, acetylering, glykosylering och nitrosylering 9,10,11,12,13.
Flera kända ATG4B-hämmare har publicerats 2,4,14,15. Även om dessa är lämpliga som forskningsverktyg, har deras farmakodynamiska profil, selektivitet eller styrka ännu hindrat dem från att utvecklas som prekliniska kandidater 4,16. Sammantaget finns det ett akut behov av att identifiera mer potenta och selektiva föreningar. Ofta är föreningarna bra biokemiska hämmare av proteinfunktion, men deras effektivitet i cellbaserade analyser är dålig. Det finns flera analyser för att övervaka ATG4B-aktivitet, inklusive biokemiska metoder och cellbaserade analyser4. Vi har tidigare utvecklat en enkel, luminiscensbaserad high-throughput-analys för övervakning av ATG4B-aktivitet i cell 8,17. Denna analys använder ett luciferasprotein från Gaussia princeps (GLUC) som är stabilt och aktivt i den extracellulära miljön och kan induceras från celler som svar på ATG4B proteolytisk aktivitet18,19.
I denna reporterkonstruktion är dNGLUC kopplat till cellernas aktincytoskelett. En proteasspecifik länkare kan föras in mellan β-aktinankaret och dNGLUC, vilket gör sekretet beroende av klyvningen av länkaren. Vi använde LC3B:s öppna läsram i full längd mellan β-aktin och dNGLUC för att kunna övervaka LC3B-klyvning17,18,19. Även om utsöndringsmekanismen för dNGLUC är dåligt förstådd, är den specifik för övervakning av ATG4B-aktivitet, beror inte på övergripande autofagi som den förekommer i ATG5 knockout-celler och medieras av icke-konventionella mekanismer som inte kräver en klassisk signalpeptid 4,18,19. Vi har framgångsrikt använt denna reporter för att screena små molekyler och siRNA-bibliotek, och har identifierat nya regulatorer av ATG4B-aktivitet, såsom Akt-proteinkinaserna8. Denna uppsats beskriver ett detaljerat protokoll för användning av denna luciferasrapportör i ett halvautomatiserat screeningformat med hög genomströmning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Analysprocessen beskrivs i figur 1. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och utrustning som används i detta protokoll.
1. Produktion av retrovirus
OBS: Plasmiden som kodar för ActinLC3dNGLUC är pMOWS-ActinLC3dNGLUC20. Använd ett lågt passageantal celler för produktion av virus med hög titer (helst mindre än P20).
- Odling HEK293T celler i Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin/streptomycin (P/S) vid 37 °C i en befuktad inkubator, med en atmosfär på 5 % CO2 tills de är 80 % -90 % sammanflytande före sådd för transfektion.
- Dagen före transfektionen, frö cellerna i en 6-hålsplatta med en densitet av 1 × 106 celler/brunn i 2 ml/brunn av komplett tillväxtmedium. Inkubera plattan över natten i en fuktad inkubator med en atmosfär på 5 % CO2 .
OBS: Följ tillverkarens instruktioner om du använder ett liposomalt transfektionsreagens. Detta protokoll beskriver användningen av ett icke-liposomalt baserat reagens. Innan du påbörjar transfektionen, låt DNA-transfektionsreagenset, DNA och media komma i jämvikt till rumstemperatur (~15 min). - För varje transfektion, tillsätt 200 μL serumfritt medium till 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt följande mängd plasmider i varje rör: 1 000 ng pMOWS-ActinLC3dNGLUC; 900 ng GagPol; 100 ng VSV-G.
OBS: Mängden plasmider och medievolym som anges här är för en 12-hålsplatta. Om du använder en annan platttyp, justera medievolymen och plasmidmängderna för att nå den slutliga koncentrationen på 5 ng/μL överföringsplasmid, 4.5 ng/μL packningsplasmid och 0.5 ng/μL kuvertplasmid. Använd vilken packningsplasmid som helst som innehåller gag- och pol-uttryckande gener, och vilken höljeplasmid som helst som innehåller den VSV-G-uttryckande genen. - Vred injektionsflaskan med DNA-transfektionsreagens i 30 s. Pipettera 4 μl av transfektionsreagenset direkt i mediet som innehåller det utspädda DNA:t. Blanda försiktigt genom att försiktigt tippa röret.
