Summary
Burada, Sipunculus nudus'tan fibrinolitik bir enzimin basit, ucuz ve verimli bir afinite saflaştırma yöntemi sunuyoruz.
Abstract
Sipunculus nudus'un (sFE) fibrinolitik enzimi, hem plazminojeni plazmine aktive edebilen hem de fibrini doğrudan parçalayabilen, geleneksel trombolitik ajanlara göre büyük avantajlar gösteren yeni bir fibrinolitik ajandır. Bununla birlikte, yapısal bilgi eksikliği nedeniyle, sFE için tüm saflaştırma programları, çok karmaşık ve maliyetli olan çok adımlı kromatografi saflaştırmalarına dayanmaktadır. Burada, sFE'nin kristal yapısına dayanan ilk kez sFE'nin bir afinite saflaştırma protokolü geliştirilmiştir; ham numunenin hazırlanmasını ve lizin/arginin-agaroz matrisi afinite kromatografisi kolonunu, afinite saflaştırmasını ve saflaştırılmış sFE'nin karakterizasyonunu içerir. Bu protokolü takiben, bir grup sFE 1 gün içinde saflaştırılabilir. Ayrıca, saflaştırılmış sFE'nin saflığı ve aktivitesi sırasıyla% 92 ve 19.200 U / mL'ye yükselir. Bu nedenle, bu sFE saflaştırması için basit, ucuz ve verimli bir yaklaşımdır. Bu protokolün geliştirilmesi, sFE ve diğer benzer ajanların daha fazla kullanımı için büyük önem taşımaktadır.
Introduction
Tromboz, özellikle Covid-19 küresel pandemisi 1,2 sonrasında halk sağlığı için büyük bir tehdittir. Klinik olarak, doku tipi plazminojen aktivatörü (tPA) ve ürokinaz (İngiltere) gibi birçok plazminojen aktivatörü (PA), trombolitik ilaçlar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. PA'lar, fibrini bozmak için hastaların plazminojenini aktif plazmine aktive edebilir. Bu nedenle, trombolitik verimlilikleri hastaların plazminojen durumu 3,4 ile büyük ölçüde kısıtlanmaktadır. Metalloproteinaz plazmin ve serin plazmin gibi fibrinolitik ajanlar, pıhtıları doğrudan çözebilen ancak çeşitli plazmin inhibitörleri tarafından hızla inaktive edilen plazmin gibi fibrinolitik enzimleri (FE) de içeren başka bir klinik trombolitik ilaç türüdür5. Daha sonra, sadece plazminojeni plazmine aktive etmekle kalmayıp, aynı zamanda eski fıstık solucanı Sipunculus nudus'tan (sFE) 6 fibrinolitik enzim olan fibrinidoğrudan parçalayarak trombüsü çözebilen yeni bir fibrinolitik ajan türü bildirilmiştir. Bu çift fonksiyonlu sFE'ye geleneksel trombolitik ilaçlara göre, özellikle anormal plazminojen durumu açısından başka avantajlar sağlar. Diğer iki fonksiyonlu fibrinolitik ajanlarla karşılaştırıldığında 7,8,9, sFE, özellikle oral ilaçlar için, ilaç geliştirme için gıda dışı türetilmiş ajanlara göre güvenlik de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar göstermektedir. Bunun nedeni, Sipunculus nudus'un biyogüvenliği ve biyouyumluluğunun iyi kurulmuş olmasıdır10.
Mikroorganizmalardan, solucanlardan ve mantarlardan izole edilen diğer doğal fibrinolitik ajanlara benzer şekilde, sFE'nin S. nudus'tan saflaştırılması çok karmaşıktır ve doku homojenizasyonu, amonyum sülfat çökeltmesi, tuzdan arındırma, anyon değişim kromatografisi, hidrofobik etkileşim kromatografisi ve moleküler eleme gibi çoklu aşamaları içerir10,11,12. Böyle bir saflaştırma sistemi sadece yetkin becerilere ve pahalı malzemelere bağlı değildir, aynı zamanda tüm prosedürü tamamlamak için birkaç gün gerektirir. Bu nedenle, sFE'nin basit bir saflaştırma programı, sFE'nin daha da geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Neyse ki, iki kristal sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) başarıyla elde edilmiştir (bkz. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2). Yapısal analiz ve moleküler yerleştirme deneyleri sayesinde, sFE'nin katalitik çekirdeğinin özellikle arginin veya lizin kalıntıları içeren hedeflere bağlanabileceğini bulduk.
