Summary
Здесь мы представляем метод аффинной очистки фибринолитического фермента из Sipunculus nudus , который является простым, недорогим и эффективным.
Abstract
Фибринолитический фермент из Sipunculus nudus (sFE) является новым фибринолитическим агентом, который может как активировать плазминоген в плазмин, так и напрямую расщеплять фибрин, демонстрируя большие преимущества по сравнению с традиционными тромболитическими агентами. Однако из-за недостатка структурной информации все программы очистки sFE основаны на многоступенчатых хроматографических очистках, которые являются слишком сложными и дорогостоящими. Здесь впервые разработан протокол аффинной очистки sFE на основе кристаллической структуры sFE; он включает в себя подготовку сырого образца и колонки аффинной хроматографии лизина/аргинин-агарозной матрицы, аффинную очистку и характеристику очищенного sFE. Следуя этому протоколу, партия sFE может быть очищена в течение 1 дня. Кроме того, чистота и активность очищенного sFE увеличивается до 92% и 19 200 Ед/мл соответственно. Таким образом, это простой, недорогой и эффективный подход к очистке sFE. Разработка этого протокола имеет большое значение для дальнейшего использования sFE и других подобных агентов.
Introduction
Тромбоз представляет собой серьезную угрозу для здоровья населения, особенно после глобальной пандемии Covid-19 1,2. Клинически многие активаторы плазминогена (ПА), такие как активатор плазминогена тканевого типа (tPA) и урокиназа (Великобритания), широко используются в качестве тромболитических препаратов. ПА могут активировать плазминоген пациентов в активный плазмин для расщепления фибрина. Таким образом, их тромболитическая эффективность сильно ограничена плазминогенным статусом пациентов 3,4. Фибринолитические агенты, такие как металлопротеиназная плазмина и сериновый плазмин, являются еще одним типом клинических тромболитических препаратов, которые также включают фибринолитические ферменты (ФЭ), такие как плазмин, которые могут растворять сгустки напрямую, но быстро инактивируются различными ингибиторами плазмина5. Впоследствии сообщалось о новом типе фибринолитического агента, который может растворять тромб, не только активируя плазминоген в плазмин, но и разлагая непосредственно фибрин 6-фибринолитический фермент древнего арахисового червя Sipunculus nudus (sFE)6. Эта бифункция наделяет sFE другими преимуществами по сравнению с традиционными тромболитическими препаратами, особенно с точки зрения аномального статуса плазминогена. По сравнению с другими бифункциональными фибринолитическими агентами 7,8,9, sFE демонстрирует ряд преимуществ, включая безопасность, по сравнению с непищевыми агентами для разработки лекарств, особенно для пероральных препаратов. Это связано с тем, что биобезопасность и биосовместимость Sipunculus nudus хорошо известны10.
Подобно другим природным фибринолитическим агентам, выделенным из микроорганизмов, дождевых червей и грибов, очистка sFE от S. nudus очень сложна и включает в себя несколько этапов, таких как гомогенизация тканей, осаждение сульфата аммония, опреснение, анионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и молекулярное просеивание10,11,12. Такая система очистки не только зависит от профессиональных навыков и дорогостоящих материалов, но и требует нескольких дней для завершения всей процедуры. Поэтому простая программа очистки sFE имеет большое значение для дальнейшего развития sFE. К счастью, два кристалла sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) были успешно получены (см. Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2). Благодаря структурному анализу и экспериментам по молекулярному стыковочному соединению мы обнаружили, что каталитическое ядро sFE может специфически связываться с мишенями, содержащими остатки аргинина или лизина.
Здесь впервые предложена система аффинной очистки, основанная на кристаллической структуре sFE. Следуя этому протоколу, высокочистый и высокоактивный sFE может быть очищен от сырых экстрактов на одной стадии аффинной очистки. Разработанный здесь протокол важен не только для крупномасштабного приготовления sFE, но также может быть применен для очистки других фибринолитических агентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
- Обработка образцов
- Тщательно препарируют свежий S. nudus (100 г) и собирают кишечник и его внутреннюю жидкость.