OBS: Rör inte vid plaströrens väggar med spetsarna. Pipettera inte upp och ner eller virvla. - Inkubera reaktionen i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Under inkubationen av reaktionen avlägsnas det gamla mediet från 6-hålsplattan och ersätts med 2 ml/brunn färskt serumfritt medium.
- Tillsätt varje transfektionskomplex till varje brunn på ett droppvis sätt.
- Skaka eller snurra plattan försiktigt för att säkerställa en jämn fördelning över hela brunnsytan.
- Inkubera plattan över natten vid 37 °C i en fuktad inkubator med en atmosfär på 5 % CO2 .
- Efter 24 timmar, byt ut det gamla mediet mot ett nytt komplett medium (2 ml/brunn) och sätt tillbaka cellerna i den befuktade inkubatorn med en atmosfär på 5 % CO2 i 72 timmar.
- Efter 72 timmar skördar du supernatanten i ett 50 ml koniskt rör och centrifugerar i 10 minuter vid 4 000 × g vid 4 °C för att avlägsna döda celler och skräp. För ytterligare rening, använd en stor 60 ml spruta för att passera supernatanten genom ett 0,20 μm filter. Bered omedelbart 300 μL engångsalikvoter och förvara vid -80 °C.
OBS: Undvik en frys-upptiningscykel för att bibehålla maximal produktaktivitet.
2. Retroviral transduktion
- Dagen före transducering av cellerna, frö målcellerna vid en medelhög densitet (PANC1 vid 1 × 10 5 celler/brunn) i en 12-brunnsplatta i 1 ml/brunn medium kompletterat med 10 % FBS och 1 % P/S. Inkubera plattan över natten vid 37 °C i en befuktad inkubator med en atmosfär på5 % CO2 .
OBS: Den bästa celltätheten måste fastställas i förväg, eftersom olika celltyper har olika fästförmåga. Använd helst en celldensitet för att få 40%-50% sammanflöde. - Ta ut de frysta retrovirusalikvoter ur frysen på -80 °C och tina på is före varje användning.
OBS: Frys inte in oanvända alikvoter igen. - Bered en blandning av viral supernatant och polybrene i ett 50 ml koniskt rör med en slutlig koncentration på 8 μg/ml.
OBS: De efterföljande volymerna gäller för transduktion av en 12-hålsplatta som innehåller en slutlig volym på 500 μL/brunn. Den slutliga virala supernatantvolymen kan uppskattas genom att testa en rad virusutspädningar i närvaro av polybrene. Högre eller lägre spädningar kan användas beroende på de önskade uttrycksnivåerna för transgenen och storleken på det kärl som används. - Ta bort det gamla mediet från 12-hålsplattan och tillsätt 500 μL av blandningen till varje brunn. Inkubera cellerna med den virala supernatanten över natten vid 37 °C i en fuktad inkubator med en atmosfär på 5 % CO2 .
OBS: Behåll två brunnar med komplett medium (ingen viral supernatant) för att använda som kontroll för urval. - Ersätt det virusinnehållande mediet med färskt helodlingsmedium (1 ml/brunn). Sätt tillbaka cellerna i den befuktade inkubatorn med en atmosfär på 5 % CO2 i 48 timmar.
3. Gemensamt urval och upprätthållande av populationer
- Ersätt odlingssubstratet med ett selektionsmedium (komplett odlingsmedium med en slutlig koncentration på 1 μg/ml puromycin). Övervaka cellernas tillväxt och byt markeringsmedia var 2-3:e dag. Vid sammanflöde, expandera till en skål med 6 brunnar och sedan till en vävnadsodlingsskål med en diameter på 10 cm.
- Förvara cellerna i ett selektionsmedium minst så länge som det tar för kontrollcellerna (otransducerade) att dö helt.
OBS: För lyckade resultat rekommenderas att optimala koncentrationer av puromycin bestäms innan det experimentella projektet inleds. För detta, generera en puromycin-avlivningskurva för att bestämma den minsta koncentration som krävs för att döda otransducerade celler mellan 3 och 10 dagar. - När cellerna växer i urvalsmediet, expandera cellerna på kompletta odlingssubstrat och frys in alikvoter för det experimentella projektet.
ANM.: Anteckna passagenumret och undvik att arbeta med poolade populationer från frysta bestånd med passagenummer som är högre än fem. Kontrollera regelbundet om det finns mykoplasmakontaminering innan du utför analysen. Använd helst en ny cellsats före varje analys för att få maximal signal av luciferas. - Behåll cellerna i selektionsmedium och frö tillräckligt många celler för att nå önskad densitet dagen före analysen.
