Summary
Qui, presentiamo un metodo di purificazione di affinità di un enzima fibrinolitico da Sipunculus nudus che è semplice, economico ed efficiente.
Abstract
L'enzima fibrinolitico di Sipunculus nudus (sFE) è un nuovo agente fibrinolitico che può sia attivare il plasminogeno in plasmina che degradare direttamente la fibrina, mostrando grandi vantaggi rispetto agli agenti trombolitici tradizionali. Tuttavia, a causa della mancanza di informazioni strutturali, tutti i programmi di purificazione per sFE si basano su purificazioni cromatografiche multifase, che sono troppo complicate e costose. Qui, un protocollo di purificazione di affinità di sFE viene sviluppato per la prima volta basato su una struttura cristallina di sFE; comprende la preparazione del campione grezzo e della colonna cromatografica di affinità della matrice lisina/arginina-agarosio, la purificazione dell'affinità e la caratterizzazione della sFE purificata. Seguendo questo protocollo, un lotto di sFE può essere purificato entro 1 giorno. Inoltre, la purezza e l'attività della sFE purificata aumentano rispettivamente al 92% e a 19.200 U/ml. Pertanto, questo è un approccio semplice, economico ed efficiente per la purificazione sFE. Lo sviluppo di questo protocollo è di grande importanza per l'ulteriore utilizzo di sFE e altri agenti simili.
Introduction
La trombosi è una grave minaccia per la salute pubblica, soprattutto a seguito della pandemia globale di Covid-19 1,2. Clinicamente, molti attivatori del plasminogeno (PA), come l'attivatore del plasminogeno di tipo tissutale (tPA) e l'urochinasi (Regno Unito), sono stati ampiamente utilizzati come farmaci trombolitici. Le PA possono attivare il plasminogeno dei pazienti in plasmina attiva per degradare la fibrina. Pertanto, la loro efficienza trombolitica è fortemente limitata dallo stato del plasminogeno dei pazienti 3,4. Gli agenti fibrinolitici, come la plasmina metalloproteinasi e la plasmina serina, sono un altro tipo di farmaco trombolitico clinico che include anche enzimi fibrinolitici (FE) come la plasmina, che possono sciogliere direttamente i coaguli ma sono rapidamente inattivati da vari inibitori della plasmina5. Successivamente, è stato riportato un nuovo tipo di agente fibrinolitico che può dissolvere il trombo non solo attivando il plasminogeno in plasmina, ma anche degradando direttamente la fibrina 6-l'enzima fibrinolitico dall'antico verme delle arachidi Sipunculus nudus (sFE)6. Questa bifunzione conferisce a sFE altri vantaggi rispetto ai farmaci trombolitici tradizionali, specialmente in termini di stato anomalo del plasminogeno. Rispetto ad altri agenti fibrinolitici bifunzionali 7,8,9, sFE mostra diversi vantaggi, tra cui la sicurezza, rispetto agli agenti derivati non alimentari per lo sviluppo di farmaci, in particolare per i farmaci orali. Questo perché la biosicurezza e la biocompatibilità di Sipunculus nudus sono state ben stabilite10.
Analogamente agli altri agenti fibrinolitici naturali isolati da microrganismi, lombrichi e funghi, la purificazione di sFE da S. nudus è molto complicata e comprende più fasi, come l'omogeneizzazione dei tessuti, la precipitazione del solfato di ammonio, la desalinizzazione, la cromatografia a scambio anionico, la cromatografia di interazione idrofobica e la setacciatura molecolare10,11,12. Un tale sistema di purificazione non dipende solo da competenze competenti e materiali costosi, ma richiede anche diversi giorni per completare l'intera procedura. Pertanto, un semplice programma di purificazione di sFE è di grande importanza per l'ulteriore sviluppo di sFE. Fortunatamente, due cristalli di sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) sono stati ottenuti con successo (vedere File supplementare 1 e File supplementare 2). Attraverso analisi strutturali ed esperimenti di docking molecolare, abbiamo scoperto che il nucleo catalitico di sFE potrebbe legarsi specificamente a bersagli contenenti residui di arginina o lisina.
