Summary
Aqui, apresentamos um método de purificação por afinidade de uma enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus que é simples, barato e eficiente.
Abstract
A enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE) é um novo agente fibrinolítico que pode tanto ativar o plasminogênio em plasmina quanto degradar a fibrina diretamente, apresentando grandes vantagens sobre os trombolíticos tradicionais. No entanto, devido à falta de informações estruturais, todos os programas de purificação para sFE são baseados em purificações por cromatografia em várias etapas, que são muito complicadas e caras. Aqui, um protocolo de purificação por afinidade de sFE é desenvolvido pela primeira vez baseado em uma estrutura cristalina de sFE; inclui a preparação da amostra bruta e da coluna de cromatografia de afinidade da matriz lisina/arginina-agarose, purificação por afinidade e caracterização do FE purificado. Seguindo este protocolo, um lote de sFE pode ser purificado dentro de 1 dia. Além disso, a pureza e a atividade do FE purificado aumentam para 92% e 19.200 U/mL, respectivamente. Assim, esta é uma abordagem simples, barata e eficiente para purificação de sFE. O desenvolvimento deste protocolo é de grande importância para a posterior utilização de sFE e outros agentes similares.
Introduction
A trombose é uma grande ameaça à saúde pública, especialmente após a pandemia global de Covid-19 1,2. Clinicamente, muitos ativadores do plasminogênio (APs), como o ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e a uroquinase (UK), têm sido amplamente utilizados como trombolíticos. Os APs podem ativar o plasminogênio dos pacientes em plasmina ativa para degradar a fibrina. Assim, sua eficácia trombolítica é fortemente limitada pelo estado plasminogênico dos pacientes 3,4. Os agentes fibrinolíticos, como a plasmina metaloproteinase e a serina plasmina, são outro tipo de trombolítico clínico que também inclui enzimas fibrinolíticas (EG), como a plasmina, que podem dissolver diretamente os coágulos, mas são rapidamente inativados por vários inibidores de plasmina5. Posteriormente, um novo tipo de agente fibrinolítico foi relatado que pode dissolver o trombo não apenas ativando o plasminogênio em plasmina, mas também degradando diretamente a fibrina 6-a enzima fibrinolítica do antigo verme do amendoim Sipunculus nudus (sFE)6. Essa bifunção confere ao sFE outras vantagens em relação aos trombolíticos tradicionais, especialmente em termos de estado anormal do plasminogênio. Comparado a outros fibrinolíticos bifuncionais 7,8,9, o FE apresenta várias vantagens, incluindo segurança, sobre agentes não derivados de alimentos para o desenvolvimento de fármacos, especialmente para drogas orais. Isso porque a biossegurança e a biocompatibilidade de Sipunculus nudus estão bem estabelecidas10.
Assim como outros fibrinolíticos naturais isolados de microrganismos, minhocas e cogumelos, a purificação do FEs de S. nudus é muito complicada e inclui múltiplas etapas, como homogeneização tecidual, precipitação com sulfato de amônio, dessalinização, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica e peneiramento molecular10,11,12. Tal sistema de purificação não depende apenas de habilidades proficientes e materiais caros, mas também requer vários dias para concluir todo o procedimento. Portanto, um simples programa de purificação de sFE é de grande importância para o desenvolvimento posterior de sFE. Felizmente, dois cristais de sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) foram obtidos com sucesso (ver Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2). Através de análises estruturais e experimentos de acoplamento molecular, descobrimos que o núcleo catalítico do sFE poderia se ligar especificamente a alvos contendo resíduos de arginina ou lisina.
Neste trabalho, um sistema de purificação por afinidade foi proposto pela primeira vez, baseado na estrutura cristalina do sFE. Seguindo este protocolo, o FE altamente puro e altamente ativo pôde ser purificado dos extratos brutos em um único estágio de purificação por afinidade. O protocolo aqui desenvolvido não é apenas importante para a preparação em larga escala de FEf, mas também pode ser aplicado para a purificação de outros agentes fibrinolíticos.
