تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus
Summary
هنا ، نقدم طريقة تنقية تقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus وهي بسيطة وغير مكلفة وفعالة.
Abstract
إنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus (sFE) هو عامل تحلل الفيبرين الجديد الذي يمكنه تنشيط البلازمينوجين إلى بلازمين وتحلل الفيبرين مباشرة ، مما يظهر مزايا كبيرة على عوامل التخثر التقليدية. ومع ذلك ، نظرا لنقص المعلومات الهيكلية ، تعتمد جميع برامج تنقية sFE على عمليات تنقية كروماتوغرافية متعددة الخطوات ، وهي معقدة ومكلفة للغاية. هنا ، تم تطوير بروتوكول تنقية التقارب من sFE لأول مرة بناء على بنية بلورية من sFE. ويشمل تحضير العينة الخام وعمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين / أرجينين – أغاروز ، وتنقية التقارب ، وتوصيف sFE المنقى. بعد هذا البروتوكول ، يمكن تنقية مجموعة من sFE في غضون 1 يوم. علاوة على ذلك ، تزداد نقاء ونشاط sFE المنقى إلى 92٪ و 19200 وحدة / مل ، على التوالي. وبالتالي ، هذا نهج بسيط وغير مكلف وفعال لتنقية sFE. تطوير هذا البروتوكول له أهمية كبيرة لمواصلة استخدام sFE وغيرها من العوامل المماثلة.
Introduction
يشكل تجلط الدم تهديدا كبيرا للصحة العامة ، خاصة بعد جائحة Covid-19 العالمية 1,2. سريريا ، تم استخدام العديد من منشطات البلازمينوجين (PAs) ، مثل منشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة (tPA) و urokinase (المملكة المتحدة) ، على نطاق واسع كأدوية للتخثر. يمكن للمناطق المحمية تنشيط بلازمينوجين المرضى إلى بلازمين نشط لتحلل الفيبرين. وبالتالي ، فإن كفاءتها في التخثر مقيدة بشدة بحالة البلازمينوجين للمرضى 3,4. عوامل تحلل الفيبرين ، مثل بلازمين ميتالوبروتيناز وبلازمين سيرين ، هي نوع آخر من أدوية التخثر السريرية التي تشمل أيضا إنزيمات تحلل الفيبرين (FE) مثل البلازمين ، والتي يمكنها إذابة الجلطات مباشرة ولكن يتم تعطيلها بسرعة بواسطة مثبطات البلازمين المختلفة5. بعد ذلك ، تم الإبلاغ عن نوع جديد من عوامل تحلل الفيبرين يمكنه إذابة الجلطة ليس فقط عن طريق تنشيط البلازمينوجين إلى بلازمين ولكن أيضا عن تدهور الفيبرين مباشرة 6-إنزيم تحلل الفيبرين من دودة الفول السوداني القديمة Sipunculus nudus (sFE)6. تمنح هذه الوظيفة الثنائية مزايا أخرى على أدوية التخثر التقليدية ، خاصة من حيث حالة البلازمينوجين غير الطبيعية. بالمقارنة مع عوامل تحلل الفيبرين ثنائية الوظيفةالأخرى 7،8،9 ، يعرض sFE العديد من المزايا ، بما في ذلك السلامة ، على العوامل غير المشتقة من الأغذية لتطوير الأدوية ، وخاصة بالنسبة للأدوية الفموية. وذلك لأن السلامة البيولوجية والتوافق الحيوي ل Sipunculus nudus كانت راسخة10.
على غرار العوامل الطبيعية الأخرى المحللة للفبرين المعزولة من الكائنات الحية الدقيقة وديدان الأرض والفطر ، فإن تنقية sFE من S. nudus معقدة للغاية وتتضمن مراحل متعددة ، مثل تجانس الأنسجة ، وترسيب كبريتات الأمونيوم ، وتحلية المياه ، وكروماتوغرافيا تبادل الأنيون ، وكروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء ، والغربلة الجزيئية10،11،12. لا يعتمد نظام التنقية هذا على المهارات المتقنة والمواد باهظة الثمن فحسب ، بل يتطلب أيضا عدة أيام لإكمال الإجراء بأكمله. لذلك ، فإن برنامج تنقية بسيط من sFE له أهمية كبيرة لمزيد من التطوير ل sFE. لحسن الحظ ، بلورتان من sFE (PDB: 8HZP ؛ PDB: 8HZO) بنجاح (انظر الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2). من خلال التحليل الهيكلي وتجارب الالتحام الجزيئي ، وجدنا أن النواة التحفيزية ل sFE يمكن أن ترتبط على وجه التحديد بالأهداف التي تحتوي على بقايا الأرجينين أو اللايسين.
هنا ، تم اقتراح نظام تنقية التقارب لأول مرة ، بناء على البنية البلورية ل sFE. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن تنقية sFE عالي النقاء والنشط للغاية من المستخلصات الخام في مرحلة تنقية تقارب واحدة. البروتوكول الذي تم تطويره هنا ليس مهما فقط لإعداد sFE على نطاق واسع ، ولكن يمكن تطبيقه أيضا لتنقية عوامل تحلل الفيبرين الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا لعدم توفر التسلسل الجيني الدقيق ل sFE ، تم استخراج sFE المستخدم حاليا من S. nudus14 الجديد. علاوة على ذلك ، كانت إجراءات تنقية sFE المبلغ عنها في الأدبيات معقدة ومكلفة ، لأنها استندت إلى بعض السمات العامة ل sFE ، مثل الوزن الجزيئي ، والنقطة متساوية الكهربية ، والقوة الأيونية ، و…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (3502Z20227197) ومكتب العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة فوجيان (رقم 2019J01070 ، رقم 2021Y0027).
Materials
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -. H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019)
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