Burada, sFE'nin kristal yapısına dayanan ilk kez bir afinite arıtma sistemi önerilmiştir. Bu protokolü izleyerek, son derece saf ve oldukça aktif sFE, tek bir afinite saflaştırma aşamasında ham ekstraktlardan saflaştırılabilir. Burada geliştirilen protokol sadece sFE'nin büyük ölçekli hazırlanması için önemli değildir, aynı zamanda diğer fibrinolitik ajanların saflaştırılması için de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırlık
- Numune tedavisi
- Taze S. nudus'u (100 g) dikkatlice diseke edin ve bağırsağı ve iç sıvısını toplayın.
- Homojenizasyon (1.000 rpm, 60 sn) için 300 mL Tris-HCl tamponu (0,02 M, pH 7,4) ekleyin.
- Homojenatı 3x dondurarak çözün.
- Numuneyi santrifüj edin (10.956 × g, 0,5 saat, 4 °C) ve süpernatanı toplayın. Numuneyi daha sonraki kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
- Protein çökeltmesi
- Süpernatantı doymuş amonyum sülfat çözeltisi (dokuz hacim) ile karıştırın ve karışımın 4 ° C'de 12 saat beklemesine izin verin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve daha sonra devam edilebilir. - Protein çökeltisini elde etmek için santrifüj (10.956 × g, 0.5 h, 4 °C); Daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
- Süpernatantı doymuş amonyum sülfat çözeltisi (dokuz hacim) ile karıştırın ve karışımın 4 ° C'de 12 saat beklemesine izin verin.
- Protein resüspansiyonu
- Protein çökeltisini 30 mL Tris-HCl tamponu (0.02 M, pH 7.4) ile yeniden askıya alın. Bu ham protein çözeltisini daha sonra kullanmak üzere 4 ° C'de saklayın.
2. Afinite kromatografisi
- Çözelti filtrasyonu
- Ham protein çözeltisini 0,22 μm'lik bir filtre membranından filtreleyin. Bu örneği daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
- Kolon paketleme
- Arjinin-agaroz matris afinite kromatografi kolonu ve lizin-agaroz matris afinite kromatografisi kolonunu, uygun miktarda lizin-agaroz matriks ortamı ve arginin-agaroz matriks ortamını 5 mL boş kromatografi kolonuna yükleyerek paketleyin.
NOT: Kolon 2-8 °C'de, matris mağaza tamponuna (%20 etanol) daldırılarak saklanabilir.
- Arjinin-agaroz matris afinite kromatografi kolonu ve lizin-agaroz matris afinite kromatografisi kolonunu, uygun miktarda lizin-agaroz matriks ortamı ve arginin-agaroz matriks ortamını 5 mL boş kromatografi kolonuna yükleyerek paketleyin.
- Afinite saflaştırma
- Afinite kromatografisi kolonunu önce ddH2O (1 mL/dak, 10 sütun hacmi), ardından Tris-HCl tamponu (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/dak, 5 sütun hacmi) ile dengeleyin.
- Protein çözeltisi numunesini önceden dengelenmiş kolona yükleyin (1 mL/dak, 1/3 sütun hacmi).
NOT: Numune yükleme hacmi, sFE konsantrasyonuna bağlıdır. - Kolonu Tris-HCl tamponu ile yıkayın (0,02 M, pH 8,0, beş sütun hacmi).
- Kolonu sırasıyla 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M ve 0,65 M NaCl (1 mL/dak, beş sütun hacmi) ile kaldırın.
