Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2
1Medicine School, Huaqiao University, 2Engineering Research Centre of Molecular Medicine of Ministry of Education

Summary

هنا ، نقدم طريقة تنقية تقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus وهي بسيطة وغير مكلفة وفعالة.

Abstract

إنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus (sFE) هو عامل تحلل الفيبرين الجديد الذي يمكنه تنشيط البلازمينوجين إلى بلازمين وتحلل الفيبرين مباشرة ، مما يظهر مزايا كبيرة على عوامل التخثر التقليدية. ومع ذلك ، نظرا لنقص المعلومات الهيكلية ، تعتمد جميع برامج تنقية sFE على عمليات تنقية كروماتوغرافية متعددة الخطوات ، وهي معقدة ومكلفة للغاية. هنا ، تم تطوير بروتوكول تنقية التقارب من sFE لأول مرة بناء على بنية بلورية من sFE. ويشمل تحضير العينة الخام وعمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين / أرجينين - أغاروز ، وتنقية التقارب ، وتوصيف sFE المنقى. بعد هذا البروتوكول ، يمكن تنقية مجموعة من sFE في غضون 1 يوم. علاوة على ذلك ، تزداد نقاء ونشاط sFE المنقى إلى 92٪ و 19200 وحدة / مل ، على التوالي. وبالتالي ، هذا نهج بسيط وغير مكلف وفعال لتنقية sFE. تطوير هذا البروتوكول له أهمية كبيرة لمواصلة استخدام sFE وغيرها من العوامل المماثلة.

Introduction

يشكل تجلط الدم تهديدا كبيرا للصحة العامة ، خاصة بعد جائحة Covid-19 العالمية 1,2. سريريا ، تم استخدام العديد من منشطات البلازمينوجين (PAs) ، مثل منشط البلازمينوجين من نوع الأنسجة (tPA) و urokinase (المملكة المتحدة) ، على نطاق واسع كأدوية للتخثر. يمكن للمناطق المحمية تنشيط بلازمينوجين المرضى إلى بلازمين نشط لتحلل الفيبرين. وبالتالي ، فإن كفاءتها في التخثر مقيدة بشدة بحالة البلازمينوجين للمرضى 3,4. عوامل تحلل الفيبرين ، مثل بلازمين ميتالوبروتيناز وبلازمين سيرين ، هي نوع آخر من أدوية التخثر السريرية التي تشمل أيضا إنزيمات تحلل الفيبرين (FE) مثل البلازمين ، والتي يمكنها إذابة الجلطات مباشرة ولكن يتم تعطيلها بسرعة بواسطة مثبطات البلازمين المختلفة5. بعد ذلك ، تم الإبلاغ عن نوع جديد من عوامل تحلل الفيبرين يمكنه إذابة الجلطة ليس فقط عن طريق تنشيط البلازمينوجين إلى بلازمين ولكن أيضا عن تدهور الفيبرين مباشرة 6-إنزيم تحلل الفيبرين من دودة الفول السوداني القديمة Sipunculus nudus (sFE)6. تمنح هذه الوظيفة الثنائية مزايا أخرى على أدوية التخثر التقليدية ، خاصة من حيث حالة البلازمينوجين غير الطبيعية. بالمقارنة مع عوامل تحلل الفيبرين ثنائية الوظيفةالأخرى 7،8،9 ، يعرض sFE العديد من المزايا ، بما في ذلك السلامة ، على العوامل غير المشتقة من الأغذية لتطوير الأدوية ، وخاصة بالنسبة للأدوية الفموية. وذلك لأن السلامة البيولوجية والتوافق الحيوي ل Sipunculus nudus كانت راسخة10.

على غرار العوامل الطبيعية الأخرى المحللة للفبرين المعزولة من الكائنات الحية الدقيقة وديدان الأرض والفطر ، فإن تنقية sFE من S. nudus معقدة للغاية وتتضمن مراحل متعددة ، مثل تجانس الأنسجة ، وترسيب كبريتات الأمونيوم ، وتحلية المياه ، وكروماتوغرافيا تبادل الأنيون ، وكروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء ، والغربلة الجزيئية10،11،12. لا يعتمد نظام التنقية هذا على المهارات المتقنة والمواد باهظة الثمن فحسب ، بل يتطلب أيضا عدة أيام لإكمال الإجراء بأكمله. لذلك ، فإن برنامج تنقية بسيط من sFE له أهمية كبيرة لمزيد من التطوير ل sFE. لحسن الحظ ، بلورتان من sFE (PDB: 8HZP ؛ PDB: 8HZO) بنجاح (انظر الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2). من خلال التحليل الهيكلي وتجارب الالتحام الجزيئي ، وجدنا أن النواة التحفيزية ل sFE يمكن أن ترتبط على وجه التحديد بالأهداف التي تحتوي على بقايا الأرجينين أو اللايسين.

