Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי מ-Sipunculus nudus

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65631
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,2
1Medicine School, Huaqiao University, 2Engineering Research Centre of Molecular Medicine of Ministry of Education

Summary

כאן, אנו מציגים שיטת טיהור זיקה של אנזים פיברינוליטי מ Sipunculus nudus שהיא פשוטה, זולה ויעילה.

Abstract

האנזים הפיברינוליטי של Sipunculus nudus (sFE) הוא סוכן פיברינוליטי חדשני שיכול גם להפעיל פלסמינוגן לפלסמין וגם לפרק פיברין ישירות, מה שמראה יתרונות גדולים על פני סוכנים טרומבוליטיים מסורתיים. עם זאת, בשל היעדר מידע מבני, כל תוכניות הטיהור עבור sFE מבוססות על טיהור כרומטוגרפיה רב-שלבית, שהם מסובכים ויקרים מדי. כאן, פרוטוקול טיהור זיקה של sFE פותח לראשונה על בסיס מבנה גבישי של sFE; הוא כולל הכנת הדגימה הגולמי ועמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ליזין/ארגינין-אגרוז, טיהור זיקה ואפיון ה-SFE המטוהר. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לטהר אצווה של sFE תוך יום אחד. יתר על כן, הטוהר והפעילות של sFE מטוהר עולה ל 92% ו 19,200 U / mL, בהתאמה. לכן, זוהי גישה פשוטה, זולה ויעילה לטיהור sFE. הפיתוח של פרוטוקול זה הוא בעל משמעות רבה לשימוש נוסף של sFE וסוכנים דומים אחרים.

Introduction

פקקת היא איום מרכזי על בריאות הציבור, במיוחד לאחר מגיפת Covid-19 העולמית 1,2. מבחינה קלינית, מפעילי פלסמינוגן רבים (PAs), כגון מפעיל פלסמינוגן מסוג רקמות (tPA) ואורוקינאז (בריטניה), נמצאים בשימוש נרחב כתרופות טרומבוליטיות. PAs יכולים להפעיל את הפלזמינוגן של החולים לפלסמין פעיל כדי לפרק פיברין. לפיכך, יעילות thrombolytic שלהם מוגבל מאוד על ידי מצב פלסמינוגןשל החולים 3,4. חומרים פיברינוליטיים, כגון פלסמין מטאלופרוטאינאז ופלסמין סרין, הם סוג נוסף של תרופה תרומבוליטית קלינית הכוללת גם אנזימים פיברינוליטיים (FE) כגון פלסמין, אשר יכולים להמיס קרישי דם ישירות אך מושבתים במהירות על ידי מעכבי פלסמין שונים5. לאחר מכן, דווח על סוג חדש של סוכן פיברינוליטי שיכול להמיס את הפקקת לא רק על ידי הפעלת הפלזמינוגן לפלסמין, אלא גם פירוק הפיברין ישירות 6-האנזים הפיברינוליטי מתולעת הבוטנים העתיקה Sipunculus nudus (sFE)6. דו-תפקודי זה מעניק ל-sFE יתרונות נוספים על פני תרופות טרומבוליטיות מסורתיות, במיוחד במונחים של מצב פלסמינוגן חריג. בהשוואה לחומרים פיברינוליטיים דו-תפקודיים אחרים 7,8,9, sFE מציג מספר יתרונות, כולל בטיחות, על פני חומרים שאינם נגזרים ממזון לפיתוח תרופות, במיוחד עבור תרופות דרך הפה. הסיבה לכך היא שהבטיחות הביולוגית והתאימות הביולוגית של Sipunculus nudus התבססו היטב10.

בדומה לחומרים פיברינוליטיים טבעיים אחרים שבודדו ממיקרואורגניזמים, תולעי אדמה ופטריות, טיהור sFE מ-S. nudus הוא מסובך מאוד וכולל שלבים מרובים, כגון הומוגניזציה של רקמות, משקעים של אמוניום סולפט, התפלה, כרומטוגרפיה של חילופי אניון, כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופובית וניפוי מולקולרי10,11,12. מערכת טיהור כזו לא רק תלויה במיומנויות מיומנות וחומרים יקרים, אלא גם דורשת מספר ימים כדי להשלים את כל ההליך. לכן, תוכנית טיהור פשוטה של sFE היא בעלת משמעות רבה לפיתוח נוסף של sFE. למרבה המזל, שני גבישים של sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) הושגו בהצלחה (ראה קובץ משלים 1 וקובץ משלים 2). באמצעות ניתוח מבני וניסויי עגינה מולקולרית, מצאנו כי הליבה הקטליטית של sFE יכולה להיקשר באופן ספציפי למטרות המכילות שאריות ארגינין או ליזין.