- 0.15 M NaCl elüsyonunda görünmesi gereken elüsyon tepesini arayın ve ardından fraksiyonları 5 mL tüplerde toplayın.
- Elüsyon numunesini 3 kD ultra santrifüj filtre (3.944 × g, 1,5 saat, 4 °C) kullanarak konsantre edin. Bu örneği daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.
3. Saflık değerlendirmesi
- Sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jel preparatı
- SDS-PAGE jeli, %5 konsantre jel ve %12 ayırma jeli13 kullanarak Laemmli'nin yöntemine göre hazırlayın.
- Elektroforez
- Numuneyi (15 μL) 5x SDS-PAGE protein yükleme tamponu (1/4 hacim) ile karıştırın, kaynar suda 5 dakika ısıtın, SDS-PAGE jeline yükleyin ve jeli 80 V, 60 mA'da 1,5 saat boyunca çalıştırın.
- Analiz
- Elektroforezden sonra, jeli üreticinin protokolüne göre bir Gümüş Leke Kiti ile lekeleyin ve kemilüminesan görüntüleme sistemi kullanarak lekeli jeli gözlemleyin.
- Aşağıdaki formülü kullanarak hedef proteinin saflığını analiz edin: hedef proteinin saflığı = hedef proteinin yoğunluk değeri / toplam proteinin yoğunluk değeri.
4. Fibrinolitik aktivite değerlendirmesi
- Fibrin plaka hazırlama
- 25 mg fibrinojen çözeltisini 1.25 mL fizyolojik salin ile karıştırarak hazırlayın.
- 100 U trombini 1.05 mL fizyolojik salin ile tamamen karıştırarak trombin çözeltisini hazırlayın.
- 22.5 mL Tris-HCl tamponuna (0.02 mol / L, pH 7.4) 0.5 g agaroz ekleyerek agaroz çözeltisini hazırlayın. Agaroz çözeltisini karıştırın ve tamamen çözünene kadar 100 ° C'de ısıtın.
- Agaroz çözeltisini yaklaşık 50 ° C'ye kadar soğutun ve fibrinojen çözeltisi ekleyin. Ardından, hemen trombin çözeltisini ekleyin, hızlıca karıştırın ve 60 mm'lik bir kültür kabına dökün.
- Yükleme
- Steril bir delici kullanarak hazırlanan fibrin plakalara 3 mm'lik kuyular delin ve kuyucukları 10 μL numunelerle doldurun.
- Analiz
- 37 ° C'de 18 saatlik inkübasyondan sonra, bozunma bölgelerinin boyutunu hesaplayarak fibrinolitik aktiviteyi ölçün. Fibrinolitik aktivite = (numunenin bölge büyüklüğü / ürokinazın bölge boyutu) x 100 U. Bölge boyutu = çap x çap.
NOT: Fizyolojik salin tamponu, ham protein (protokol adım 1.3.1'de elde edilen örnek) ve ürokinaz sırasıyla boş, negatif kontrol ve pozitif kontrol için kullanılmıştır. Ürokinaz ile karşılaştırıldığında, saflaştırılmış sFE'nin fibrinolitik aktivitesinin ~ 19.200 U / mL olduğunu bulduk.
- 37 ° C'de 18 saatlik inkübasyondan sonra, bozunma bölgelerinin boyutunu hesaplayarak fibrinolitik aktiviteyi ölçün. Fibrinolitik aktivite = (numunenin bölge büyüklüğü / ürokinazın bölge boyutu) x 100 U. Bölge boyutu = çap x çap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolü takiben, ham doku lizatları ekstrakte edildi, arginin-agaroz matriksi ve lizin-agaroz matriks afinite kromatografisi kolonları oluşturuldu, saflaştırılmış sFE elde edildi ve saflaştırılmış sFE'nin saflığı ve fibrinolitik aktivitesi sırasıyla SDS-PAGE ve fibrin plakaları ile ölçüldü.