هنا ، تم اقتراح نظام تنقية التقارب لأول مرة ، بناء على البنية البلورية ل sFE. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن تنقية sFE عالي النقاء والنشط للغاية من المستخلصات الخام في مرحلة تنقية تقارب واحدة. البروتوكول الذي تم تطويره هنا ليس مهما فقط لإعداد sFE على نطاق واسع ، ولكن يمكن تطبيقه أيضا لتنقية عوامل تحلل الفيبرين الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التحضير

  1. علاج العينة
    1. تشريح بعناية S. nudus الطازجة (100 غرام) وجمع الأمعاء والسوائل الداخلية.
    2. أضف 300 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 م ، درجة الحموضة 7.4) للتجانس (1000 دورة في الدقيقة ، 60 ثانية).
    3. تجميد ذوبان الجليد المجانس 3x.
    4. أجهزة الطرد المركزي العينة (10956 × جم ، 0.5 ساعة ، 4 درجات مئوية) وجمع المادة الطافية. قم بتخزين العينة في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
  2. ترسيب البروتين
    1. امزج المادة الطافية مع محلول كبريتات الأمونيوم المشبع (تسعة مجلدات) واترك الخليط يقف لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ومتابعته لاحقا.
    2. أجهزة الطرد المركزي (10956 × جم ، 0.5 ساعة ، 4 درجات مئوية) للحصول على راسب البروتين ؛ قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا.
  3. إعادة تعليق البروتين
    1. أعد تعليق راسب البروتين ب 30 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 M ، الرقم الهيدروجيني 7.4). قم بتخزين محلول البروتين الخام هذا في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامه لاحقا.

2. كروماتوغرافيا التقارب

  1. ترشيح الحل
    1. قم بتصفية محلول البروتين الخام من خلال غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر. احفظ هذه العينة في درجة حرارة 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا.
  2. تعبئة العمود
    1. قم بتعبئة عمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة أرجينين - أغاروز وعمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين - أغاروز عن طريق تحميل كمية مناسبة من وسط مصفوفة ليسين - أغاروز ووسط مصفوفة أرجينين - أغاروز في أعمدة كروماتوغرافيا فارغة سعة 5 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين العمود عند 2-8 درجة مئوية ، مع غمر المصفوفة في مخزن مؤقت (20٪ إيثانول).
  3. تنقية التقارب
    1. قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا التقارب مع ddH2O أولا (1 مل / دقيقة ، 10 أحجام أعمدة) ، متبوعا بالمخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 M ، pH 8.0 ، 1 مل / دقيقة ، 5 أحجام أعمدة).
    2. قم بتحميل عينة محلول البروتين على العمود المتوازن مسبقا (1 مل / دقيقة ، حجم 1/3 عمود).
      ملاحظة: يعتمد حجم تحميل العينة على تركيز sFE.
    3. اغسل العمود باستخدام المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 م ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، خمسة أحجام أعمدة).
    4. قم بتحريك العمود ب 0.15 M و 0.25 M و 0.35 M و 0.45 M و 0.55 M و 0.65 M NaCl (1 مل / دقيقة ، خمسة أحجام أعمدة) على التوالي.
    5. ابحث عن قمة الشطف التي يجب أن تظهر في شطف كلوريد الصوديوم 0.15 M ، ثم اجمع الكسور في أنابيب 5 mL.
    6. ركز عينة الشطف باستخدام مرشح طرد مركزي فائق 3 كيلو دالتون (3944 × جم ، 1.5 ساعة ، 4 درجات مئوية). قم بتخزين هذه العينة في درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