- Добавьте 300 мл буфера Tris-HCl (0,02 М, pH 7,4) для гомогенизации (1000 об/мин, 60 с).
- Заморозьте-разморозьте гомогенат 3 раза.
- Центрифугируют пробу (10,956 × г, 0,5 ч, 4 °C) и собирают надосадочную жидкость. Храните образец при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
- Осаждение белка
- Смешайте надосадочную жидкость с насыщенным раствором сульфата аммония (девять объемов) и дайте смеси настояться 12 ч при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть поставлен на паузу здесь и продолжен позже. - Центрифуга (10,956 × г, 0,5 ч, 4 °С) для получения белкового осадка; хранить при температуре 4 °C для последующего использования.
- Смешайте надосадочную жидкость с насыщенным раствором сульфата аммония (девять объемов) и дайте смеси настояться 12 ч при 4 °C.
- Ресуспендирование белка
- Ресуспендируют белковый осадок с 30 мл буфера Tris-HCl (0,02 М, рН 7,4). Храните этот раствор сырого протеина при температуре 4 °C для последующего использования.
2. Аффинная хроматография
- Фильтрация раствора
- Отфильтруйте раствор сырого белка через фильтрующую мембрану 0,22 мкм. Храните этот образец при температуре 4 °C для последующего использования.
- Упаковка колонн
- Упакуйте колонку аффинной хроматографии аргинин-агарозной матрицы и колонку аффинной хроматографии лизин-агарозной матрицы, загрузив соответствующее количество матричной среды лизин-агарозы и матричной среды аргинин-агарозы в пустые хроматографические колонки объемом 5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Колонку можно хранить при температуре 2-8 °C, при этом матрица погружена в буфер хранения (20% этанол).
- Упакуйте колонку аффинной хроматографии аргинин-агарозной матрицы и колонку аффинной хроматографии лизин-агарозной матрицы, загрузив соответствующее количество матричной среды лизин-агарозы и матричной среды аргинин-агарозы в пустые хроматографические колонки объемом 5 мл.
- Аффинное очищение
- Сначала уравновесьте колонку аффинной хроматографии ddH2O (1 мл / мин, объем 10 колонок), а затем буфер Tris-HCl (0,02 М, pH 8,0, 1 мл / мин, 5 объемов колонки).
- Загрузите образец белкового раствора в предварительно уравновешенную колонку (1 мл/мин, объем 1/3 колонки).
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем загрузки пробы зависит от концентрации sFE. - Промойте колонку буфером Tris-HCl (0,02 М, рН 8,0, пять объемов колонки).
- Последовательно нанесите на колонну 0,15 М, 0,25 М, 0,35 М, 0,45 М, 0,55 М и 0,65 М NaCl (1 мл/мин, пять объемов колонны).
- Найдите пик элюирования, который должен появиться в элюировании NaCl 0,15 М, а затем соберите фракции в пробирки объемом 5 мл.
- Концентратируют элюирующий образец с помощью ультрацентробежного фильтра 3 кДа (3,944 × г, 1,5 ч, 4 °C). Храните этот образец при температуре -80 °C для последующего использования.
3. Оценка чистоты
- Приготовление геля для электрофореза полиакриламидного геля додецилсульфата натрия (SDS-PAGE)
- Приготовьте гель SDS-PAGE по методу Леммли, используя 5% концентрированный гель и 12% разделительный гель13.
- Электрофорез
- Смешайте образец (15 мкл) с 5-кратным буфером загрузки белка SDS-PAGE (1/4 объема), нагрейте в кипящей воде в течение 5 мин, загрузите на гель SDS-PAGE и запустите гель при напряжении 80 В, 60 мА в течение 1,5 часа.
- Анализ
- После электрофореза окрашивают гель с помощью набора Silver Stain Kit, согласно протоколу производителя, и наблюдают за окрашенным гелем с помощью хемилюминесцентной системы визуализации.