Qui, è stato proposto per la prima volta un sistema di purificazione di affinità, basato sulla struttura cristallina di sFE. Seguendo questo protocollo, la sFE altamente pura e altamente attiva potrebbe essere purificata dagli estratti grezzi in un unico stadio di purificazione di affinità. Il protocollo sviluppato qui non è importante solo per la preparazione su larga scala di sFE, ma può anche essere applicato per la purificazione di altri agenti fibrinolitici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione
- Trattamento del campione
- Sezionare con cura S. nudus fresco (100 g) e raccogliere l'intestino e il suo fluido interno.
- Aggiungere 300 ml di tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) per l'omogeneizzazione (1.000 rpm, 60 s).
- Congelare-scongelare l'omogenato 3x.
- Centrifugare il campione (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) e raccogliere il surnatante. Conservare il campione a 4 °C fino a un ulteriore utilizzo.
- Precipitazione proteica
- Mescolare il surnatante con una soluzione satura di solfato di ammonio (nove volumi) e lasciare riposare la miscela per 12 ore a 4 °C.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui e continuato in seguito. - Centrifugare (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) per ottenere il precipitato proteico; conservare a 4 °C per un uso successivo.
- Mescolare il surnatante con una soluzione satura di solfato di ammonio (nove volumi) e lasciare riposare la miscela per 12 ore a 4 °C.
- Risospensione proteica
- Risospendere il precipitato proteico con 30 mL di tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservare questa soluzione proteica grezza a 4 °C per un uso successivo.
2. Cromatografia di affinità
- Filtrazione della soluzione
- Filtrare la soluzione proteica grezza attraverso una membrana filtrante da 0,22 μm. Conservare questo campione a 4 °C per un uso successivo.
- Impacchettamento della colonna
- Imballare la colonna cromatografica di affinità arginina-agarosio e la colonna cromatografica di affinità matrice lisina-agarosio caricando una quantità appropriata di terreno di matrice lisina-agarosio e di terreno di matrice di arginina-agarosio in colonne cromatografiche vuote da 5 ml.
NOTA: La colonna può essere conservata a 2-8 °C, con la matrice immersa nel tampone di stoccaggio (20% di etanolo).
- Imballare la colonna cromatografica di affinità arginina-agarosio e la colonna cromatografica di affinità matrice lisina-agarosio caricando una quantità appropriata di terreno di matrice lisina-agarosio e di terreno di matrice di arginina-agarosio in colonne cromatografiche vuote da 5 ml.
- Purificazione per affinità
- Equilibrare la colonna cromatografica di affinità con ddH2O prima (1 mL/min, 10 volumi di colonna), seguita da tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, 5 volumi di colonna).
- Caricare il campione della soluzione proteica sulla colonna preequilibrata (1 ml/min, 1/3 di volume della colonna).
NOTA: Il volume di carico del campione dipende dalla concentrazione di sFE. - Lavare la colonna con tampone Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, cinque volumi di colonna).
- Eluire la colonna con 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M e 0,65 M NaCl (1 mL/min, cinque volumi di colonna) successivamente.
- Cercare il picco di eluizione che dovrebbe apparire nell'eluizione di NaCl 0,15 M, quindi raccogliere le frazioni in tubi da 5 ml.
- Concentrare il campione di eluizione utilizzando un filtro ultracentrifugo da 3 kD (3.944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservare questo campione a -80 °C per un uso successivo.
3. Valutazione della purezza
- Preparazione gel per elettroforesi su gel di sodio dodecil-solfato poliacrilammide (SDS-PAGE)
- Preparare il gel SDS-PAGE secondo il metodo Laemml utilizzando gel concentrato al 5% e gel di separazione al 12%13.
- Elettroforesi
- Mescolare il campione (15 μL) con 5 tampone di carico proteico SDS-PAGE (1/4 di volume), riscaldare in acqua bollente per 5 minuti, caricare sul gel SDS-PAGE e far funzionare il gel a 80 V, 60 mA per 1,5 ore.
- Analisi
- Dopo l'elettroforesi, colorare il gel con un Silver Stain Kit, secondo il protocollo del produttore, e osservare il gel colorato utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza.
- Analizzare la purezza della proteina bersaglio utilizzando la seguente formula: purezza della proteina bersaglio = valore di intensità della proteina bersaglio/valore di intensità della proteina totale.