3. تقييم النقاء

  1. الصوديوم دوديسيل سلفات بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) إعداد هلام
    1. تحضير جل SDS-PAGE وفقا لطريقة ليملي باستخدام جل مركز 5٪ وجل فصل 12٪13.
  2. الكهربائي
    1. امزج العينة (15 ميكرولتر) مع مخزن مؤقت لتحميل البروتين SDS-PAGE 5x (حجم 1/4) ، وقم بتسخينه في الماء المغلي لمدة 5 دقائق ، وقم بتحميله على جل SDS-PAGE ، وقم بتشغيل الجل عند 80 فولت ، 60 مللي أمبير لمدة 1.5 ساعة.
  3. تحليل
    1. بعد الرحلان الكهربائي ، قم بتلطيخ الجل باستخدام Silver Stain Kit ، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، ولاحظ الجل الملون باستخدام نظام تصوير كيميائي.
    2. تحليل نقاء البروتين المستهدف باستخدام الصيغة التالية: نقاء البروتين المستهدف = قيمة كثافة البروتين المستهدف / قيمة كثافة البروتين الكلي.

4. تقييم نشاط تحلل الفيبرين

  1. إعداد لوحة الفيبرين
    1. تحضير محلول الفيبرينوجين عن طريق خلط 25 ملغ من الفيبرينوجين مع 1.25 مل من المياه المالحة الفسيولوجية.
    2. تحضير محلول الثرومبين عن طريق خلط 100 وحدة من الثرومبين تماما مع 1.05 مل من المحلول الملحي الفسيولوجي.
    3. تحضير محلول الأغاروز بإضافة 0.5 غرام من الأغاروز إلى 22.5 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl (0.02 مول / لتر ، درجة الحموضة 7.4). اخلطي محلول الأغاروز وسخنيه على حرارة 100 درجة مئوية حتى يذوب تماما.
    4. قم بتبريد محلول الأغاروز إلى حوالي 50 درجة مئوية وأضف محلول الفيبرينوجين. ثم ، أضف محلول الثرومبين على الفور ، واخلطه بسرعة ، واسكبه في طبق استزراع 60 مم.
  2. تحميل
    1. لكمة الآبار 3 مم على ألواح الفيبرين المعدة باستخدام حفار معقم وملء الآبار بعينات 10 ميكرولتر.
  3. تحليل
    1. بعد 18 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، قم بقياس نشاط تحلل الفيبرين عن طريق حساب حجم مناطقها المتحللة. نشاط تحلل الفيبرين = (حجم منطقة العينة / حجم منطقة يوروكيناز) × 100 وحدة حجم المنطقة = القطر × القطر.
      ملاحظة: تم استخدام المخزن الملحي الفسيولوجي والبروتين الخام (تم الحصول على العينة في خطوة البروتوكول 1.3.1) و urokinase للتحكم السلبي والتحكم الإيجابي ، على التوالي. بالمقارنة مع urokinase ، وجدنا أن النشاط التحلل للفبرين من sFE المنقى كان ~ 19200 وحدة / مل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باتباع هذا البروتوكول ، تم استخراج محللات الأنسجة الخام ، وتم بناء مصفوفة أرجينين-أغاروز وأعمدة كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة ليسين-أغاروز ، وتم الحصول على sFE المنقى ، وتم قياس النقاء والنشاط التحلل للفبرين ل sFE المنقى بواسطة SDS-PAGE وألواح الفيبرين ، على التوالي.

بعد الطرد المركزي ، كان الطافي الذي تم جمعه سائلا لزجا شفافا. بدأ هطول الأمطار عندما تم خلط هذا الطافع بمحلول كبريتات الأمونيوم المشبع (تسعة مجلدات). بعد الوقوف لمدة 12 ساعة ، تم تشكيل راسب ثقيل في قاع الأنبوب. عندما تم إعادة تعليقه باستخدام المخزن المؤقت Tris-HCl ، اختفى راسب البروتين بسرعة وذاب في المخزن المؤقت ، وظهر كسائل أصفر باهت شفاف.

عندما تم تحميل محلول البروتين على عمود تقارب مصفوفة الأرجينين والأغاروز ، ظهرت قمة واضحة (الذروة 1 ، ذروة التدفق) عند ~ 40 دقيقة وتوقفت عن الاستلال عند ~ 66 دقيقة. في مرحلة الشطف المتدرج ، عند الاستخلاص ب 0.15 M NaCl ، ظهرت قمة واضحة (الذروة 2 ، ذروة الشطف) عند ~ 94 دقيقة وتوقفت عن الاستخلاص عند ~ 110 دقيقة. لم تظهر قمم شطف واضحة في مراحل الشطف المتبقية (0.25 م ، 0.35 م ، 0.45 م ، 0.55 م ، و 0.65 م كلوريد الصوديوم) (الشكل 1 أ). في هذه الدراسة ، أعدنا استخدام عمود تقارب مصفوفة أرجينين - أغاروز حتى 10 مرات ووجدنا أن أداء العمود لم يتغير بشكل كبير.