- Проанализируйте чистоту целевого белка по следующей формуле: чистота целевого белка = значение интенсивности целевого белка / значение интенсивности общего белка.
4. Оценка фибринолитической активности
- Подготовка фибриновой пластины
- Приготовьте раствор фибриногена, смешав 25 мг фибриногена с 1,25 мл физиологического раствора.
- Приготовьте раствор тромбина, полностью смешав 100 ЕД тромбина с 1,05 мл физиологического раствора.
- Приготовьте раствор агарозы, добавив 0,5 г агарозы к 22,5 мл буфера Tris-HCl (0,02 моль/л, рН 7,4). Смешайте и нагрейте раствор агарозы при 100 °C до полного растворения.
- Охладите раствор агарозы примерно до 50 °C и добавьте раствор фибриногена. Затем сразу же добавьте раствор тромбина, быстро перемешайте и вылейте в культуральную чашку диаметром 60 мм.
- Погрузка
- Пробить 3-миллиметровые лунки на подготовленных фибриновых пластинах с помощью стерильного бура и заполнить лунки образцами 10 мкл.
- Анализ
- После 18 ч инкубации при 37 °C измерьте фибринолитическую активность, вычислив размер их зон разложения. Фибринолитическая активность = (размер зоны образца / размер зоны урокиназы) x 100 ед. Размер зоны = диаметр х диаметр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Физиологический солевой буфер, сырой протеин (образец, полученный на этапе протокола 1.3.1) и урокиназа использовались для холостого, отрицательного и положительного контроля соответственно. По сравнению с урокиназой мы обнаружили, что фибринолитическая активность очищенного sFE составляет ~ 19 200 Ед / мл.
- После 18 ч инкубации при 37 °C измерьте фибринолитическую активность, вычислив размер их зон разложения. Фибринолитическая активность = (размер зоны образца / размер зоны урокиназы) x 100 ед. Размер зоны = диаметр х диаметр.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В соответствии с этим протоколом были извлечены лизаты сырой ткани, построены колонки хроматографии с аффинностью аргинин-агарозного матрикса и лизин-агарозного матричного матрикса, получен очищенный sFE, а чистота и фибринолитическая активность очищенного sFE были измерены с помощью SDS-PAGE и фибриновых планшетов соответственно.
После центрифугирования собранная надосадочная жидкость представляла собой прозрачную вязкую жидкость коричневого цвета. Осаждение началось, когда эту надосадочную жидкость смешали с насыщенным раствором сульфата аммония (девять объемов). После выдержки в течение 12 ч на дне трубы образовывался тяжелый осадок. Когда его ресуспендировали с буфером Tris-HCl, белковый осадок быстро исчезал и растворялся в буфере, представляя собой прозрачную бледно-желтую жидкость.
Когда раствор белка загружали в колонку аффинности аргинин-агарозной матрицы, очевидный пик (пик 1, проточный пик) появлялся через ~40 мин и прекращал элюирование через ~66 мин. На стадии градиентного элюирования при элюировании 0,15 М NaCl очевидный пик (пик 2, пик элюирования) появлялся на ~94 мин и прекращался элюирование на ~110 мин. На остальных стадиях элюирования (0,25 М, 0,35 М, 0,45 М, 0,55 М и 0,65 М NaCl) не было явных пиков элюирования (рис. 1А). В этом исследовании мы повторно использовали столбец аффинности аргинин-агарозной матрицы до 10 раз и обнаружили, что производительность колонки существенно не изменилась.