4. Tillsats av föreningar
Notera: Selleckchems bibliotek av små molekyler består av cirka 4 000 föreningar ordnade i åtta rader och 10 kolonner i femtio 96-brunnars plattor vid en stamkoncentration av 10 mM i dimetylsulfoxid (DMSO).
- Alikvot 30 μl förening i lämplig brunn på en strålskyddsplatta som är kompatibel med en akustisk vätskedispenser i nanoskala. Använd en 384-brunnars polypropenplatta (384PP-platta). Förvara dessa plattor förseglade och förvarade vid -20 °C.
OBS: Screeningprotokollet som beskrivs här är för totalt 10 analysplattor per dag; En fast koncentration på 10 μM användes som slutlig analyskoncentration tillsammans med en inkubationstid på 24 timmar. - Tina de sammansatta biblioteksplattorna i rumstemperatur.
OBS: Se till att plattan är helt tinad och i jämvikt till rumstemperatur. En temperaturgradient över plattan kan påverka vätskehanteringen. - Dispensera 50 nL/brunn i en 384-brunnars analysplatta med hjälp av en akustisk vätskedispenser i nanoskala.
OBS: Se till att de valda käll- och destinationsplattorna i programmet matchar de som används för detta steg. - Skapa ett dispenseringsprogram på ett kalkylblad.
- Öppna programvaran.
- Öppna ett nytt protokoll. På fliken Protokoll väljer du följande alternativ: Sample plattformat, 384PP; Typ av provplatta, 384PP_DMSO2; och typ av destinationsplatta, CellCarrier-384 Ultra PN (Figur 2A).
- Under Plocklista väljer du importalternativet (Figur 2B) för att importera kalkylbladet som innehåller dispenseringsprogrammet (Figur 2C).
- Välj alternativet Kör protokoll (bild 2D), kontrollera om informationen som visas är korrekt och klicka på Kör.
- I det nya fönstret som heter Körstatus (Figur 2E), klicka på Start och följ stegen som visas i promptfönstren (Figur 2F,G).
5. Sådd av celler
- Trypsinisera cellerna från en cellodlingskolv eller cellkulturpetriskålar och neutralisera trypsinet genom att tillsätta FBS-innehållande media.
- Överför cellsuspensionen till ett 50 ml koniskt rör och centrifugera vid 390 × g i 5 minuter vid rumstemperatur. Ta sedan försiktigt bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml komplett odlingsmedium.
- Utför cellräkning.
- Bered cellsuspensionen med 4,6 × 107 celler i 230 ml komplett odlingssubstrat.
OBS: Denna volym och celldensitet är för 10x 384-brunnars analysplattor plus en dödvolym på två 384-brunnars plattor. - Fördela 50 μl cellsuspension i varje brunn på en 384-håls analysplatta, beredd enligt sektion 4.
OBS: Cellsådd kan göras antingen manuellt eller med hjälp av en bulkdispenser. - Inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator med en atmosfär på 5 % CO2 i 24 timmar.
6. Skörd av den cellulära supernatanten
OBS: Vätskehanteringsrobotplattformen som används här utför vätskehantering med en flerkanalig arm för 96-spetsar. Om ingen vätskehanteringsautomatisering finns tillgänglig kan protokollet anpassas till lågkapacitetsformat med hjälp av flerkanalspipetter.
- Konfigurera däcket för labbautomatiseringsarbetsstationen enligt bild 3.
- Placera engångsbunten med 96 spetsar på position P1 (Figur 3A).
OBS: Varje 96-spetsstack består av åtta engångsställ. När du använder en flerkanalsarm för 96-spetsar är 384-hålsplattan uppdelad i fyra kvadranter. Således är varje spetsstapel tillräcklig för att överföra supernatanten från två analysplattor till två tomma, solid-svarta, 384-hålsplattor. Hela spetsstapeln måste bytas ut efter varje körning av två plattor. - Placera analysplattorna på positionerna P2 och P4 (figur 3A).
- Placera de tomma, helsvarta plattorna med 384 brunnar på positionerna P3 och P5 (figur 3A).
OBS: Denna flexibla och kapabla robotplattform har anpassats för denna analys och ett speciellt program har skrivits (Figur 3B). - Få tipsen från position P1.
- Aspirera 10 μl supernatant från plattan i position P2 och överför den till den tomma, helsvarta plattan i position P3.