Santrifüjlemeden sonra, toplanan süpernatant şeffaf bronz viskoz bir sıvıydı. Yağış, bu süpernatant doymuş amonyum sülfat çözeltisi (dokuz hacim) ile karıştırıldığında başladı. 12 saat bekletildikten sonra, tüpün dibinde ağır bir çökelti oluştu. Tris-HCl tamponu ile yeniden askıya alındığında, protein çökeltisi hızla kayboldu ve tamponda çözüldü ve şeffaf soluk sarı bir sıvı olarak göründü.
Protein çözeltisi arginin-agaroz matris afinite sütununa yüklendiğinde, ~ 40 dakikada belirgin bir tepe noktası (tepe 1, akış zirvesi) ortaya çıktı ve ~ 66 dakikada salınımı durdurdu. Gradyan elüsyon aşamasında, 0.15 M NaCl ile salınımlandığında, ~ 94 dakikada belirgin bir tepe noktası (tepe 2, elüsyon zirvesi) ortaya çıktı ve ~ 110 dakikada salınımı durdurdu. Kalan elüzyon aşamalarında belirgin bir elüsyon zirvesi görülmemiştir (0.25 M, 0.35 M, 0.45 M, 0.55 M ve 0.65 M NaCl) (Şekil 1A). Bu çalışmada arginin-agaroz matriks afinite kolonunu 10 defaya kadar tekrar kullandık ve kolonun performansının anlamlı olarak değişmediğini tespit ettik.
Protein çözeltisi lizin-agaroz matrisi afinite sütununa yüklendiğinde, ~ 38 dakikada belirgin bir tepe noktası (tepe 1, akış zirvesi) ortaya çıktı ve ~ 60 dakikada salınımı durdurdu. Degrade elüzyon aşamasında, 0.15 M NaCl ile salınımlandığında, ~ 80 dakikada belirgin bir tepe noktası (tepe 2, elüsyon zirvesi) ortaya çıktı ve ~ 86 dakikada salınımı durdurdu. Kalan elüzyon aşamalarında belirgin bir elüsyon zirvesi görülmemiştir (0.25 M, 0.35 M, 0.45 M, 0.55 M ve 0.65 M NaCl (Şekil 1B). Arjinin-agaroz matriks afinite kolonu ile lizin-agaroz matriks afinite kolonunun elüsyon profilleri benzerdi. Daha önce de belirtildiği gibi, arginin-agaroz matris afinite kolonunun 10 kata kadar tekrar kullanılması, bu sütunun performansını değiştirmedi.
Hazırlanan fibrin plakaya saflaştırılmış sFE (10 μL, elüsyon tepe numunesi, tepe 2) ilave edildi. Ek olarak, pozitif kontrol, boş ve negatif kontrol için sırasıyla 10 μL ürokinaz (100 U), 10 μL fizyolojik salin tamponu ve 10 μL ham protein (protokol adımı 1.3.1'de elde edilen örnek) kullanılmıştır. 18 saatlik inkübasyondan sonra, iki fibrin plakası benzer sonuçlar verdi: ürokinaz kontrolünde bir lize bölgesi (1.3 cm çapında) ortaya çıktı; fizyolojik salin tamponunda lizing bölgesi gözlenmedi; ham protein kuyusunda bir lizing bölgesi (2.1 cm çapında) ortaya çıktı; ve saflaştırılmış sFE kuyusunda bir liz bölgesi (1.8 cm çapında) ortaya çıktı (Şekil 2). Ürokinaz ile karşılaştırıldığında, saflaştırılmış sFE'nin fibrinolitik aktivitesinin ~ 19.200 U / mL olduğunu bulduk. Elüsyon tepe numunesi, afinite kolonuna yüklenen numuneninkiyle aynı hacme ayarlandığından, afinite kolonunun geri kazanım hızı, fibrin plakası üzerindeki lizing bölgesinin boyutu (çap x çap) ile gösterilir. Benzeşim sütununun iyileşme oranı ~%73.5 idi.
Saflık analizi için ham protein (protokol adımı 1.3.1'de elde edilen numune) ve saflaştırılmış sFE (elüpsiyon tepe numunesi, tepe 2) kullanılmıştır. SDS-PAGE ve boyamadan sonra, ham proteinde üç ana protein bandı (25, 26 ve 27 kD) ve altı küçük bant (20, 24, 28, 35, 40 ve 45 kD) sunulmuştur. Saflaştırılmış sFE'de bir majör bant (27 kD) ve iki minör bant (26 ve 28 kD) sunulmuştur (Şekil 3). Gri değer analizi sayesinde, saflaştırılmış sFE'nin saflığının ~% 92 kadar yüksek olduğunu bulduk.
Şekil 1: Afinite saflaştırma profili . (A) Ham sFE numunesi arginin-agaroz matrisi afinite saflaştırması ile saflaştırıldı. Belirgin bir akış zirvesi ~ 40 dakikada ortaya çıktı ve ~ 66 dakikada salınımı durdurdu. Belirgin bir elüsyon zirvesi ~ 94 dakikada ortaya çıktı ve ~ 110 dakikada salınımı durdurdu. (B) Ham sFE örneği, lizin-agaroz matris afinite saflaştırması ile saflaştırıldı. Belirgin bir akış zirvesi ~ 38 dakikada ortaya çıktı ve ~ 60 dakikada salınımı durdurdu. Belirgin bir elüsyon zirvesi ~ 80 dakikada ortaya çıktı ve ~ 86 dakikada salınımı durdurdu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fibrinolitik aktivite değerlendirmesi. Örnekler fibrin plakaya eklendi ve fibrinolitik aktiviteleri ölçüldü ve 18 saat sonra plaka üzerindeki bozunma bölgeleri ile değerlendirildi. Farklı şekilde işlenmiş örnekler kırmızı Arap rakamlarıyla gösterilir. (A) Arjinin-agaroz matriks afinite kolonu ile saflaştırılan sFE'nin fibrinolitik aktivitesi. # 1, 100 U ürokinaz; # 2, fizyolojik salin tamponu; #3, ham protein (protokol adımı 1.3.1'de elde edilen örnek); # 4, saflaştırılmış sFE (elüzyon tepe örneği, tepe 2). (B) Lizin-agaroz matris afinite sütunu tarafından saflaştırılan sFE'nin fibrinolitik aktivitesi. # 1, 100 U ürokinaz; # 2, fizyolojik salin tamponu; #3, ham protein (protokol adımı 1.3.1'de elde edilen örnek); # 4, saflaştırılmış sFE (elüzyon tepe örneği, tepe 2). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Saflık analizi. Saflaştırılmış sFE'nin saflığı SDS-PAGE ile analiz edildi. (A) Arjinin-agaroz matris afinite sütunu tarafından saflaştırılan sFE'nin saflığı. M: protein belirteci; Şerit 1: ham protein (protokol adımı 1.3.1'de elde edilen örnek); şerit 2: saflaştırılmış sFE (elüsyon tepe örneği, tepe 2). (B) Lizin-agaroz matris afinite sütunu tarafından saflaştırılan sFE'nin saflığı. M: protein belirteci; Şerit 1: ham protein (protokol adımı 1.3.1'de elde edilen örnek); şerit 2: saflaştırılmış sFE (elüsyon tepe örneği, tepe 2). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: 8ZHP: snFPITE-n1'in kristal yapısı. PDB X-ışını yapısal doğrulama raporu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: 8ZHO: snFPITE-n2'nin kristal yapısı. PDB X-ışını yapısal doğrulama raporu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
sFE'nin tam gen dizisinin bulunamaması nedeniyle, şu anda kullanılan sFE, taze S. nudus14'ten ekstrakte edildi. Ayrıca, literatürde bildirilen sFE'nin saflaştırma prosedürleri, moleküler ağırlık, izoelektrik nokta, iyonik mukavemet ve polarite15,16 gibi sFE'nin bazı genel özelliklerine dayandığı için karmaşık ve maliyetliydi. Bugüne kadar sFE'nin afinite saflaştırma protokolü bildirilmemiştir. Bu çalışmada, sFE'nin afinite saflaştırma protokolü, kristal yapısının bilgisine dayanarak başarıyla geliştirilmiştir. Bildirilen saflaştırma yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu afinite saflaştırma yönteminin kullanımı kolay, ucuz ve kullanıcı dostu idi. Ayrıca, bu yöntem kullanılarak aktif sFE'nin önemli ölçüde daha yüksek bir iyileşme oranı gözlenmiştir.
Fibrinolitik enzimlerin birçok afinite saflaştırma yöntemi bildirilmiş olmasına rağmen, antikorlar 17, inhibitörler18, ligandlar ve reseptörler16'ya dayanmaktadır. Bu antikorların, inhibitörlerin, ligandların ve reseptörlerin hazırlanması teknik olarak zor ve zahmetlidir. Dahası, bu molekülleri matrise konjuge etmek için ekstra çabalara ihtiyaç vardır. Buna karşılık, arginin-agaroz matrisi ve lizin-agaroz matrisi ticari malzemelerdir, kullanıma hazırdır, oldukça kararlıdır ve ölçeklendirilmesi kolaydır19. Son zamanlarda, plazminojen20,21'in afinite saflaştırılması için lizin-agaroz matriksi kullanılmıştır; Bununla birlikte, plazminojen plazminin pro-enzimidir, aktif bir form15 değildir. Lizin-agaroz matriksinin plazminin afinite saflaştırılması için uygun olup olmadığı belirsizliğini korumaktadır. Teorik olarak, bu çalışmada arginin-agaroz matrisi ve lizin-agaroz matrisi kullanılarak saflaştırılan sFE sadece aktif formdur, çünkü kristal modeli sadece sFE'nin katalitik üçlülerinin arginin ve lizin kalıntıları ile etkileşime girebileceğini göstermiştir. Bu nedenle, bu protokol diğer serin plazminin saflaştırılmasında uygulanabilir ve diğer serin plazmin ilaçlarının gelişimini hızlandırır.
sFE ve afinite sütunu arasındaki bağlanma çok güçlü olmadığından, tam bir NaCl konsantrasyonunun ve uygun elüsyon hızının korunması, başarılı saflaştırma için çok önemlidir. Bir diğer önemli faktör, arıtmayı ciddi şekilde etkileyen sistemin pH'ıdır. Bu üç parametre tarafımızdan optimize edilmiştir. Kuşkusuz, bu çalışmada aktif sFE'nin geri kazanım oranı nispeten düşüktü ve agaroz matrisinin yüzeyindeki mevcut arginin kalıntılarının veya lizin kalıntılarının düşük sayısı ile sınırlandırılmış olabilir. Bu nedenle, lizin / arginin ve agaroz matrisi arasındaki bağlantının, iyileşme oranını arttırmak için uzatılması gerekir. Bu arada, sFE ile benzer bir katalitik üçlüye sahip diğer serin proteinlerinin bu sistem altında salınım olasılığını dışlayamayız. Bu nedenle, diğer serin proteinlerini sFE'den ayırmak için ultrafiltrasyon gibi moleküler ağırlığa dayalı bir saflaştırma teknolojisi eklemek daha iyidir. Benzer şekilde, bağlanma kabiliyetinin arttırılması, ömrün uzatılması ve prosedürün daha da basitleştirilmesi gibi diğer birçok sorun, gelecekteki çalışmalarda stratejilere göre ele alınmalıdır (örneğin, arginin / lizinin poli arginin / lizin ile değiştirilmesi ve bağlayıcının modifikasyonu).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma, Xiamen Şehri Bilim ve Teknoloji Bürosu (3502Z20227197) ve Fujian Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bürosu (No. 2019J01070, No.2021Y0027) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
- von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
- Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
- Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
- Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
- Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
- Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).
- Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
- Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
- Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
- Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
- Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
- Wiman, B.
- Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
- Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
- Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
- Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).