4. Valutazione dell'attività fibrinolitica
- Preparazione della piastra di fibrina
- Preparare la soluzione di fibrinogeno mescolando 25 mg di fibrinogeno con 1,25 ml di soluzione fisiologica.
- Preparare la soluzione di trombina mescolando completamente 100 U di trombina con 1,05 ml di soluzione salina fisiologica.
- Preparare la soluzione di agarosio aggiungendo 0,5 g di agarosio a 22,5 ml di tampone Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Mescolare e riscaldare la soluzione di agarosio a 100 °C fino a completa dissoluzione.
- Raffreddare la soluzione di agarosio fino a circa 50 °C e aggiungere la soluzione di fibrinogeno. Quindi, aggiungere immediatamente la soluzione di trombina, mescolarli rapidamente e versarli in un piatto di coltura da 60 mm.
- Caricamento
- Perforare i pozzetti da 3 mm sulle piastre di fibrina preparate usando una piralide sterile e riempire i pozzetti con campioni da 10 μL.
- Analisi
- Dopo 18 ore di incubazione a 37 °C, misurare l'attività fibrinolitica calcolando la dimensione delle loro zone degradanti. Attività fibrinolitica = (dimensione della zona del campione/dimensione della zona dell'urochinasi) x 100 U. Dimensione della zona = diametro x diametro.
NOTA: Tampone fisiologico salino, proteina grezza (campione ottenuto nella fase 1.3.1 del protocollo) e urochinasi sono stati utilizzati rispettivamente per il controllo bianco, negativo e positivo. Rispetto all'urochinasi, abbiamo scoperto che l'attività fibrinolitica della sFE purificata era ~ 19.200 U / ml.
- Dopo 18 ore di incubazione a 37 °C, misurare l'attività fibrinolitica calcolando la dimensione delle loro zone degradanti. Attività fibrinolitica = (dimensione della zona del campione/dimensione della zona dell'urochinasi) x 100 U. Dimensione della zona = diametro x diametro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seguendo questo protocollo, sono stati estratti lisati di tessuto grezzo, sono state costruite colonne cromatografiche di affinità matrice arginina-agarosio e matrice lisina-agarosio, è stata ottenuta sFE purificata e la purezza e l'attività fibrinolitica della sFE purificata sono state misurate rispettivamente da SDS-PAGE e piastre di fibrina.
Dopo la centrifugazione, il surnatante raccolto era un liquido viscoso marrone chiaro. Le precipitazioni sono iniziate quando questo surnatante è stato miscelato con una soluzione satura di solfato di ammonio (nove volumi). Dopo essere rimasto in piedi per 12 ore, si è formato un forte precipitato sul fondo del tubo. Quando è stato risospeso con tampone Tris-HCl, il precipitato proteico è scomparso rapidamente e si è dissolto nel tampone, apparendo come un liquido giallo pallido trasparente.
Quando la soluzione proteica è stata caricata sulla colonna di affinità della matrice arginina-agarosio, un picco evidente (picco 1, picco di flusso) è apparso a ~ 40 minuti e ha smesso di eluire a ~ 66 min. Nella fase di eluizione del gradiente, quando eluito con 0,15 M NaCl, un picco evidente (picco 2, picco di eluizione) è apparso a ~94 min e ha smesso di eluire a ~110 min. Non sono comparsi picchi di eluizione evidenti nelle restanti fasi di eluizione (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M e 0,65 M NaCl) (Figura 1A). In questo studio, abbiamo riutilizzato la colonna di affinità della matrice arginina-agarosio fino a 10 volte e abbiamo scoperto che le prestazioni della colonna non erano cambiate in modo significativo.
Quando la soluzione proteica è stata caricata nella colonna di affinità della matrice lisina-agarosio, un picco evidente (picco 1, picco di flusso) è apparso a ~ 38 minuti e ha smesso di eluire a ~ 60 min. Nella fase di eluizione del gradiente, quando eluito con 0,15 M NaCl, un picco evidente (picco 2, picco di eluizione) è apparso a ~80 min e ha smesso di eluire a ~86 min. Non sono apparsi picchi di eluizione evidenti nelle restanti fasi di eluizione (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M e 0,65 M NaCl (Figura 1B). I profili di eluizione della colonna di affinità della matrice arginina-agarosio e della colonna di affinità della matrice lisina-agarosio erano simili. Come accennato in precedenza, il riutilizzo della colonna di affinità della matrice arginina-agarosio fino a 10 volte non ha alterato le prestazioni di questa colonna.