عندما تم تحميل محلول البروتين إلى عمود تقارب مصفوفة ليسين - أغاروز ، ظهرت ذروة واضحة (الذروة 1 ، ذروة التدفق) عند ~ 38 دقيقة وتوقفت عن الاستلال عند ~ 60 دقيقة. في مرحلة الشطف المتدرج ، عند الاستخلاص ب 0.15 M NaCl ، ظهرت قمة واضحة (الذروة 2 ، ذروة الشطف) عند ~ 80 دقيقة وتوقفت عن الاستخلاص عند ~ 86 دقيقة. لم تظهر قمم شطف واضحة في مراحل الشطف المتبقية (0.25 م ، 0.35 م ، 0.45 م ، 0.55 م ، و 0.65 م كلوريد الصوديوم (الشكل 1 ب). كانت ملامح الشطف لعمود تقارب مصفوفة الأرجينين والأغاروز وعمود تقارب مصفوفة ليسين - أغاروز متشابهة. كما ذكرنا سابقا ، فإن إعادة استخدام عمود تقارب مصفوفة أرجينين - أغاروز حتى 10 مرات لم يغير أداء هذا العمود.

تمت إضافة sFE المنقى (10 ميكرولتر ، عينة ذروة الشطف ، الذروة 2) إلى لوحة الفيبرين المعدة. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام 10 ميكرولتر من اليوروكيناز (100 U) ، و 10 ميكرولتر من المحلول الملحي الفسيولوجي ، و 10 ميكرولتر من البروتين الخام (تم الحصول على العينة في الخطوة 1.3.1 من البروتوكول) للتحكم الإيجابي ، الفارغ ، والتحكم السلبي ، على التوالي. بعد 18 ساعة من الحضانة ، قدمت لوحان من الفيبرين نتائج مماثلة: ظهرت منطقة تحلل (قطرها 1.3 سم) في التحكم في اليوروكيناز. لم يلاحظ أي منطقة تحلل في المخزن الملحي الفسيولوجي ؛ ظهرت منطقة تحلل (قطرها 2.1 سم) في بئر البروتين الخام ؛ وظهرت منطقة تحلل (قطرها 1.8 سم) في بئر sFE المنقى (الشكل 2). بالمقارنة مع urokinase ، وجدنا أن النشاط التحلل للفبرين من sFE المنقى كان ~ 19200 وحدة / مل. نظرا لأنه تم تعديل عينة ذروة الشطف إلى نفس حجم عينة العينة المحملة على عمود التقارب ، يشار إلى معدل استرداد عمود التقارب بحجم (القطر × القطر) لمنطقة التحلل على لوحة الفيبرين. كان معدل استرداد عمود التقارب ~ 73.5٪.

تم استخدام البروتين الخام (العينة التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.1) و sFE المنقى (عينة ذروة الشطف ، الذروة 2) لتحليل النقاء. بعد SDS-PAGE والتلوين ، تم تقديم ثلاثة نطاقات بروتين رئيسية (25 و 26 و 27 كيلو دالتون) وستة نطاقات ثانوية (20 و 24 و 28 و 35 و 40 و 45 كيلو دالتون) في البروتين الخام. تم تقديم نطاق رئيسي واحد (27 كيلو دالتون) ونطاقين ثانويين (26 و 28 كيلو دالون) في sFE المنقى (الشكل 3). من خلال تحليل القيمة الرمادية ، وجدنا أن نقاء sFE المنقى كان مرتفعا مثل ~ 92٪.