Когда белковый раствор загружали в колонку аффинности лизин-агарозной матрицы, очевидный пик (пик 1, проточный пик) появлялся через ~38 мин и прекращал элюирование через ~60 мин. На стадии градиентного элюирования при элюировании 0,15 М NaCl очевидный пик (пик 2, пик элюирования) появлялся через ~80 мин и прекращался элюирование через ~86 мин. На остальных стадиях элюирования (0,25 М, 0,35 М, 0,45 М, 0,55 М и 0,65 М NaCl) явных пиков элюирования не наблюдалось (рис. 1B). Профили элюирования колонки аффинности аргинин-агарозной матрицы и колонки аффинности лизин-агарозной матрицы были аналогичными. Как упоминалось ранее, повторное использование столбца аффинности аргинин-агарозной матрицы до 10 раз не изменило производительность этого столбца.
Очищенный sFE (10 мкл, образец пика элюирования, пик 2) добавляли в подготовленную фибриновую пластину. Кроме того, 10 мкл урокиназы (100 ЕД), 10 мкл физиологического буфера и 10 мкл сырого белка (образец, полученный на этапе протокола 1.3.1) использовали для положительного контроля, пустого и отрицательного контроля соответственно. Через 18 ч инкубации две фибриновые пластинки показали сходные результаты: в контроле урокиназы появилась зона лизинга (диаметр 1,3 см); В физиологическом солевом буфере зоны лизинга не наблюдалось; в лунке сырого протеина появилась зона лизинга (диаметр 2,1 см); и в очищенной скважине sFE появилась зона лизинга (диаметр 1,8 см) (рис. 2). По сравнению с урокиназой мы обнаружили, что фибринолитическая активность очищенного sFE составляет ~ 19 200 Ед / мл. Поскольку образец пика элюирования был отрегулирован до того же объема, что и у образца, загруженного на аффинную колонку, скорость восстановления аффинной колонки определяется размером (диаметр х диаметр) зоны лизинга на фибриновой пластине. Коэффициент восстановления столбца аффинити составил ~73,5%.
Для анализа чистоты использовали сырой протеин (образец, полученный на этапе протокола 1.3.1) и очищенный sFE (образец пика элюирования, пик 2). После SDS-PAGE и окрашивания в сыром белке были представлены три основные белковые полосы (25, 26 и 27 кДа) и шесть второстепенных полос (20, 24, 28, 35, 40 и 45 кДа). Одна большая полоса (27 кДа) и две второстепенные полосы (26 и 28 кДа) были представлены в очищенном sFE (рис. 3). С помощью анализа значений серого мы обнаружили, что чистота очищенного sFE достигает ~ 92%.
Рисунок 1: Профиль аффинной очистки . (A) Образец сырого sFE был очищен аффинной очисткой аргинин-агарозной матрицы. Очевидный пик прохождения появился на ~ 40 минуте и прекратил элюирование на ~ 66 минуте. Очевидный пик элюирования возник на ~94 мин и прекратил элюирование на ~110 мин. (B) Образец сырого sFE очищали сродством лизин-агарозной матрицы. Очевидный проточный пик появился на ~38 минуте и перестал элюировать на ~60 минуте. Очевидный пик элюирования появился на ~ 80 минуте и прекратил элюирование на ~ 86 минуте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оценка фибринолитической активности. Образцы добавляли к фибриновой пластине, и их фибринолитическую активность измеряли и оценивали по их зонам разложения на пластине через 18 часов. По-разному обработанные образцы обозначаются красными арабскими цифрами. (А) Фибринолитическая активность sFE, очищенного колонкой аффинности аргинин-агарозного матрикса. #1, 100 ЕД урокиназы; #2, физиологический солевой буфер; #3, сырой протеин (образец, полученный на этапе протокола 1.3.1); #4, очищенный sFE (образец пика элюирования, пик 2). (B) Фибринолитическая активность sFE, очищенная колонкой аффинности лизин-агарозного матрикса. #1, 100 ЕД урокиназы; #2, физиологический солевой буфер; #3, сырой протеин (образец, полученный на этапе протокола 1.3.1); #4, очищенный sFE (образец пика элюирования, пик 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ чистоты. Чистота очищенного sFE была проанализирована с помощью SDS-PAGE. (A) Чистота sFE, очищенного колонкой аффинности аргинин-агарозной матрицы. M: белковый маркер; полоса 1: сырой протеин (образец, полученный на этапе протокола 1.3.1); полоса 2: очищенный sFE (образец пика элюирования, пик 2). (B) Чистота sFE, очищенного