La sFE purificata (10 μL, campione di picco di eluizione, picco 2) è stata aggiunta alla piastra di fibrina preparata. Inoltre, 10 μL di urochinasi (100 U), 10 μL di tampone fisiologico salino e 10 μL di proteina grezza (campione ottenuto nella fase 1.3.1 del protocollo) sono stati utilizzati rispettivamente per il controllo positivo, il bianco e il controllo negativo. Dopo 18 ore di incubazione, due piastre di fibrina hanno presentato risultati simili: una zona di lisatura (1,3 cm di diametro) è apparsa nel controllo dell'urochinasi; nessuna zona di lisatura è stata osservata nel tampone fisiologico salino; una zona di lisatura (2,1 cm di diametro) è apparsa nel pozzo proteico grezzo; e una zona di lisatura (1,8 cm di diametro) è apparsa nel pozzo sFE purificato (Figura 2). Rispetto all'urochinasi, abbiamo scoperto che l'attività fibrinolitica della sFE purificata era ~ 19.200 U / ml. Poiché il campione del picco di eluizione è stato regolato allo stesso volume di quello del campione caricato sulla colonna di affinità, il tasso di recupero della colonna di affinità è indicato dalla dimensione (diametro x diametro) della zona di lisatura sulla piastra di fibrina. Il tasso di recupero della colonna di affinità era ~ 73,5%.
Per l'analisi della purezza sono state utilizzate la proteina grezza (campione ottenuto nella fase 1.3.1 del protocollo) e la sFE purificata (campione di picco di eluizione, picco 2). Dopo SDS-PAGE e colorazione, tre bande proteiche principali (25, 26 e 27 kD) e sei bande minori (20, 24, 28, 35, 40 e 45 kD) sono state presentate nella proteina grezza. Una banda maggiore (27 kD) e due bande minori (26 e 28 kD) sono state presentate nella sFE purificata (Figura 3). Attraverso l'analisi del valore di grigio, abbiamo scoperto che la purezza della sFE purificata era pari a ~ 92%.
Figura 1: Il profilo della purificazione di affinità. (A) Il campione grezzo di sFE è stato purificato mediante purificazione di affinità della matrice di arginina-agarosio. Un evidente picco di flusso è apparso a ~ 40 min e ha smesso di eluire a ~ 66 min. Un evidente picco di eluizione è apparso a ~94 min e ha smesso di eluire a ~110 min. (B) Il campione grezzo di sFE è stato purificato mediante purificazione di affinità della matrice lisina-agarosio. Un evidente picco di flusso è apparso a ~ 38 minuti e ha smesso di eluire a ~ 60 min. Un evidente picco di eluizione è apparso a ~ 80 min e ha smesso di eluire a ~ 86 min. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Valutazione dell'attività fibrinolitica. I campioni sono stati aggiunti alla piastra di fibrina e la loro attività fibrinolitica è stata misurata e valutata dalle loro zone degradanti sulla piastra dopo 18 ore. I campioni trattati in modo diverso sono indicati da numeri arabi rossi. (A) L'attività fibrinolitica di sFE purificata dalla colonna di affinità della matrice arginina-agarosio. #1, 100 U di urochinasi; #2, tampone fisiologico salino; #3, proteina grezza (campione ottenuto nella fase 1.3.1 del protocollo); #4, sFE purificato (campione di picco di eluizione, picco 2). (B) L'attività fibrinolitica di sFE purificata dalla colonna di affinità della matrice lisina-agarosio. #1, 100 U di urochinasi; #2, tampone fisiologico salino; #3, proteina grezza (campione ottenuto nella fase 1.3.1 del protocollo); #4, sFE purificato (campione di picco di eluizione, picco 2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Analisi della purezza. La purezza della sFE purificata è stata analizzata da SDS-PAGE. (A) La purezza di sFE purificata dalla colonna di affinità della matrice arginina-agarosio. M: marcatore proteico; corsia 1: proteina grezza (campione ottenuto nella fase 1.3.1 del protocollo); corsia 2: sFE purificata (campione di picco di eluizione, picco 2). (B) La purezza di sFE purificata dalla colonna di affinità della matrice lisina-agarosio. M: marcatore proteico; corsia 1: proteina grezza (campione ottenuto nella fase 1.3.1 del protocollo); corsia 2: sFE purificata (campione di picco di eluizione, picco 2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