כאן הוצעה לראשונה מערכת טיהור זיקה, המבוססת על המבנה הגבישי של sFE. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן לטהר sFE טהור מאוד ופעיל מאוד מהתמציות הגולמיות בשלב טיהור זיקה יחיד. הפרוטוקול שפותח כאן חשוב לא רק להכנת בקנה מידה גדול של sFE, אלא גם עשוי להיות מיושם לטיהור של סוכנים פיברינוליטיים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה

  1. טיפול לדוגמה
    1. בזהירות לנתח טרי S. nudus (100 גרם) ולאסוף את המעי ואת הנוזל הפנימי שלה.
    2. הוסף 300 מ"ל של חיץ Tris-HCl (0.02 M, pH 7.4) להומוגניזציה (1,000 סל"ד, 60 שניות).
    3. להקפיא-להפשיר את הומוגנט 3x.
    4. צנטריפוגו את הדגימה (10,956 × גרם, 0.5 שעות, 4 מעלות צלזיוס) ואספו את הסופרנטנט. יש לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
  2. משקעים חלבוניים
    1. מערבבים את הסופרנאטנט עם תמיסת אמוניום סולפט רווי (תשעה כרכים) ומניחים לתערובת לעמוד במשך 12 שעות ב-4°C.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולהמשיך אותו מאוחר יותר.
    2. צנטריפוגה (10,956 × גרם, 0.5 שעות, 4 מעלות צלזיוס) כדי להשיג את משקע החלבון; יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.
  3. תרחיף חלבונים
    1. להשהות מחדש את משקע החלבון עם 30 מ"ל של מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 7.4). אחסנו את תמיסת החלבון הגולמי בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.

2. כרומטוגרפיית זיקה

  1. סינון פתרונות
    1. סנן את תמיסת החלבון הגולמי דרך קרום מסנן של 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן דגימה זו בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר.
  2. אריזת עמודות
    1. ארוז את עמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ארגינין-אגרוז ואת עמודת הכרומטוגרפיה של מטריצת ליזין-אגרוז על ידי טעינת כמות מתאימה של מדיום מטריצת ליזין-אגרוז ומדיום מטריצת ארגינין-אגרוז לעמודות כרומטוגרפיה ריקות של 5 מ"ל.
      הערה: ניתן לאחסן את העמודה בטמפרטורה של 2-8°C, כאשר המטריצה שקועה במאגר האחסון (20% אתנול).
  3. טיהור אהדה
    1. אזן את עמודת כרומטוגרפיית הזיקה עם ddH2O תחילה (1 מ"ל/דקה, 10 כרכים של עמודות), ואחריו מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 8.0, 1 מ"ל/דקה, 5 אמצעי אחסון).
    2. טען את דגימת תמיסת החלבון על העמודה המאוזנת מראש (1 מ"ל/דקה, נפח של 1/3 עמודה).
      הערה: נפח טעינת הדגימה תלוי בריכוז sFE.
    3. שטוף את העמודה באמצעות מאגר Tris-HCl (0.02 M, pH 8.0, חמישה כרכי עמודות).
    4. הצביעו על העמוד ברצף באורך 0.15 מ', 0.25 מ', 0.35 מ', 0.45 מ', 0.55 מ' ו-0.65 מ' NaCl (1 מ"ל/דקה, חמישה כרכי עמודות).
    5. חפש את שיא האלוציה שאמור להופיע ב- 0.15 M NaCl elution, ולאחר מכן אסוף את השברים בצינורות 5 מ"ל.
    6. רכז את דגימת האלוציה באמצעות מסנן אולטרה צנטריפוגלי 3 kD (3,944 × גרם, 1.5 שעות, 4 ° C). אחסן דגימה זו בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.