OBS: Spetsarna bör placeras på lämpligt djup inuti brunnarna för att aspirera supernatanten utan att störa cellmonolagret i botten av brunnen. - Släpp spetsarna i avfallet på position P6 (Figur 3A).
- Upprepa steg 6.5-6.7 för de återstående brunnarna på plattan i position P2 och upprepa sedan samma steg för att överföra supernatanten från position P4 till position P5.
OBS: Var noga med att samla upp supernatanten och fördela på motsvarande brunnar i den tomma, solid-svarta plattan (Figur 3C,D). Eftersom utsöndrat dNGLUC är mycket stabilt i cellodlingsmedium kan plattorna förseglas och förvaras i upp till 7 dagar vid 4 °C i mörker.
7. Luciferas-analys
OBS: dNGLUC som används i reportern uppvisar flashkinetik med snabbt signalförfall. På grund av den snabba minskningen av luminiscensen efter tillsats av substrat (coelenterazin) bör plattläsaren ställas in för att mäta luminiscenssignalen i supernatanterna; Injicera substratet i en brunn och läs av den brunnen efter några sekunder. Använd därför en plattläsare som kan övervaka luminiscens och som är utrustad med en substratinjektor för att säkerställa att tiden mellan injektions- och avläsningsstegen är enhetlig för alla prover. Inställningarna som används på plattläsaren finns i figur 4.
- Bered naturligt coelenterazin som en stamlösning på 1 mg/ml i surgjord metanol (10 μl 3 M HCl till 1 ml metanol).
OBS: Följ lokala hälso- och säkerhetsriktlinjer angående hantering av metanol i labbet och undvik kontakt med huden. Bered den färska arbetssubstratlösningen innan analysen påbörjas. - Initiera injektorpumpen (Figur 5A).
- Skölj slangen med avjoniserat vatten (Figur 5B-D).
- Skölj slangen med metanol.
- Medan du sköljer slangen, förbered den fungerande substratlösningen genom att späda substratet 1:100 (för en 384-hålsplatta, tillsätt 220 μL från substratstamlösningen till 21.8 ml 1x fosfatbuffrad koksaltlösning [PBS]).
- Skölj slangen med underlagets arbetslösning (Figur 5B-D).
- Ladda plattan i läsaren och starta mätningen med inställningarna som beskrivs i figur 4.
- Upprepa steg 7.6-7.7 för alla analysplattor.
- När du är klar med alla analysplattor, skölj slangen med metanol.
- Skölj slangen med avjoniserat vatten.
OBS: I slutet av detta steg erhålls råa luciferasvärden som är korrelerade med den cellulära ATG4B-aktiviteten. För normalisering till cellantal är nästa steg nödvändigt genom att räkna cellantalet i varje brunn med fluorescensmikroskopi.
8. Cellfixering och färgning
OBS: Detta steg kan utföras manuellt med hjälp av en flerkanalspipett eller genom att använda en bulkdispenser.
- Fixera cellerna med 4% paraformaldehyd (i 1x PBS) i 15 min.
OBS: Följ lokala hälso- och säkerhetsriktlinjer angående hantering av paraformaldehyd i labbet och undvik kontakt med huden. Utför detta steg i en säkerhetshuv om möjligt. - Tvätta tre gånger med 1x PBS.
- Färga kärnorna med Hoechst 33342 utspädd 1:5 000 i 1x PBS i 15 minuter.
- Tvätta tre gånger med 1x PBS.
9. Insamling av bilder
OBS: Utför bildinsamling med ett automatiserat mikroskop. Som ett alternativ till bildtagning för att bestämma antalet celler kan den intracellulära luciferasaktiviteten också bestämmas. Det finns för- och nackdelar med avseende på om man normaliserar till cellantal eller till intracellulär luciferasaktivitet, vilket diskuteras nedan. Vi finner att bestämning av cellantal är mindre invasivt och resulterar i lägre variabilitet än bestämning av intracellulära luciferasvärden.
- Starta operativsystemet för mikroskopet (Figur 6).
- På fliken Inställningar väljer du rätt fördefinierad plåttyp. Om plåttypen inte är förinställd anger du plåtmåtten manuellt.
- Ladda plattan i mikroskopet genom att klicka på alternativet Mata ut och ladda .
- Välj sedan målet 20x Air (numerisk bländare [NA]: 0,4).