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Protocol
1. Preparo
- Tratamento da amostra
- Dissecar cuidadosamente S. nudus fresco (100 g) e coletar o intestino e seu líquido interno.
- Adicionar 300 mL de tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) para homogeneização (1.000 rpm, 60 s).
- Congelar-descongelar o homogeneizado 3x.
- Centrifugar a amostra (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) e recolher o sobrenadante. Conservar a amostra a 4 °C até nova utilização.
- Precipitação proteica
- Misture o sobrenadante com uma solução saturada de sulfato de amónio (nove volumes) e deixe repousar durante 12 h a 4 °C.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui e continuado mais tarde. - Centrífuga (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) para obtenção do precipitado proteico; armazená-lo a 4 °C para uso posterior.
- Misture o sobrenadante com uma solução saturada de sulfato de amónio (nove volumes) e deixe repousar durante 12 h a 4 °C.
- Ressuspensão proteica
- Ressuspender o precipitado proteico com 30 mL de tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservar esta solução de proteína bruta a 4 °C para utilização posterior.
2. Cromatografia de afinidade
- Filtração de soluções
- Filtrar a solução de proteína bruta através de uma membrana filtrante de 0,22 μm. Conservar esta amostra a 4 °C para utilização posterior.
- Embalagem em coluna
- Embalar a coluna de cromatografia de afinidade de matriz de arginina-agarose e a coluna de cromatografia de afinidade de matriz de lisina-agarose carregando uma quantidade adequada de meio de matriz de lisina-agarose e meio de matriz de arginina-agarose em colunas vazias de cromatografia de 5 mL.
NOTA: A coluna pode ser armazenada a 2-8 °C, com a matriz imersa em tampão de armazenamento (etanol 20%).
- Embalar a coluna de cromatografia de afinidade de matriz de arginina-agarose e a coluna de cromatografia de afinidade de matriz de lisina-agarose carregando uma quantidade adequada de meio de matriz de lisina-agarose e meio de matriz de arginina-agarose em colunas vazias de cromatografia de 5 mL.
- Purificação de afinidade
- Equilibrar a coluna de cromatografia de afinidade com ddH2O primeiro (1 mL/min, 10 volumes de coluna), seguido por tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, volumes de 5 colunas).
- Carregar a amostra de solução proteica na coluna pré-equilibrada (1 mL/min, volume de 1/3 de coluna).
NOTA: O volume de carregamento da amostra depende da concentração de sFE. - Lavar a coluna com tampão Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, cinco volumes de coluna).
- Eluir a coluna com NaCl de 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M e 0,65 M (1 mL/min, cinco volumes de coluna) sucessivamente.
- Procure o pico de eluição que deve aparecer na eluição de NaCl 0,15 M e, em seguida, colete as frações em tubos de 5 mL.
- Concentrar a amostra de eluição utilizando um filtro ultracentrífugo de 3 kD (3,944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservar esta amostra a -80 °C para utilização posterior.
3. Avaliação da pureza
- Preparação de gel de poliacrilamida em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE)
- Preparar o gel SDS-PAGE de acordo com o método de Laemmli utilizando gel concentrado a 5% e gel de separaçãoa 12% 13.
- Eletroforese
- Misturar a amostra (15 μL) com 5x tampão de carregamento de proteína SDS-PAGE (1/4 volume), aquecer em água fervente por 5 min, carregar no gel SDS-PAGE e passar o gel a 80 V, 60 mA por 1,5 h.
- Análise
- Após a eletroforese, corar o gel com um Silver Stain Kit, de acordo com o protocolo do fabricante, e observar o gel corado usando um sistema de imagem quimioluminescente.
- Analise a pureza da proteína-alvo utilizando a seguinte fórmula: pureza da proteína-alvo = valor da intensidade da proteína-alvo/valor da intensidade da proteína total.