Figure 1
الشكل 1: ملف تنقية الملاءمة . (أ) تم تنقية عينة sFE الخام عن طريق تنقية تقارب مصفوفة الأرجينين والأغاروز. ظهرت ذروة تدفق واضحة في ~ 40 دقيقة وتوقفت عن الاستخلاص عند ~ 66 دقيقة. ظهرت ذروة شطف واضحة عند ~ 94 دقيقة وتوقفت عن الاستخلاص عند ~ 110 دقيقة. (ب) تم تنقية عينة sFE الخام عن طريق تنقية تقارب مصفوفة ليسين - أغاروز. ظهرت ذروة تدفق واضحة في ~ 38 دقيقة وتوقفت عن الاستخلاص عند ~ 60 دقيقة. ظهرت ذروة شطف واضحة في ~ 80 دقيقة وتوقفت عن الاستخلاص عند ~ 86 دقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تقييم نشاط تحلل الفيبرين. تمت إضافة عينات إلى صفيحة الفيبرين وتم قياس نشاطها المحلل للفيبرين وتقييمه من خلال مناطق تحللها على اللوحة بعد 18 ساعة. يشار إلى العينات المعالجة بشكل مختلف بالأرقام العربية الحمراء. (أ) النشاط المحلل للفيبرين ل sFE المنقى بواسطة عمود تقارب مصفوفة الأرجينين والأغاروز. # 1 ، 100 U من يوروكيناز ؛ # 2 ، عازلة المياه المالحة الفسيولوجية. # 3 ، البروتين الخام (تم الحصول على العينة في الخطوة 1.3.1 من البروتوكول) ؛ # 4 ، تنقية sFE (عينة ذروة الشطف ، الذروة 2). (ب) النشاط المحلل للفيبرين ل sFE المنقى بواسطة عمود تقارب مصفوفة ليسين - أغاروز. # 1 ، 100 U من يوروكيناز ؛ # 2 ، عازلة المياه المالحة الفسيولوجية. # 3 ، البروتين الخام (تم الحصول على العينة في الخطوة 1.3.1 من البروتوكول) ؛ # 4 ، تنقية sFE (عينة ذروة الشطف ، الذروة 2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل النقاء. تم تحليل نقاء sFE المنقى بواسطة SDS-PAGE. (أ) نقاء sFE المنقى بواسطة عمود تقارب مصفوفة الأرجينين والأغاروز. M: علامة البروتين. المسار 1: البروتين الخام (تم الحصول على العينة في الخطوة 1.3.1 من البروتوكول) ؛ الحارة 2: sFE المنقى (عينة ذروة الشطف ، الذروة 2). (ب) نقاء sFE المنقى بواسطة عمود تقارب مصفوفة ليسين - أغاروز. M: علامة البروتين. المسار 1: البروتين الخام (تم الحصول على العينة في الخطوة 1.3.1 من البروتوكول) ؛ الحارة 2: sFE المنقى (عينة ذروة الشطف ، الذروة 2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: 8ZHP: التركيب البلوري ل snFPITE-n1. تقرير التحقق الهيكلي بالأشعة السينية PDB. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: 8ZHO: التركيب البلوري ل snFPITE-n2. تقرير التحقق الهيكلي بالأشعة السينية PDB. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نظرا لعدم توفر التسلسل الجيني الدقيق ل sFE ، تم استخراج sFE المستخدم حاليا من S. nudus14 الجديد. علاوة على ذلك ، كانت إجراءات تنقية sFE المبلغ عنها في الأدبيات معقدة ومكلفة ، لأنها استندت إلى بعض السمات العامة ل sFE ، مثل الوزن الجزيئي ، والنقطة متساوية الكهربية ، والقوة الأيونية ، والقطبية15,16. لم يتم الإبلاغ عن أي بروتوكول تنقية تقارب sFE حتى الآن. في هذه الدراسة ، تم تطوير بروتوكول تنقية تقارب sFE بنجاح بناء على معرفة بنيته البلورية. بالمقارنة مع طرق التنقية المبلغ عنها ، كانت طريقة تنقية التقارب هذه سهلة التشغيل وغير مكلفة وسهلة الاستخدام. علاوة على ذلك ، لوحظ معدل استرداد أعلى بكثير من sFE النشط باستخدام هذه الطريقة.