OBS: Se till att objektivkragen är inställd på rätt värde, vilket möjliggör korrekt fokus med olika platttyper. - Under Kanalval väljer du Hoechst 33342.
OBS: Kanalinställningarna för tid, effekt och höjd måste optimeras enligt vilken platttyp som används. - På Definiera layout väljer du alla brunnar från plattan och fyra fält från brunnen.
- På Onlinejobb väljer du motsvarande mapp för att överföra data till analysprogrammet.
10. Bildanalys
OBS: Alla bildanalysprogram kan användas för att segmentera och räkna cellkärnor från de insamlade bilderna. Här beskriver vi stegen för att använda en specifik onlineprogramvara som är kompatibel med flera automatiserade mikroskopfiler.
- Starta programvaran för bildanalys.
- Gå till fliken Bildanalys för att starta bildsegmenteringen (Figur 7A).
- På fliken Indatabild klickar du på + -tecknet för att lägga till ett nytt byggblock (bild 7A).
- I listan väljer du alternativet Hitta kärnor (Figur 7A) och väljer Hoechst 33342 som kanalalternativ (Figur 7B).
- Inspektera de segmenterade objekten på bilden visuellt och välj den mest exakta segmenteringsmetoden.
OBS: För det här experimentet använde vi metod C (figur 7C). Varje metodalternativ har underkategorier som kan justeras för att få bästa möjliga segmentering. - Klicka sedan på fliken Definiera resultat (Figur 7C) och välj Standardutdata som metodalternativ .
- Från underkategorin väljer du Kärnornas antal objekt och Antal objekt (Figur 7C).
- Spara analyspipelinen med alternativet Spara analys på disk eller Spara analys i databas .
- Under fliken Batchanalys väljer du de data som ska analyseras från trädet.
- Under Metod väljer du den analyspipeline som sparades i steg 10.8.
OBS: Det är också möjligt att ladda upp en skriptfil utanför den refererade programvaran eller ladda upp en befintlig analys som sparats i databasen. - Klicka på Kör analys för att starta analysen (Figur 7D). I slutet av det här arbetsflödet genereras två datauppsättningar: råa luciferasvärden från supernatanterna och cellnumret i varje brunn. Använd båda för att normalisera luciferasvärdet per cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en tidigare publikation8 använde vi framgångsrikt denna analys för att screena små molekyler och siRNA-bibliotek och identifierade nya regulatorer av ATG4B. Här beskriver vi protokollet och de representativa resultaten för denna luciferasrapportör i ett halvautomatiserat screeningformat med hög genomströmning. Figur 8 visar ett exempel på rådataanalys för både cellkärnor och luminiscens. Ett typiskt resultat av en luminiscensmätning visas i figur 8A. Den basala luminiscenssignalen från DMSO kan ses i kolumn 1 och i närvaro av 10 μM av ATG4B-hämmaren FMK9A i kolumn 24. Kärnräkningen från samma platta kan ses i figur 8B. Råvärden för varje förening normaliserades till neutrala kontrollmedelvärden för att erhålla procentandelen ATG4B-aktivitet och cellöverlevnad (Figur 9A,B). Som förväntat hade de flesta föreningar ingen effekt på ATG4B-aktiviteten, vilket indikeras av värden nära basalluminiscensen från den negativa kontrollen (DMSO - kolumn 1). Z'-faktorn, som är ett kvalitetsindex för screening med hög genomströmning, beräknades med hjälp av ekvation (1):
Z' = 1 - (3 × 
) (1)
Där STDpos är standardavvikelsen för den positiva kontrollen (FMK9a), STDneg är standardavvikelsen för den negativa kontrollen (DMSO), AVGpos är medelvärdet för den positiva kontrollen och AVGneg är medelvärdet för den negativa kontrollen.
För att välja träffarna använde vi de normaliserade värdena för att beräkna en kvot som ska användas som gränsvärde för identifiering av ATG4B-hämmare. Kvoten beräknades genom att dividera ATG4B-aktiviteten för varje förening med dess cellviabilitet. Vi ansåg att kvoterna >1 indikerade möjliga ATG4B-aktivatorer och kvoterna <1 indikerade möjliga ATG4B-hämmare (Figur 9C). Vi valde ut alla föreningar med kvotvärden som liknade den positiva kontrollen FMK9A och uteslöt föreningar som var cytotoxiska.