3. הערכת טוהר

  1. נתרן דודציל-סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ג'ל הכנה
    1. הכינו את ג'ל SDS-PAGE לפי השיטה של Laemmli באמצעות 5% ג'ל מרוכז ו-12% ג'ל הפרדה13.
  2. אלקטרופורזה
    1. ערבבו את הדגימה (15 מיקרוליטר) עם מאגר העמסת חלבון 5x SDS-PAGE (1/4 נפח), חממו במים רותחים למשך 5 דקות, טענו על ג'ל SDS-PAGE והפעילו את הג'ל במתח של 80 וולט, 60 מיליאמפר למשך שעה וחצי.
  3. ניתוח
    1. לאחר אלקטרופורזה יש לצבוע את הג'ל בערכת כתמים כסופה, בהתאם לפרוטוקול היצרן, ולצפות בג'ל המוכתם באמצעות מערכת הדמיה כימילומינסנטית.
    2. נתח את טוהר חלבון המטרה באמצעות הנוסחה הבאה: טוהר חלבון המטרה = ערך העוצמה של חלבון המטרה / ערך העוצמה של סך החלבון.

4. הערכת פעילות פיברינוליטית

  1. הכנת צלחת פיברין
    1. הכן את הפתרון פיברינוגן על ידי ערבוב 25 מ"ג של פיברינוגן עם 1.25 מ"ל של מלוחים פיזיולוגיים.
    2. הכן את פתרון תרומבין על ידי ערבוב מלא 100 U של תרומבין עם 1.05 מ"ל של מלוחים פיזיולוגיים.
    3. הכן את תמיסת האגרוז על ידי הוספת 0.5 גרם אגרוז ל 22.5 מ"ל של חיץ Tris-HCl (0.02 mol/L, pH 7.4). מערבבים ומחממים את תמיסת האגרוז ב-100°C עד להמסה מלאה.
    4. מצננים את תמיסת האגרוז עד לסביבות 50°C ומוסיפים תמיסת פיברינוגן. לאחר מכן, מיד להוסיף את פתרון טרומבין, לערבב אותם במהירות, ויוצקים אותם לתוך צלחת תרבית 60 מ"מ.
  2. טעינת
    1. ניקבו בארות 3 מ"מ על לוחות הפיברין המוכנים באמצעות בורר סטרילי ומלאו את הבארות בדגימות 10 μL.
  3. ניתוח
    1. לאחר 18 שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, למדוד את הפעילות הפיברינוליטית על ידי חישוב גודל האזורים השפלה שלהם. פעילות פיברינוליטית = (גודל אזור הדגימה / גודל אזור האורוקינאז) x 100 U. גודל אזור = קוטר x קוטר.
      הערה: חיץ מלח פיזיולוגי, חלבון גולמי (הדגימה המתקבלת בשלב פרוטוקול 1.3.1) ואורוקינאז שימשו לבקרה הריקה, השלילית והחיובית, בהתאמה. בהשוואה לאורוקינאז, מצאנו כי הפעילות הפיברינוליטית של sFE מטוהר הייתה ~ 19,200 U/mL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות פרוטוקול זה הופקו ליזטים גולמיים של רקמות, נבנו עמודות כרומטוגרפיה של מטריצת ארגינין-אגרוז וליזין-אגרוז, התקבל sFE מטוהר, והטוהר והפעילות הפיברינוליטית של ה-sFE המטוהר נמדדו על ידי לוחות SDS-PAGE ופיברין, בהתאמה.

לאחר הצנטריפוגה, הסופרנאטנט שנאסף היה נוזל צמיגי שזוף שקוף. המשקעים החלו כאשר סופרנאטנט זה עורבב עם תמיסת אמוניום סולפט רווי (תשעה כרכים). לאחר עמידה של 12 שעות, נוצר שקע כבד בתחתית הצינור. כאשר הוא הושעה מחדש עם חיץ Tris-HCl, המשקע החלבוני נעלם במהירות והתמוסס בחיץ, והופיע כנוזל שקוף בצבע צהוב-בהיר.

כאשר תמיסת החלבון הועמסה על עמודת הזיקה של מטריצת ארגינין-אגרוז, הופיע שיא ברור (שיא 1, שיא זרימה) ב~40 דקות והפסיק להיפלט ב~66 דקות. בשלב האלוציה ההדרגתית, כאשר מדולל עם 0.15 מ 'NaCl, שיא ברור (שיא 2, שיא אלוציה) הופיע ב~ 94 דקות והפסיק לפלוט ב~ 110 דקות. בשלבי האלוציה הנותרים לא הופיעו פסגות אלוציה ברורות (0.25 מ', 0.35 מ', 0.45 מ', 0.55 מ' ו-0.65 מ' נאקל) (איור 1A). במחקר זה, עשינו שימוש חוזר בטור הזיקה של מטריצת ארגינין-אגרוז עד 10 פעמים ומצאנו שביצועי העמודה לא השתנו באופן משמעותי.