4. Avaliação da atividade fibrinolítica
- Preparo da placa de fibrina
- Preparar a solução de fibrinogênio misturando 25 mg de fibrinogênio com 1,25 mL de solução salina fisiológica.
- Preparar a solução de trombina misturando completamente 100 U de trombina com 1,05 mL de soro fisiológico.
- Preparar a solução de agarose adicionando 0,5 g de agarose a 22,5 ml de tampão Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Misturar e aquecer a solução de agarose a 100 °C até dissolver completamente.
- Arrefecer a solução de agarose até cerca de 50 °C e adicionar a solução de fibrinogénio. Em seguida, adicione imediatamente a solução de trombina, misture-os rapidamente e despeje-os em uma placa de cultura de 60 mm.
- Carregamento
- Perfurar poços de 3 mm nas placas de fibrina preparadas usando uma broca estéril e encher os poços com amostras de 10 μL.
- Análise
- Após 18 h de incubação a 37 °C, medir a atividade fibrinolítica calculando o tamanho de suas zonas de degradação. Atividade fibrinolítica = (tamanho da zona da amostra/ tamanho da zona da uroquinase) x 100 U. Tamanho da zona = diâmetro x diâmetro.
OBS: Tampão fisiológico salino, proteína bruta (amostra obtida no protocolo passo 1.3.1) e uroquinase foram utilizados para o controle branco, negativo e positivo, respectivamente. Em comparação com a uroquinase, observamos que a atividade fibrinolítica do FE purificado foi de ~19.200 U/mL.
- Após 18 h de incubação a 37 °C, medir a atividade fibrinolítica calculando o tamanho de suas zonas de degradação. Atividade fibrinolítica = (tamanho da zona da amostra/ tamanho da zona da uroquinase) x 100 U. Tamanho da zona = diâmetro x diâmetro.
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Representative Results
Seguindo este protocolo, lisados teciduais brutos foram extraídos, colunas de cromatografia de afinidade com matriz de arginina-agarose e matriz de lisina-agarose foram construídas, FE purificado foi obtido e a pureza e atividade fibrinolítica do FE purificado foram medidas por SDS-PAGE e placas de fibrina, respectivamente.
Após a centrifugação, o sobrenadante coletado foi um líquido viscoso bronzeado transparente. A precipitação iniciou-se quando este sobrenadante foi misturado com solução saturada de sulfato de amônio (nove volumes). Após 12 h de repouso, formou-se um precipitado pesado no fundo do tubo. Quando ressuspendido com tampão Tris-HCl, o precipitado proteico desapareceu rapidamente e se dissolveu no tampão, aparecendo como um líquido amarelo-pálido transparente.
Quando a solução proteica foi carregada na coluna de afinidade da matriz arginina-agarose, um pico óbvio (pico 1, pico de fluxo) apareceu em ~40 min e parou de eluir em ~66 min. No estágio de eluição do gradiente, quando eluído com NaCl 0,15 M, um pico óbvio (pico 2, pico de eluição) apareceu em ~94 min e parou de eluir em ~110 min. Não apareceram picos de eluição óbvios nos demais estágios de eluição (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M e NaCl 0,65 M) (Figura 1A). Neste estudo, reutilizamos a coluna de afinidade da matriz arginina-agarose até 10 vezes e verificamos que o desempenho da coluna não foi significativamente alterado.
Quando a solução proteica foi carregada na coluna de afinidade da matriz lisina-agarose, um pico óbvio (pico 1, pico de fluxo) apareceu em ~38 min e parou de eluir em ~60 min. No estágio de eluição do gradiente, quando eluído com NaCl 0,15 M, um pico óbvio (pico 2, pico de eluição) apareceu em ~80 min e parou de eluir em ~86 min. Não apareceram picos de eluição óbvios nos demais estágios de eluição (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M e NaCl 0,65 M (Figura 1B). Os perfis de eluição da coluna de afinidade da matriz arginina-agarose e da coluna de afinidade da matriz lisina-agarose foram semelhantes. Como mencionado anteriormente, a reutilização da coluna de afinidade da matriz arginina-agarose em até 10 vezes não alterou o desempenho desta coluna.