с помощью колонки сродства лизин-агарозной матрицы. M: белковый маркер; полоса 1: сырой протеин (образец, полученный на этапе протокола 1.3.1); полоса 2: очищенный sFE (образец пика элюирования, пик 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: 8ZHP: Кристаллическая структура snFPITE-n1. Отчет о проверке рентгеновских структур PDB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2: 8ZHO: Кристаллическая структура snFPITE-n2. Отчет о проверке рентгеновских структур PDB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Из-за отсутствия точной последовательности генов sFE используемый в настоящее время sFE был извлечен из свежего S. nudus14. Кроме того, процедуры очистки sFE, описанные в литературе, были сложными и дорогостоящими, поскольку они основывались на некоторых общих характеристиках sFE, таких как молекулярная масса, изоэлектрическая точка, ионная сила и полярность15,16. До настоящего времени не сообщалось о протоколе аффинной очистки sFE. В данном исследовании был успешно разработан протокол аффинной очистки sFE, основанный на знании его кристаллической структуры. По сравнению с представленными методами очистки, этот метод аффинной очистки был простым в эксплуатации, недорогим и удобным для пользователя. Кроме того, при использовании этого метода наблюдалась значительно более высокая скорость извлечения активного sFE.
Хотя сообщалось о многих методах аффинной очистки фибринолитических ферментов, они были основаны на антителах17, ингибиторах 18, лигандах и рецепторах16. Приготовление этих антител, ингибиторов, лигандов и рецепторов является технически сложным и трудоемким. Более того, необходимы дополнительные усилия для сопряжения этих молекул с матрицей. Напротив, аргинин-агарозная матрица и лизин-агарозная матрица являются коммерческими материалами, готовыми к использованию, высокостабильными и легко масштабируемыми19. В последнее время лизин-агарозная матрица была использована для аффинной очистки плазминогена20,21; Однако плазминоген является проферментом плазмина, а не активной формой15. Остается неясным, подходит ли лизин-агарозная матрица для аффинной очистки плазмина. Теоретически sFE, очищенный с использованием аргинин-агарозной матрицы и лизин-агарозной матрицы в этом исследовании, является только активной формой, поскольку кристаллическая модель показала, что только каталитические триады sFE могут взаимодействовать с остатками аргинина и лизина. Следовательно, этот протокол может быть применен при очистке других сериновых плазминов, ускоряя разработку других сериновых плазминовых препаратов.
Поскольку связь между sFE и аффинной колонкой не очень сильна, поддержание точной концентрации NaCl и надлежащей скорости элюирования очень важны для успешной очистки. Еще одним ключевым фактором является рН системы, который сильно влияет на очистку. Эти три параметра были оптимизированы нами. Следует признать, что скорость извлечения активного sFE в этом исследовании была относительно низкой и, возможно, была ограничена небольшим количеством доступных остатков аргинина или лизина на поверхности агарозной матрицы. Следовательно, связующее звено между лизином/аргинином и агарозной матрицей необходимо удлинить, чтобы повысить скорость его восстановления. Между тем, мы не могли исключить возможность того, что другие сериновые белки с аналогичной каталитической триадой, как sFE, будут элюированы в этой системе. Таким образом, лучше добавить технологию очистки на основе молекулярной массы, такую как ультрафильтрация, чтобы отделить другие сериновые белки от sFE. Аналогичным образом, многие другие проблемы, такие как повышение связывающей способности, продление срока службы и дальнейшее упрощение процедуры, должны быть решены в будущей работе с помощью соответствующих стратегий (например, замена аргинина/лизина полиаргинином/лизином и модификация линкера).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Научно-техническим бюро города Сямынь (3502Z20227197) и Научно-техническим бюро провинции Фуцзянь (No 2019J01070, No 2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B.
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