כאשר תמיסת החלבון הועמסה לעמודת הזיקה של מטריצת ליזין-אגרוז, הופיע שיא ברור (שיא 1, שיא זרימה) ב~38 דקות והפסיק להיפלט ב~60 דקות. בשלב האלוציה ההדרגתית, כאשר מדולל עם 0.15 מ 'NaCl, שיא ברור (שיא 2, שיא אלוציה) הופיע ב~ 80 דקות והפסיק לפלוט ב~ 86 דקות. בשלבי האלוציה הנותרים לא הופיעו פסגות אלוציה ברורות (0.25 מ', 0.35 מ', 0.45 מ', 0.55 מ' ו-0.65 מ' NaCl (איור 1B). פרופילי האלוציה של עמודת הזיקה של מטריצת ארגינין-אגרוז ועמודת הזיקה של מטריצת ליזין-אגרוז היו דומים. כפי שהוזכר קודם לכן, שימוש חוזר בטור הזיקה של מטריצת ארגינין-אגרוז עד 10 פעמים לא שינה את הביצועים של עמודה זו.

sFE מטוהר (10 μL, דגימת שיא אלוציה, שיא 2) נוסף לצלחת הפיברין המוכנה. בנוסף, 10 μL של urokinase (100 U), 10 μL של חיץ מלח פיזיולוגי, ו 10 μL של חלבון גולמי (מדגם שהתקבל בשלב פרוטוקול 1.3.1) שימשו לבקרה חיובית, ריקה, ושלילית, בהתאמה. לאחר 18 שעות של דגירה, שני לוחות פיברין הציגו תוצאות דומות: אזור שכיבה (קוטר 1.3 ס"מ) הופיע בבקרת האורוקינאז; לא נצפה אזור שכיבה במאגר המלח הפיזיולוגי; אזור ליסינג (קוטר 2.1 ס"מ) הופיע בבאר החלבון הגולמי; ואזור שכיבה (קוטר 1.8 ס"מ) הופיע בבאר sFE המטוהרת (איור 2). בהשוואה לאורוקינאז, מצאנו כי הפעילות הפיברינוליטית של sFE מטוהר הייתה ~ 19,200 U/mL. מכיוון שדגימת שיא הזיקה הותאמה לאותו נפח כמו זה של הדגימה שהוטענה על עמודת הזיקה, קצב ההתאוששות של עמודת הזיקה מצוין על ידי הגודל (קוטר x קוטר) של אזור השכיבה על לוח הפיברין. שיעור ההחלמה של עמודת הזיקה היה ~73.5%.

החלבון הגולמי (הדגימה שהתקבלה בשלב הפרוטוקול 1.3.1) וה-sFE המטוהר (דגימת שיא אלוציה, שיא 2) שימשו לניתוח טוהר. לאחר SDS-PAGE וצביעה, הוצגו בחלבון הגולמי שלוש רצועות חלבון עיקריות (25, 26 ו-27 kD) ושש להקות מינוריות (20, 24, 28, 35, 40 ו-45 kD). רצועה מז'ורית אחת (27 kD) ושתי להקות מינוריות (26 ו-28 kD) הוצגו ב-sFE המטוהר (איור 3). באמצעות ניתוח הערך האפור, מצאנו שהטוהר של sFE מטוהר היה גבוה עד ~92%.