على الرغم من الإبلاغ عن العديد من طرق تنقية التقارب للإنزيمات المحللة للفيبرين ، إلا أنها استندت إلى الأجسام المضادة17 ، والمثبطات 18 ، والروابط ، والمستقبلات16. يعد تحضير هذه الأجسام المضادة والمثبطات والروابط والمستقبلات أمرا صعبا وشاقا من الناحية الفنية. علاوة على ذلك ، هناك حاجة إلى بذل جهود إضافية لاقتران هذه الجزيئات بالمصفوفة. في المقابل ، مصفوفة أرجينين-أغاروز ومصفوفة ليسين-أغاروز هي مواد تجارية ، جاهزة للاستخدام ، مستقرة للغاية ، وسهلة التوسع19. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام مصفوفة ليسين - أغاروز لتنقية تقارب البلازمينوجين20،21. ومع ذلك ، فإن البلازمينوجين هو الإنزيم المؤيد للبلازمين ، وليس شكلا نشطا15. لا يزال من غير المؤكد ما إذا كانت مصفوفة ليسين - أغاروز مناسبة لتنقية تقارب البلازمين. من الناحية النظرية ، فإن sFE المنقى باستخدام مصفوفة أرجينين-أغاروز ومصفوفة ليسين-أغاروز في هذه الدراسة هو الشكل النشط فقط ، لأن النموذج البلوري أشار إلى أن الثلاثيات التحفيزية فقط من sFE يمكن أن تتفاعل مع بقايا الأرجينين والليسين. لذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول في تنقية بلازمين سيرين الأخرى ، وتسريع تطوير أدوية بلازمين سيرين الأخرى.

نظرا لأن الارتباط بين sFE وعمود التقارب ليس قويا جدا ، فإن الحفاظ على تركيز كلوريد الصوديوم الدقيق وسرعة الشطف المناسبة أمران حاسمان للغاية لنجاح التنقية. عامل رئيسي آخر هو الرقم الهيدروجيني للنظام ، مما يؤثر بشدة على التنقية. تم تحسين هذه المعلمات الثلاثة من قبلنا. من المسلم به أن معدل استرداد sFE النشط في هذه الدراسة كان منخفضا نسبيا ، وربما كان مقيدا بسبب انخفاض عدد بقايا الأرجينين المتاحة أو بقايا اللايسين على سطح مصفوفة الأغاروز. لذلك ، يجب إطالة الرابط بين مصفوفة اللايسين / الأرجينين والأغاروز لتعزيز معدل الاسترداد. وفي الوقت نفسه ، لا يمكننا استبعاد احتمال أن يتم استخلاص بروتينات سيرين الأخرى ذات الثالوث الحفاز المماثل مثل sFE في ظل هذا النظام. لذلك ، من الأفضل إضافة تقنية تنقية تعتمد على الوزن الجزيئي ، مثل الترشيح الفائق ، لفصل بروتينات سيرين الأخرى عن sFE. وبالمثل ، يجب معالجة العديد من المشاكل الأخرى مثل تعزيز القدرة على الربط ، وإطالة العمر ، وزيادة تبسيط الإجراء في العمل المستقبلي عن طريق اتباع استراتيجيات (على سبيل المثال ، استبدال أرجينين / ليسين ببولي أرجينين / ليسين وتعديل الرابط).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (3502Z20227197) ومكتب العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة فوجيان (رقم 2019J01070 ، رقم 2021Y0027).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) Biosharp
2-Mercaptoethanol Solarbio
Agarose G-10 Biowest
Ammonium persulfate SINOPHARM
Ammonium sulfate SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B Solarbio Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB) Solarbio
Fast Silver Stain Kit Beyotime
Fibrinogen Merck
Glycine Solarbio
Hydrochloric acid SINOPHARM
Kinase RHAWN
Lysine-Sepharose 4B Solarbio Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) Beyotime
Sodium chloride SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide SINOPHARM
Thrombin Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 SANYO
Chemiluminescence Imaging System GE
Constant Flow Pump BT-100 QITE
Constant Temperature Incubator JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II SCIENTZ
Electronic Analytical Balance DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker Kylin-Bell
Ice Machine AF 103 Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner ShuMei
Magnetic Stirrer Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W Cence
Microwave Oven Galanz
Milli-Q Reference Millipore
Pipettor Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System Bio-Rad
Consumable Material 
200 µL PCR Tube (200 µL) Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL) Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL) Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL) NEST
Centrifuge Tube (7 mL) Biosharp
Culture Dish (60 mm) NEST
Filter Membrane (0.22 µm) Millex GP
Parafilm Bemis
Pipette Tip (1 mL ) KIRGEN
Pipette Tip (10 µL) Axygene
Pipette Tip (200 µL) Axygene
Special Indicator Paper TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) Millipore
Universal pH Indicator SSS Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
  2. Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
  3. von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
  4. Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
  5. Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
  6. Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
  7. Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
  8. Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
  9. Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
  10. Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
  11. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
  12. Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
  13. Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
  14. Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
  15. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
  16. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
  17. Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
  18. Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
  19. Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
  20. Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
  21. Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 196 ،
تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من <em>Sipunculus nudus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H.… More

Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus. J. Vis. Exp. (196), e65631, doi:10.3791/65631 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter