Summary
Aquí, presentamos un método de purificación de afinidad de una enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus que es simple, económico y eficiente.
Abstract
La enzima fibrinolítica de Sipunculus nudus (sFE) es un nuevo agente fibrinolítico que puede activar el plasminógeno en plasmina y degradar la fibrina directamente, mostrando grandes ventajas sobre los agentes trombolíticos tradicionales. Sin embargo, debido a la falta de información estructural, todos los programas de purificación para sFE se basan en purificaciones por cromatografía de varios pasos, que son demasiado complicadas y costosas. Aquí, se desarrolla por primera vez un protocolo de purificación de afinidad de sFE basado en una estructura cristalina de sFE; incluye la preparación de la muestra cruda y la columna de cromatografía de afinidad de la matriz lisina/arginina-agarosa, la purificación de afinidad y la caracterización del sFE purificado. Siguiendo este protocolo, un lote de sFE se puede purificar en 1 día. Además, la pureza y la actividad del sFE purificado aumentan a 92% y 19,200 U/mL, respectivamente. Por lo tanto, este es un enfoque simple, económico y eficiente para la purificación de sFE. El desarrollo de este protocolo es de gran importancia para la utilización posterior de sFE y otros agentes similares.
Introduction
La trombosis es una amenaza importante para la salud pública, especialmente después de la pandemia mundial de Covid-19 1,2. Clínicamente, muchos activadores del plasminógeno (AP), como el activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA) y la uroquinasa (Reino Unido), se han utilizado ampliamente como fármacos trombolíticos. Los PA pueden activar el plasminógeno de los pacientes en plasmina activa para degradar la fibrina. Así, su eficiencia trombolítica está fuertemente restringida por el estado plasminógeno de los pacientes 3,4. Los agentes fibrinolíticos, como la metaloproteinasa plasmina y la serina plasmina, son otro tipo de fármaco trombolítico clínico que también incluye enzimas fibrinolíticas (FE) como la plasmina, que pueden disolver los coágulos directamente, pero son rápidamente inactivados por varios inhibidores de la plasmina5. Posteriormente, se ha informado de un nuevo tipo de agente fibrinolítico que puede disolver el trombo no solo activando el plasminógeno en plasmina, sino también degradando la fibrina directamente 6-la enzima fibrinolítica del antiguo gusano del maní Sipunculus nudus (sFE)6. Esta bifunción otorga a sFE otras ventajas sobre los fármacos trombolíticos tradicionales, especialmente en términos de estado anormal del plasminógeno. En comparación con otros agentes fibrinolíticos bifuncionales 7,8,9, la sFE muestra varias ventajas, incluida la seguridad, sobre los agentes no derivados de alimentos para el desarrollo de fármacos, especialmente para medicamentos orales. Esto se debe a que la bioseguridad y biocompatibilidad de Sipunculus nudus han sido bien establecidas10.
Al igual que los otros agentes fibrinolíticos naturales aislados de microorganismos, lombrices de tierra y hongos, la purificación de sFE de S. nudus es muy complicada e incluye múltiples etapas, como homogeneización tisular, precipitación de sulfato de amonio, desalinización, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y tamizado molecular10,11,12. Tal sistema de purificación no solo depende de habilidades competentes y materiales costosos, sino que también requiere varios días para completar todo el procedimiento. Por lo tanto, un programa simple de purificación de sFE es de gran importancia para el desarrollo posterior de sFE. Afortunadamente, dos cristales de sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) se han obtenido con éxito (ver Archivo Suplementario 1 y Archivo Suplementario 2). A través del análisis estructural y los experimentos de acoplamiento molecular, encontramos que el núcleo catalítico de sFE podría unirse específicamente a objetivos que contienen residuos de arginina o lisina.
Aquí, se propuso por primera vez un sistema de purificación de afinidad, basado en la estructura cristalina de sFE. Siguiendo este protocolo, la sFE altamente pura y altamente activa podría purificarse a partir de los extractos crudos en una sola etapa de purificación de afinidad. El protocolo desarrollado aquí no solo es importante para la preparación a gran escala de sFE, sino que también se puede aplicar para la purificación de otros agentes fibrinolíticos.
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Protocol
1. Preparación
- Tratamiento de la muestra
- Diseccionar cuidadosamente S. nudus fresco (100 g) y recoger el intestino y su líquido interno.
- Añadir 300 ml de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) para homogeneización (1.000 rpm, 60 s).
- Congelar-descongelar el homogeneizado 3x.
- Centrifugar la muestra (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) y recoger el sobrenadante. Conservar la muestra a 4 °C hasta su uso posterior.
- Precipitación de proteínas
- Mezclar el sobrenadante con una solución saturada de sulfato de amonio (nueve volúmenes) y dejar reposar la mezcla durante 12 h a 4 °C.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí y continuar más tarde. - Centrífuga (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) para obtener el precipitado proteico; Almacénelo a 4 °C para su uso posterior.
- Mezclar el sobrenadante con una solución saturada de sulfato de amonio (nueve volúmenes) y dejar reposar la mezcla durante 12 h a 4 °C.
- Resuspensión proteica
- Resuspender el precipitado proteico con 30 mL de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Conservar esta solución de proteína cruda a 4 °C para su uso posterior.
2. Cromatografía de afinidad
- Filtración de soluciones
- Filtrar la solución de proteína cruda a través de una membrana filtrante de 0,22 μm. Conservar esta muestra a 4 °C para su uso posterior.
- Embalaje de columnas
- Empaque la columna de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y la columna de cromatografía de afinidad de matriz de lisina-agarosa cargando una cantidad adecuada de medio de matriz de lisina-agarosa y medio de matriz de arginina-agarosa en columnas de cromatografía vacías de 5 ml.
NOTA: La columna se puede almacenar a 2-8 °C, con la matriz sumergida en tampón de almacenamiento (20% de etanol).
- Empaque la columna de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y la columna de cromatografía de afinidad de matriz de lisina-agarosa cargando una cantidad adecuada de medio de matriz de lisina-agarosa y medio de matriz de arginina-agarosa en columnas de cromatografía vacías de 5 ml.
- Purificación de afinidad
- Equilibrar la columna de cromatografía de afinidad con ddH2O primero (1 mL/min, 10 volúmenes de columna), seguido de tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/min, 5 volúmenes de columna).
- Cargue la muestra de solución de proteína en la columna preequilibrada (1 ml/min, volumen de 1/3 columna).
NOTA: El volumen de carga de la muestra depende de la concentración de sFE. - Lave la columna con tampón Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, volúmenes de cinco columnas).
- Eluya la columna con 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M y 0,65 M NaCl (1 ml/min, cinco volúmenes de columna) sucesivamente.
- Busque el pico de elución que debe aparecer en la elución de NaCl 0.15 M y luego recoja las fracciones en tubos de 5 ml.
- Concentrar la muestra de elución utilizando un filtro ultracentrífugo de 3 kD (3.944 × g, 1,5 h, 4 °C). Conservar esta muestra a -80 °C para su uso posterior.
3. Evaluación de la pureza
- Preparación en gel de electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE)
- Preparar el gel SDS-PAGE según el método de Laemmli utilizando gel concentrado al 5% y gel de separación al 12%13.
- Electroforesis
- Mezclar la muestra (15 μL) con 5 tampón de carga de proteínas SDS-PAGE (1/4 volumen), calentar en agua hirviendo durante 5 min, cargar en el gel SDS-PAGE y hacer correr el gel a 80 V, 60 mA durante 1,5 h.
- Análisis
- Después de la electroforesis, tiñe el gel con un kit de tinción de plata, de acuerdo con el protocolo del fabricante, y observe el gel teñido utilizando un sistema de imágenes quimioluminiscentes.
- Analice la pureza de la proteína diana utilizando la siguiente fórmula: pureza de la proteína diana = valor de intensidad de la proteína diana/valor de intensidad de la proteína total.