I den här rutan valde vi ut 53 ATG4B-hämmare för att bekräfta och utvärdera deras aktivitet och toxicitet. Föreningarna testades i 10 koncentrationer som tvåfaldiga utspädningar från 100 μM till 195 nM. Cellerna som behandlades med en koncentrationsrespons gjorde det möjligt att anpassa kvantifierade data och beräkna EC50-värdena . Inhibitorernas relativa toxicitet kvantifierades med hjälp av cellviabilitetsdata. Sammantaget visade dessa resultat att detta tillvägagångssätt möjliggör identifiering av ATG4B-modulatorer.
Bild 1: Arbetsflöde för analys. Experimentet beskriver tidslinjen för generering av stabila cellinjer och ett analysarbetsflöde med hög genomströmning, som börjar med generering av stabil cellinje, screening av föreningar, mätning av luciferas, bildinsamling och dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Steg-för-steg-instruktioner för inställning av vätskehanteraren . (A) Inställningar på fliken Protokoll . (1) Välj sample plattans format och typ. (2) Välj typ av destinationsskylt. (B) Fliken Plocklista . (1) Använd importalternativet för att importera kalkylarket. (C) Fönstret Importera plocklista . (1) Välj de parametrar som ska importeras. (2) Klicka på Importera för att avsluta. (D) Protokoll som körs. (1) Klicka på ikonen Kör . (2) Promptfönster som visar köralternativet och för att starta protokollkörningen. (E) Fliken Körstatus . (1) Starta protokollet. (F) Promptfönster för laddning av källplattan. (G) Promptfönster för att ladda destinationsskylten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Konfiguration av vätskehanteringsrobot . (A) Konfiguration av Tecan-däcket. (P1) Position för 50 μL engångsspetsstapeln. (P2,P4) Positioner för analysplattan. (P3,P5) Positioner för de tomma, helsvarta plattorna med 384 brunnar. (P6) Position för kassering av de använda spetsarna. (B) Skärmdump av analysskriptet. (C) Skärmdump av MAC96-aspiratdetaljerna. (1) Välj aspirationsvätskeklass. (2) Ange volymen för aspiration. (3) Välj brunnspositioner för aspiration. (D) Skärmdump av MAC96-dispenseringsdetaljerna. (1) Välj doseringsvätskeklass. (2) Ange volymen för dispensering. (3) Välj samma brunnspositioner för dispensering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Skärmbild av inställningarna för luminiscensplattläsaren . (A) Fliken Mätinställningar . (1) Välj bländare. (2) Välj avstånd, tid och korrigeringsfaktor. (B) Allmänna inställningar för protokoll. (1) Välj typ av platta. (2) Välj mätläge. (3) Välj antalet analysplattor. (C) Dispensera mätinställningar. (1) Välj mått. (2) Ställ in mättiden. (3) Välj pump, utmatningshastighet och volym. (4) Definiera dispenseringsordningen och tallriksupprepningen. (D) Fliken Brunnsval. (1) Välj de brunnar som ska mätas. (2) Starta mätprotokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Skärmdump av dispenserkontrollen för luminiscensplattläsaren . (A) Fliken Initiering . (1) Välj pumpen. (2) Starta pumpen. (B) Sköljprotokollalternativ. (1) Välj sköljalternativet. (2) Klicka på nästa för att gå till inställningar. (C) Inställningsalternativ för sköljfliken . (1) Välj pump. (2) Välj spetsfästet. (3) Klicka på nästa för att gå till nästa flik. (D) Flik för att starta sköljningen. (1) Klicka på start för att starta sköljprotokollet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Skärmbild av den automatiserade programvaran för mikroskopavbildning med högt innehåll. Detaljer om de inställningar som används för bildhämtning. (1) Fliken Inställningar . (2) Välj plåttyp. (3) Välj Mata ut för att ladda plattan i mikroskopet. (4) Välj mål. (5) Lägg till kanalen. (6) Välj mappen för att överföra data till Columbus-programvaran. (7) Välj brunnar. (8) Välj fält. (9) Klicka på fliken Kör experiment för att starta bildhämtningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Bildanalys på onlineprogramvara. (A) Fliken Bildanalys. (1) Klicka på + för att lägga till ett byggblock. (2) Välj alternativet Hitta kärnor. (B) Hitta Nuclei-inställningar. (1) Välj kanal. (2) Välj segmenteringsmetod. (C) Fliken Definiera resultat. (1) Välj Standard Output. (2) Välj det alternativ som ska visas som resultat. (D) Bildanalys. (1) Fliken Batchanalys. (2) Välj mått. (3) Välj analysmetod. (4) Starta bildanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Representativa bilder från luciferasmätningar och antal kärnor . (A) Luciferas relativa intensitetsvärden från en 384-håls analysplatta representerad av siffror och färger. (B) Resultat av bildanalys. (1) Värmekarta över antalet objekt i kärnorna. (2) Tabell som visar resultaten för varje brunn. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Representativa resultat efter datanormalisering. (A) Representativ ATG4B-aktivitetsprocent efter datanormalisering till medelvärdet för ATG4B-aktivitet från brunnar med negativ kontroll (DMSO) inom samma platta. Aktivatorer visas i rött och inhibitorer i blått, där vitt indikerar ingen signifikant förändring i aktivitet. Negativ kontroll (DMSO) finns i kolumn 1 och positiv kontroll (FMK9A) finns i kolumn 24. (B) Representativ cellviabilitet i procent efter datanormalisering till medelcellantal från brunnar med negativ kontroll (DMSO) inom samma platta. Proliferation visas i grönt och toxicitet i rött, där gult indikerar ingen signifikant förändring av cellviabiliteten. Negativ kontroll (DMSO) finns i kolumn 1 och positiv kontroll (FMK9A) finns i kolumn 24. C) Fördelning av föreningar enligt kvotvärdet. Varje punkt representerar en förening. Kvoten beräknades genom att dividera ATG4B-aktiviteten med cellviabiliteten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en cellbaserad reporter-genanalys för identifiering av ATG4B-hämmare. Identifieringen av primära träffar baseras på luciferasaktivitet vid behandling av celler som uttrycker LC3B:s öppna läsram i full längd mellan β-aktin och dNGLUC. Några fördelar med denna analys är att den är känslig, mycket kvantitativ och icke-invasiv, eftersom den kan detektera dNGLUC utan att lysera cellerna. Denna artikel presenterar ett detaljerat protokoll för att generera en stabil cellinje och en primär screening. Det finns några viktiga steg i protokollet.
För det första använde protokollet som beskrivs här PANC1-cellinjen, som uppvisar en hög transfektionseffektivitet och hög spridningsförmåga. Denna screeningmetod kan utföras med andra cellinjer, men transduktionseffekten kan variera från en cellinje till en annan. För det andra bör man undvika att arbeta med stabila cellpopulationer från frysta bestånd med passagetal högre än fem, eftersom rapportörens uttrycksnivåer kan minska med tiden. För det tredje är det viktigt att använda en ny cellsats före varje analys för att få maximal och konsekvent signal av luciferas inom olika experiment. För det fjärde, vid sådd av cellerna, antingen manuellt eller med hjälp av en bulkdispenser, måste cellsuspensionen ständigt röras om för att uppnå en homogen celldensitet i hela plattan. För det femte, när supernatanten skördas från brunnen, är det viktigt att spetsarna är placerade på ett lämpligt djup inuti brunnarna för att aspirera supernatanten utan att störa cellmonolagret på botten av brunnen. Slutligen bör substratarbetslösningen beredas på analysdagen. Coelenterazin är mycket ljuskänsligt och utsatt för oxidation, och det finns vissa rapporter om snabbt substratsönderfall efter beredning.
Ett antal cellbaserade analyser finns tillgängliga för att undersöka konsekvenserna av ATG4B-hämning eller aktivering, men att undersöka den cellulära aktiviteten hos ATG4B är fortfarande begränsat4. Denna metod är icke-invasiv, mycket känslig, robust och direkt beroende av ATG4B-aktivitet, eftersom dess aktivitet resulterar i frisättning av dNGLUC. Det beskrivna protokollet är enkelt och kräver endast en kort tid för att sikta 10x 384-brunnars plattor. En annan fördel med metoden är att den kan användas för att övervaka ATG4B-aktivitet in vivo, eftersom dNGLUC är mycket stabilt och kan mätas ex vivo från serum.