File supplementare 1: 8ZHP: Struttura cristallina di snFPITE-n1. Un rapporto di convalida strutturale a raggi X PDB. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: 8ZHO: Struttura cristallina di snFPITE-n2. Un rapporto di convalida strutturale a raggi X PDB. Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A causa dell'indisponibilità dell'esatta sequenza genica di sFE, la sFE attualmente utilizzata è stata estratta da S. nudus14 fresco. Inoltre, le procedure di purificazione di sFE riportate in letteratura erano complicate e costose, in quanto basate su alcune caratteristiche generali di sFE, come il peso molecolare, il punto isoelettrico, la forza ionica e la polarità15,16. Nessun protocollo di purificazione di affinità di sFE è stato riportato fino ad oggi. In questo studio, è stato sviluppato con successo un protocollo di purificazione di affinità di sFE basato sulla conoscenza della sua struttura cristallina. Rispetto ai metodi di purificazione riportati, questo metodo di purificazione per affinità era facile da usare, economico e facile da usare. Inoltre, utilizzando questo metodo è stato osservato un tasso di recupero considerevolmente più elevato della sFE attiva.
Sebbene siano stati riportati molti metodi di purificazione dell'affinità degli enzimi fibrinolitici, erano basati su anticorpi 17, inibitori18, ligandi e recettori16. La preparazione di questi anticorpi, inibitori, ligandi e recettori è tecnicamente impegnativa e laboriosa. Inoltre, sono necessari ulteriori sforzi per coniugare queste molecole alla matrice. Al contrario, la matrice arginina-agarosio e la matrice lisina-agarosio sono materiali commerciali, pronti all'uso, altamente stabili e facili da scalare19. Recentemente, la matrice lisina-agarosio è stata utilizzata per la purificazione di affinità del plasminogeno20,21; Tuttavia, il plasminogeno è il pro-enzima della plasmina, non una forma attiva15. Rimane incerto se la matrice lisina-agarosio sia adatta per la purificazione di affinità della plasmina. Teoricamente, la sFE purificata utilizzando la matrice arginina-agarosio e la matrice lisina-agarosio in questo studio è solo la forma attiva, perché il modello cristallino ha indicato che solo le triadi catalitiche di sFE possono interagire con i residui di arginina e lisina. Pertanto, questo protocollo potrebbe essere applicato nella purificazione di altre plasmina serina, accelerando lo sviluppo di altri farmaci a base di serina plasmina.
Poiché il legame tra sFE e la colonna di affinità non è molto forte, mantenere una concentrazione esatta di NaCl e una corretta velocità di eluizione sono molto critici per una purificazione di successo. Un altro fattore chiave è il pH del sistema, che influisce gravemente sulla purificazione. Questi tre parametri sono stati ottimizzati da noi. Certo, il tasso di recupero della sFE attiva in questo studio era relativamente basso e potrebbe essere stato limitato dal basso numero di residui di arginina o lisina disponibili sulla superficie della matrice di agarosio. Pertanto, il legame tra lisina / arginina e matrice di agarosio deve essere allungato per migliorare il suo tasso di recupero. Nel frattempo, non abbiamo potuto escludere la possibilità che altre proteine della serina con una triade catalitica simile a quella di sFE vengano eluite sotto questo sistema. Quindi, è meglio aggiungere una tecnologia di purificazione basata sul peso molecolare, come l'ultrafiltrazione, per separare le altre proteine della serina da sFE. Allo stesso modo, molti altri problemi come il miglioramento della capacità di legame, il prolungamento della durata e l'ulteriore semplificazione della procedura dovrebbero essere affrontati nel lavoro futuro mediante strategie appropriate (ad esempio, sostituendo l'arginina / lisina con poli arginina / lisina e modificando il linker).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata dall'Ufficio per la scienza e la tecnologia della città di Xiamen (3502Z20227197) e dall'Ufficio per la scienza e la tecnologia della provincia del Fujian (n. 2019J01070, n. 2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B.
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