4. Evaluación de la actividad fibrinolítica
- Preparación de la placa de fibrina
- Preparar la solución de fibrinógeno mezclando 25 mg de fibrinógeno con 1,25 ml de solución salina fisiológica.
- Prepare la solución de trombina mezclando completamente 100 U de trombina con 1,05 ml de solución salina fisiológica.
- Preparar la solución de agarosa añadiendo 0,5 g de agarosa a 22,5 ml de tampón Tris-HCl (0,02 mol/L, pH 7,4). Mezclar y calentar la solución de agarosa a 100 °C hasta que se disuelva completamente.
- Enfriar la solución de agarosa hasta unos 50 °C y añadir la solución de fibrinógeno. Luego, agregue inmediatamente la solución de trombina, mézclelos rápidamente y viértalos en una fuente de cultivo de 60 mm.
- Carga
- Perforar pocillos de 3 mm en las placas de fibrina preparadas utilizando un barrenador estéril y llenar los pocillos con muestras de 10 μL.
- Análisis
- Después de 18 h de incubación a 37 °C, medir la actividad fibrinolítica calculando el tamaño de sus zonas degradantes. Actividad fibrinolítica = (tamaño de zona de la muestra/tamaño de zona de la uroquinasa) x 100 U. Tamaño de zona = diámetro x diámetro.
NOTA: Para el control blanco, el control negativo y el control positivo se utilizaron tampón salino fisiológico, proteína cruda (muestra obtenida en el paso 1.3.1 del protocolo) y uroquinasa. En comparación con la uroquinasa, encontramos que la actividad fibrinolítica de la sFE purificada fue ~ 19,200 U / ml.
- Después de 18 h de incubación a 37 °C, medir la actividad fibrinolítica calculando el tamaño de sus zonas degradantes. Actividad fibrinolítica = (tamaño de zona de la muestra/tamaño de zona de la uroquinasa) x 100 U. Tamaño de zona = diámetro x diámetro.
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Representative Results
Siguiendo este protocolo, se extrajeron lisados tisulares crudos, se construyeron columnas de cromatografía de afinidad de matriz de arginina-agarosa y matriz de lisina-agarosa, se obtuvo sFE purificado y se midió la pureza y actividad fibrinolítica del sFE purificado mediante placas SDS-PAGE y fibrina, respectivamente.
Después de la centrifugación, el sobrenadante recogido era un líquido viscoso de color canela transparente. La precipitación comenzó cuando este sobrenadante se mezcló con una solución saturada de sulfato de amonio (nueve volúmenes). Después de estar de pie durante 12 h, se formó un fuerte precipitado en el fondo del tubo. Cuando se resuspendió con tampón Tris-HCl, el precipitado proteico desapareció rápidamente y se disolvió en el tampón, apareciendo como un líquido transparente de color amarillo pálido.
Cuando la solución de proteína se cargó en la columna de afinidad de la matriz de arginina-agarosa, apareció un pico obvio (pico 1, pico de flujo) a ~ 40 min y dejó de eluyer a ~ 66 min. En la etapa de elución de gradiente, cuando se eluyó con NaCl de 0,15 M, un pico obvio (pico 2, pico de elución) apareció a ~ 94 min y dejó de eluyer a ~ 110 min. No aparecieron picos de elución obvios en las etapas de elución restantes (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M y 0,65 M NaCl) (Figura 1A). En este estudio, reutilizamos la columna de afinidad de la matriz de arginina-agarosa hasta 10 veces y encontramos que el rendimiento de la columna no cambió significativamente.
Cuando la solución de proteína se cargó en la columna de afinidad de la matriz lisina-agarosa, apareció un pico obvio (pico 1, pico de flujo) a ~ 38 min y dejó de eluir a ~ 60 min. En la etapa de elución de gradiente, cuando se eluyó con NaCl de 0,15 M, un pico obvio (pico 2, pico de elución) apareció a ~ 80 min y dejó de eluyir a ~ 86 min. No aparecieron picos de elución obvios en las etapas de elución restantes (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M y 0,65 M NaCl (Figura 1B). Los perfiles de elución de la columna de afinidad de la matriz de arginina-agarosa y la columna de afinidad de la matriz de lisina-agarosa fueron similares. Como se mencionó anteriormente, la reutilización de la columna de afinidad de la matriz de arginina-agarosa hasta 10 veces no alteró el rendimiento de esta columna.
Se añadió sFE purificado (10 μL, muestra de pico de elución, pico 2) a la placa de fibrina preparada. Además, se utilizaron 10 μL de uroquinasa (100 U), 10 μL de tampón salino fisiológico y 10 μL de proteína cruda (muestra obtenida en la etapa 1.3.1 del protocolo) para el control positivo, blanco y control negativo, respectivamente. Después de 18 h de incubación, dos placas de fibrina presentaron resultados similares: apareció una zona de lisado (1,3 cm de diámetro) en el control uroquinasa; no se observó zona de lisación en el tampón salino fisiológico; apareció una zona de lisado (2,1 cm de diámetro) en el pozo de proteína cruda; y apareció una zona de lisado (1,8 cm de diámetro) en el pozo purificado de sFE (Figura 2). En comparación con la uroquinasa, encontramos que la actividad fibrinolítica de la sFE purificada fue ~ 19,200 U / ml. Como la muestra del pico de elución se ajustó al mismo volumen que el de la muestra cargada en la columna de afinidad, la tasa de recuperación de la columna de afinidad se indica por el tamaño (diámetro x diámetro) de la zona de lisado en la placa de fibrina. La tasa de recuperación de la columna de afinidad fue ~73.5%.
Para el análisis de pureza se utilizaron la proteína cruda (muestra obtenida en la etapa 1.3.1 del protocolo) y la sFE purificada (muestra pico de elución, pico 2). Después de SDS-PAGE y tinción, se presentaron tres bandas proteicas principales (25, 26 y 27 kD) y seis bandas menores (20, 24, 28, 35, 40 y 45 kD) en la proteína cruda. Una banda mayor (27 kD) y dos bandas menores (26 y 28 kD) se presentaron en el sFE purificado (Figura 3). A través del análisis del valor de gris, encontramos que la pureza del sFE purificado era tan alta como ~ 92%.
Figura 1: El perfil de purificación de afinidad. (A) La muestra bruta de sFE se purificó mediante purificación de afinidad de matriz de arginina-agarosa. Un pico de flujo obvio apareció en ~ 40 min y dejó de eluir en ~ 66 min. Un pico de elución obvio apareció a ~ 94 min y dejó de eluir a ~ 110 min. (B) La muestra cruda de sFE se purificó mediante purificación de afinidad de matriz lisina-agarosa. Un pico de flujo obvio apareció en ~ 38 min y dejó de eluir en ~ 60 min. Un pico de elución obvio apareció en ~ 80 min y dejó de eluir en ~ 86 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de la actividad fibrinolítica. Las muestras se añadieron a la placa de fibrina y su actividad fibrinolítica se midió y evaluó por sus zonas degradantes en la placa después de 18 h. Las muestras tratadas de manera diferente se indican con números arábigos rojos. (A) La actividad fibrinolítica de sFE purificada por la columna de afinidad de matriz arginina-agarosa. #1, 100 U de uroquinasa; #2, tampón salino fisiológico; #3, proteína cruda (muestra obtenida en el paso del protocolo 1.3.1); #4, sFE purificado (muestra de pico de elución, pico 2). (B) La actividad fibrinolítica de sFE purificada por la columna de afinidad de la matriz lisina-agarosa. #1, 100 U de uroquinasa; #2, tampón salino fisiológico; #3, proteína cruda (muestra obtenida en el paso del protocolo 1.3.1); #4, sFE purificado (muestra de pico de elución, pico 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de pureza. La pureza de sFE purificado fue analizada por SDS-PAGE. (A) La pureza de sFE purificada por la columna de afinidad de la matriz arginina-agarosa. M: marcador proteico; carril 1: proteína bruta (muestra obtenida en la etapa 1.3.1 del protocolo); carril 2: sFE purificado (muestra de pico de elución, pico 2). (B) La pureza de sFE purificada por la columna de afinidad de la matriz lisina-agarosa. M: marcador proteico; carril 1: proteína bruta (muestra obtenida en la etapa 1.3.1 del protocolo); carril 2: sFE purificado (muestra de pico de elución, pico 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: 8ZHP: Estructura cristalina de snFPITE-n1. Un informe de validación estructural de rayos X PDB. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 2: 8ZHO: Estructura cristalina de snFPITE-n2. Un informe de validación estructural de rayos X PDB. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Debido a la falta de disponibilidad de la secuencia génica exacta de sFE, la sFE utilizada actualmente se extrajo de S. nudus14 fresco. Además, los procedimientos de purificación de sFE descritos en la literatura fueron complicados y costosos, ya que se basaron en algunas características generales de sFE, como el peso molecular, el punto isoeléctrico, la fuerza iónica y la polaridad15,16. Hasta la fecha no se ha informado de ningún protocolo de purificación de afinidad de sFE. En este estudio, se desarrolló con éxito un protocolo de purificación de afinidad de sFE basado en el conocimiento de su estructura cristalina. En comparación con los métodos de purificación informados, este método de purificación de afinidad fue fácil de operar, económico y fácil de usar. Además, se observó una tasa de recuperación considerablemente mayor de la sFE activa mediante el uso de este método.
Aunque se han descrito muchos métodos de purificación de afinidad de enzimas fibrinolíticas, se basaron en anticuerpos17, inhibidores18, ligandos y receptores16. La preparación de estos anticuerpos, inhibidores, ligandos y receptores es técnicamente desafiante y laboriosa. Además, se necesitan esfuerzos adicionales para conjugar estas moléculas a la matriz. En contraste, la matriz de arginina-agarosa y la matriz de lisina-agarosa son materiales comerciales, listos para usar, altamente estables y fáciles de escalar19. Recientemente, la matriz lisina-agarosa se ha utilizado para la purificación de afinidad del plasminógeno20,21; Sin embargo, el plasminógeno es la proenzima de la plasmina, no una forma activa15. Aún no está claro si la matriz lisina-agarosa es adecuada para la purificación por afinidad de la plasmina. Teóricamente, el sFE purificado mediante el uso de la matriz de arginina-agarosa y la matriz de lisina-agarosa en este estudio es solo la forma activa, porque el modelo cristalino ha indicado que solo las tríadas catalíticas de sFE pueden interactuar con los residuos de arginina y lisina. Por lo tanto, este protocolo podría aplicarse en la purificación de otra serina plasmina, acelerando el desarrollo de otros fármacos de serina plasmina.
Debido a que la unión entre sFE y la columna de afinidad no es muy fuerte, mantener una concentración exacta de NaCl y una velocidad de elución adecuada son muy críticos para una purificación exitosa. Otro factor clave es el pH del sistema, que afecta gravemente a la purificación. Estos tres parámetros han sido optimizados por nosotros. Es cierto que la tasa de recuperación de sFE activa en este estudio fue relativamente baja, y puede haber sido restringida por el bajo número de residuos de arginina o lisina disponibles en la superficie de la matriz de agarosa. Por lo tanto, el enlace entre la lisina / arginina y la matriz de agarosa debe alargarse para mejorar su tasa de recuperación. Mientras tanto, no pudimos excluir la posibilidad de que otras proteínas serinas con una tríada catalítica similar a la sFE sean eluydas bajo este sistema. Por lo tanto, es mejor agregar una tecnología de purificación basada en el peso molecular, como la ultrafiltración, para separar las otras proteínas de serina de sFE. Del mismo modo, muchos otros problemas, como mejorar la capacidad de unión, prolongar la vida útil y simplificar aún más el procedimiento, deben abordarse en el trabajo futuro mediante estrategias correspondientes (por ejemplo, sustitución de la arginina / lisina por poli arginina / lisina y modificación del vinculador).
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por la Oficina de Ciencia y Tecnología de la ciudad de Xiamen (3502Z20227197) y la Oficina de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Fujian (No. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
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