Även om vi framgångsrikt har använt denna reporter för att screena små molekyler och siRNA-bibliotek och identifierat nya regulatorer för ATG4B-aktivitet, finns det några begränsningar att ta hänsyn till i detta protokoll. För det första förlitar sig den beskrivna cellbaserade analysen på en rapportavläsning som indirekt återspeglar förändringar i ATG4B-aktivitet, vilket möjliggör detektion av både hämmare och aktivatorer av ATG4B-aktivitet. Träffarna bör därför utvärderas ytterligare så att deras specificitet och aktivitet valideras. Dessutom bör inhibitorer utvärderas ytterligare i sin förmåga att reglera den rumsliga fördelningen av LC3 i celler eller andra autofagirelaterade proteiner. För det andra, även om denna analys lätt kan modifieras till en mindre analys på grund av dess enkla hantering och dataanalys, kräver den en viss automatisering för substrattillsats och efterföljande luminiscensmätning. För det tredje, eftersom mekanismen för dNGLUC-frisättning är dåligt förstådd på molekylär nivå, kan föreningar som stör delar av sekretionsvägen påverka resultaten. Slutligen kan cellviabiliteten också bestämmas av den intracellulära luciferasaktiviteten. Även om vi finner att bestämning av cellantal är mindre invasivt och resulterar i lägre variabilitet än att bestämma intracellulära luciferasvärden, begränsar bestämning av cellantal deras användning för mindre forskningslaboratorier eftersom de utgör svårigheter när det gäller bildutrustning, programvara för dataanalys och datalagring. Sammantaget möjliggör den utvecklade cellbaserade reporter-genanalysen identifiering av ATG4B-hämmare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av UK Medical Research Councils kärnfinansiering till MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (anslagsreferens 2018RIF_15) och UCL Therapeutic Acceleration Support-programmet, med stöd av finansiering från MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Plasmiden som kodar för ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) erhölls från Dr. Robin Ketteler (Institutionen för humanmedicin, Medical School Berlin).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
References
- Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
- Fu, Y., et al.
- Towers, C. G., Thorburn, A.
- Agrotis, A., Ketteler, R. On ATG4B as drug target for treatment of solid tumours-the knowns and the unknowns. Cells. 9 (1), 53 (2019).
- Levy, J. M. M., Towers, C. G., Thorburn, A.
- Kimmelman, A. C., White, E.
- Tran, E., et al. Context-dependent role of ATG4B as target for autophagy inhibition in prostate cancer therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (4), 726-731 (2013).
- Pengo, N., et al. Identification of kinases and phosphatases that regulate ATG4B activity by siRNA and small molecule screening in cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 148 (2018).
- Kauffman, K. J., et al. Delipidation of mammalian Atg8-family proteins by each of the four ATG4 proteases. Autophagy. 14 (6), 992-1010 (2018).
- Tanida, I., Sou, Y. -S., Minematsu-Ikeguchi, N., Ueno, T., Kominami, E. Atg8L/Apg8L is the fourth mammalian modifier of mammalian Atg8 conjugation mediated by human Atg4B, Atg7 and Atg3. The FEBS Journal. 273 (11), 2553-2562 (2006).
- Agrotis, A., Pengo, N., Burden, J. J., Ketteler, R. Redundancy of human ATG4 protease isoforms in autophagy and LC3/GABARAP processing revealed in cells. Autophagy. 15 (6), 976-997 (2019).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. The Journal of Cell Biology. 215 (6), 857-874 (2016).
- Ketteler, R., Tooze, S. A.
- Zhang, L., Li, J., Ouyang, L., Liu, B., Cheng, Y. Unraveling the roles of Atg4 proteases from autophagy modulation to targeted cancer therapy. Cancer Letters. 373 (1), 19-26 (2016).
- Fernández, ÁF., López-Otín, C. The functional and pathologic relevance of autophagy proteases. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 33-41 (2015).
- Maruyama, T., Noda, N. N. Autophagy-regulating protease Atg4: structure, function, regulation and inhibition. The Journal of Antibiotics. 71 (1), 72-78 (2017).
- Ketteler, R., Seed, B. Quantitation of autophagy by luciferase release assay. Autophagy. 4 (6), 801-806 (2008).
- Ketteler, R., Sun, Z., Kovacs, K. F., He, W. -W., Seed, B. A pathway sensor for genome-wide screens of intracellular proteolytic cleavage. Genome Biology. 9 (4), 64 (2008).
- Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15, 14 (2014).
- Ketteler, R., Glaser, S., Sandra, O., Martens, U. M., Klingmüller, U. Enhanced transgene expression in primitive hematopoietic progenitor cells and embryonic stem cells efficiently transduced by optimized retroviral hybrid vectors. Gene Therapy. 9 (8), 477-487 (2002).