FE purificado (10 μL, amostra de pico de eluição, pico 2) foi adicionado à placa de fibrina preparada. Além disso, 10 μL de uroquinase (100 U), 10 μL de tampão salino fisiológico e 10 μL de proteína bruta (amostra obtida na etapa 1.3.1 do protocolo) foram utilizados para o controle positivo, branco e negativo, respectivamente. Após 18 h de incubação, duas placas de fibrina apresentaram resultados semelhantes: uma zona de lise (1,3 cm de diâmetro) apareceu no controle uroquinase; não foi observada zona de lise no tampão fisiológico; uma zona de lise (2,1 cm de diâmetro) apareceu no poço de proteína bruta; e uma zona de lise (1,8 cm de diâmetro) apareceu no poço de FEF purificado (Figura 2). Em comparação com a uroquinase, observamos que a atividade fibrinolítica do FE purificado foi de ~19.200 U/mL. Como a amostra do pico de eluição foi ajustada para o mesmo volume da amostra carregada na coluna de afinidade, a taxa de recuperação da coluna de afinidade é indicada pelo tamanho (diâmetro x diâmetro) da zona de lise na placa de fibrina. A taxa de recuperação da coluna de afinidade foi de ~73,5%.
A proteína bruta (amostra obtida na etapa 1.3.1 do protocolo) e o sFE purificado (amostra pico de eluição, pico 2) foram utilizados para análise de pureza. Após SDS-PAGE e coloração, três bandas proteicas principais (25, 26 e 27 kD) e seis bandas menores (20, 24, 28, 35, 40 e 45 kD) foram apresentadas na proteína bruta. Uma banda maior (27 kD) e duas bandas menores (26 e 28 kD) foram apresentadas no FE purificado (Figura 3). Através da análise do valor de cinza, descobrimos que a pureza do FE purificado foi tão alta quanto ~92%.
Figura 1: Perfil de purificação por afinidade. (A) A amostra bruta de FE foi purificada por purificação por afinidade da matriz arginina-agarose. Um pico de fluxo óbvio apareceu em ~40 min e parou de eluir em ~66 min. Um pico de eluição óbvio apareceu em ~94 min e parou de eluir em ~110 min. (B) A amostra bruta de FE foi purificada por purificação por afinidade da matriz lisina-agarose. Um pico de fluxo óbvio apareceu em ~38 min e parou de eluir em ~60 min. Um pico de eluição óbvio apareceu em ~80 min e parou de eluir em ~86 min. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação da atividade fibrinolítica. As amostras foram adicionadas à placa de fibrina e sua atividade fibrinolítica foi medida e avaliada por suas zonas de degradação na placa após 18 h. Amostras tratadas de forma diferente são indicadas por algarismos arábicos vermelhos. (A) A atividade fibrinolítica do FE purificado pela coluna de afinidade da matriz arginina-agarose. #1, 100 U de uroquinase; #2, tampão fisiológico salino; #3, proteína bruta (amostra obtida no protocolo passo 1.3.1); #4, FE purificado (amostra de pico de eluição, pico 2). (B) A atividade fibrinolítica do FE purificado pela coluna de afinidade da matriz lisina-agarose. #1, 100 U de uroquinase; #2, tampão fisiológico salino; #3, proteína bruta (amostra obtida no protocolo passo 1.3.1); #4, FE purificado (amostra de pico de eluição, pico 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise da pureza. A pureza do sFE purificado foi analisada por SDS-PAGE. (A) A pureza do sFE purificado pela coluna de afinidade da matriz arginina-agarose. M: marcador proteico; faixa 1: proteína bruta (amostra obtida na etapa do protocolo 1.3.1); faixa 2: FE purificado (amostra de pico de eluição, pico 2). (B) A pureza do sFE purificado pela coluna de afinidade da matriz lisina-agarose. M: marcador proteico; faixa 1: proteína bruta (amostra obtida na etapa do protocolo 1.3.1); faixa 2: FE purificado (amostra de pico de eluição, pico 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo Suplementar 1: 8ZHP: Estrutura cristalina do snFPITE-n1. Um relatório de validação estrutural de raios-X PDB. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 2: 8ZHO: Estrutura cristalina do snFPITE-n2. Um relatório de validação estrutural de raios-X PDB. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Devido à indisponibilidade da sequência exata do gene sFE, o FE atualmente utilizado foi extraído de S. nudus fresco 14. Além disso, os procedimentos de purificação da FEs relatados na literatura foram complicados e dispendiosos, pois se basearam em algumas características gerais da FEs, como peso molecular, ponto isoelétrico, força iônica e polaridade15,16. Nenhum protocolo de purificação de afinidade de FEs foi relatado até o momento. Neste estudo, um protocolo de purificação por afinidade de FEf foi desenvolvido com sucesso com base no conhecimento de sua estrutura cristalina. Em comparação com os métodos de purificação relatados, este método de purificação por afinidade foi fácil de operar, barato e fácil de usar. Além disso, uma taxa de recuperação consideravelmente maior do FE ativo foi observada com o uso desse método.
Embora muitos métodos de purificação por afinidade de enzimas fibrinolíticas tenham sido relatados, eles foram baseados em anticorpos17, inibidores 18, ligantes e receptores16. A preparação desses anticorpos, inibidores, ligantes e receptores é tecnicamente desafiadora e trabalhosa. Além disso, esforços extras são necessários para conjugar essas moléculas à matriz. Em contraste, a matriz arginina-agarose e a matriz lisina-agarose são materiais comerciais, prontos para uso, altamente estáveis e fáceis de escalar19. Recentemente, a matriz lisina-agarose tem sido utilizada para purificação por afinidade do plasminogênio20,21; entretanto, o plasminogênio é a pró-enzima da plasmina, não uma forma ativa15. Ainda não se sabe se a matriz lisina-agarose é adequada para purificação por afinidade da plasmina. Teoricamente, o FE purificado usando matriz de arginina-agarose e matriz de lisina-agarose neste estudo é apenas a forma ativa, pois o modelo cristalino indicou que apenas as tríades catalíticas de FEs podem interagir com resíduos de arginina e lisina. Portanto, este protocolo poderia ser aplicado na purificação de outras serina plasmina, acelerando o desenvolvimento de outras drogas serina plasmina.
Como a ligação entre o sFE e a coluna de afinidade não é muito forte, manter uma concentração exata de NaCl e uma velocidade de eluição adequada são muito críticos para uma purificação bem-sucedida. Outro fator fundamental é o pH do sistema, que afeta severamente a purificação. Esses três parâmetros foram otimizados por nós. É certo que a taxa de recuperação de FE ativo neste estudo foi relativamente baixa, e pode ter sido restringida pelo baixo número de resíduos de arginina ou lisina disponíveis na superfície da matriz de agarose. Portanto, o ligante entre lisina/arginina e matriz de agarose precisa ser alongado para aumentar sua taxa de recuperação. Entretanto, não podemos excluir a possibilidade de que outras proteínas serinas com uma tríade catalítica semelhante à sFE sejam eluídas sob este sistema. Então, é melhor adicionar uma tecnologia de purificação baseada em peso molecular, como ultrafiltração, para separar as outras proteínas de serina da sFE. Da mesma forma, muitos outros problemas, como aumentar a capacidade de ligação, prolongar a vida útil e simplificar ainda mais o procedimento, devem ser abordados em trabalhos futuros por meio de estratégias de acordo (por exemplo, substituição da arginina/lisina por poli-arginina/lisina e modificação do ligante).
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Cidade de Xiamen (3502Z20227197) e pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
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