Figure 1
איור 1: הפרופיל של טיהור אהדה. (A) דגימת sFE גולמית טוהרה על-ידי טיהור זיקה של מטריצת ארגינין-אגרוז. שיא זרימה ברור הופיע ב~ 40 דקות והפסיק לפלוט ב ~ 66 דקות. שיא אלוציה ברור הופיע ב~94 דקות והפסיק לפלוט ב~110 דקות. (B) דגימת sFE הגולמי טוהרה על ידי טיהור זיקה מטריצת ליזין-אגרוז. שיא זרימה ברור הופיע ב~ 38 דקות והפסיק לפלוט ב~ 60 דקות. שיא אלוציה ברור הופיע ב~ 80 דקות והפסיק לפלוט ב~ 86 דקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הערכת פעילות פיברינוליטית. דגימות נוספו ללוחית הפיברין ופעילותן הפיברינוליטית נמדדה והוערכה על ידי אזורי השפלה שלהן על הצלחת לאחר 18 שעות. דגימות שטופלו באופן שונה מסומנות על ידי ספרות ערביות אדומות. (A) הפעילות הפיברינוליטית של sFE מטוהרת על ידי עמודת זיקה מטריצת ארגינין-אגרוז. #1, 100 U של urokinase; #2, מאגר מלח פיזיולוגי; #3, חלבון גולמי (הדגימה המתקבלת בפרוטוקול שלב 1.3.1); #4, sFE מטוהר (דגימת שיא אלוציה, שיא 2). (B) הפעילות הפיברינוליטית של sFE שטוהרה על ידי עמודת הזיקה של מטריצת ליזין-אגרוז. #1, 100 U של urokinase; #2, מאגר מלח פיזיולוגי; #3, חלבון גולמי (הדגימה המתקבלת בפרוטוקול שלב 1.3.1); #4, sFE מטוהר (דגימת שיא אלוציה, שיא 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח טוהר. טוהר sFE מטוהר נותח על ידי SDS-PAGE. (A) טוהר sFE מטוהר על-ידי עמודת הזיקה של מטריצת ארגינין-אגרוז. M: סמן חלבון; נתיב 1: חלבון גולמי (הדגימה המתקבלת בפרוטוקול שלב 1.3.1); נתיב 2: sFE מטוהר (דגימת שיא אלוציה, שיא 2). (B) טוהר sFE מטוהר על ידי עמודת הזיקה של מטריצת ליזין-אגרוז. M: סמן חלבון; נתיב 1: חלבון גולמי (הדגימה המתקבלת בפרוטוקול שלב 1.3.1); נתיב 2: sFE מטוהר (דגימת שיא אלוציה, שיא 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: 8ZHP: מבנה גבישי של snFPITE-n1. דוח אימות מבני של קרני רנטגן PDB. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: 8ZHO: מבנה גבישי של snFPITE-n2. דוח אימות מבני של קרני רנטגן PDB. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשל חוסר הזמינות של רצף הגן המדויק של sFE, sFE הנמצא בשימוש כיום הופק מ-S. nudus14 טרי. יתר על כן, הליכי הטיהור של sFE שדווחו בספרות היו מסובכים ויקרים, מכיוון שהם התבססו על כמה תכונות כלליות של sFE, כגון משקל מולקולרי, נקודה איזואלקטרית, חוזק יוני וקוטביות15,16. עד כה לא דווח על פרוטוקול טיהור זיקה של sFE. במחקר זה, פרוטוקול טיהור זיקה של sFE פותח בהצלחה בהתבסס על הידע של המבנה הגבישי שלו. בהשוואה לשיטות הטיהור המדווחות, שיטת טיהור זיקה זו הייתה קלה לתפעול, זולה וידידותית למשתמש. יתר על כן, שיעור התאוששות גבוה משמעותית של sFE פעיל נצפה באמצעות שיטה זו.

למרות שדווח על שיטות טיהור זיקה רבות של אנזימים פיברינוליטיים, הן התבססו על נוגדנים17, מעכבים 18, ליגנדים וקולטנים16. הכנת נוגדנים, מעכבים, ליגנדות וקולטנים אלה היא מאתגרת ומייגעת מבחינה טכנית. יתר על כן, נדרשים מאמצים נוספים להצמדת מולקולות אלה למטריצה. לעומת זאת, מטריצת ארגינין-אגרוז ומטריצת ליזין-אגרוז הן חומרים מסחריים, מוכנים לשימוש, יציבים מאוד וקלים להרחבה19. לאחרונה, מטריצת ליזין-אגרוז שימשה לטיהור זיקה של פלסמינוגן20,21; עם זאת, פלסמינוגן הוא פרו-אנזים של הפלסמין, לא צורה פעילה15. עדיין לא בטוח אם מטריצת ליזין-אגרוז מתאימה לטיהור זיקה של פלסמין. באופן תיאורטי, sFE שטוהר באמצעות מטריצת ארגינין-אגרוז ומטריצת ליזין-אגרוז במחקר זה הוא רק הצורה הפעילה, מכיוון שהמודל הגבישי הצביע על כך שרק השלשות הקטליטיות, של sFE, יכולות לקיים אינטראקציה עם שאריות ארגינין וליזין. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בטיהור של פלסמין סרין אחרים, להאיץ את הפיתוח של תרופות פלסמין סרין אחרות.

מכיוון שהקישור בין sFE לעמודת הזיקה אינו חזק במיוחד, שמירה על ריכוז NaCl מדויק ומהירות אלוציה תקינה הם קריטיים מאוד לטיהור מוצלח. גורם מפתח נוסף הוא ה- pH של המערכת, אשר משפיע קשות על הטיהור. שלושת הפרמטרים הללו עברו אופטימיזציה על ידינו. אמנם, שיעור ההתאוששות של sFE פעיל במחקר זה היה נמוך יחסית, וייתכן שהוגבל על ידי המספר הנמוך של שאריות ארגינין זמינות או שאריות ליזין על פני השטח של מטריצת אגרוז. לכן, יש להאריך את המקשר בין ליזין/ארגינין ומטריצת אגרוז כדי לשפר את קצב ההחלמה שלו. בינתיים, לא יכולנו לשלול את האפשרות שחלבוני סרין אחרים עם שילוש קטליטי דומה ל-sFE ידוללו תחת מערכת זו. לכן, עדיף להוסיף טכנולוגיית טיהור מולקולרית מבוססת משקל, כגון אולטרה-סינון, כדי להפריד את חלבוני הסרין האחרים מ-sFE. באופן דומה, בעיות רבות אחרות כגון שיפור יכולת הקשירה, הארכת החיים ופישוט נוסף של ההליך צריכות להיות מטופלות בעבודה עתידית על ידי אסטרטגיות (למשל, החלפת הארגינין/ליזין בפולי ארגינין/ליזין ושינוי המקשר).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי לשכת המדע והטכנולוגיה של העיר שיאמן (3502Z20227197) ולשכת המדע והטכנולוגיה של מחוז פוג'יאן (מס '2019J01070, מס '2021Y0027).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) Biosharp
2-Mercaptoethanol Solarbio
Agarose G-10 Biowest
Ammonium persulfate SINOPHARM
Ammonium sulfate SINOPHARM
Arginine-Sepharose 4B Solarbio Arginine-agarose matrix
Bromoxylenol Blue (BPB) Solarbio
Fast Silver Stain Kit Beyotime
Fibrinogen Merck
Glycine Solarbio
Hydrochloric acid SINOPHARM
Kinase RHAWN
Lysine-Sepharose 4B Solarbio Lysine-agarose matrix
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) Beyotime
Sodium chloride SINOPHARM
Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) Sigma-Aldrich
Sodium hydroxide SINOPHARM
Thrombin Meilunbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Solarbio
Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride Solarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System pure GE
Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 SANYO
Chemiluminescence Imaging System GE
Constant Flow Pump BT-100 QITE
Constant Temperature Incubator JINGHONG
Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS SIGMA
DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD SENXIN
Electric Glass Homogenizer DY89-II SCIENTZ
Electronic Analytical Balance DENVER
Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 SENXIN
Horizontal Decolorization Shaker Kylin-Bell
Ice Machine AF 103 Scotsman
KQ-500E Ultrasonic Cleaner ShuMei
Magnetic Stirrer Zhi wei
Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W Cence
Microwave Oven Galanz
Milli-Q Reference Millipore
Pipettor Thermo Fisher Scientific
Precision Desktop pH Meter Sartorious
Small-sized Vortex Oscillator Kylin-Bell
Vertical Electrophoresis System Bio-Rad
Consumable Material 
200 µL PCR Tube (200 µL) Axygene
Centrifuge Tube (1.5 mL) Biosharp
Centrifuge Tube (5 mL) Biosharp
Centrifuge Tube (50 mL) NEST
Centrifuge Tube (7 mL) Biosharp
Culture Dish (60 mm) NEST
Filter Membrane (0.22 µm) Millex GP
Parafilm Bemis
Pipette Tip (1 mL ) KIRGEN
Pipette Tip (10 µL) Axygene
Pipette Tip (200 µL) Axygene
Special Indicator Paper TZAKZY
Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) Millipore
Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) Millipore
Universal pH Indicator SSS Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
  2. Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
  3. von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
  4. Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
  5. Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
  6. Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
  7. Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
  8. Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
  9. Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
  10. Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
  11. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
  12. Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
  13. Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
  14. Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
  15. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
  16. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
  17. Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
  18. Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
  19. Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
  20. Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
  21. Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 196
זיקה טיהור אנזים פיברינוליטי <em>מ-Sipunculus nudus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H.… More

Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus. J. Vis. Exp. (196), e65631, doi:10.3791/65631 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter