Summary
ここでは、 Sipunculus nudus 由来の線溶酵素の簡便、安価、効率的なアフィニティー精製法を紹介します。
Abstract
Sipunculus nudusの線維素溶解酵素(sFE)は、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化し、フィブリンを直接分解することができる新しい線維素溶解剤であり、従来の血栓溶解剤よりも大きな利点を示します。ただし、構造情報が不足しているため、sFEのすべての精製プログラムは多段階クロマトグラフィー精製に基づいており、複雑でコストがかかりすぎます。ここでは、sFEの結晶構造に基づいてsFEのアフィニティー精製プロトコルが初めて開発されています。これには、粗サンプルとリジン/アルギニン-アガロースマトリックスアフィニティークロマトグラフィーカラムの調製、アフィニティー精製、および精製されたsFEの特性評価が含まれます。このプロトコルに従って、sFEのバッチを1日以内に精製することができます。さらに、精製されたsFEの純度と活性はそれぞれ92%と19,200 U / mLに増加します。したがって、これはsFE精製のためのシンプルで安価で効率的なアプローチです。このプロトコルの開発は、sFEおよび他の同様のエージェントのさらなる利用にとって非常に重要です。
Introduction
血栓症は、特にCovid-19の世界的大流行に続いて、公衆衛生に対する大きな脅威です1,2。臨床的には、組織型プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)やウロキナーゼ(英国)などの多くのプラスミノーゲンアクチベーター(PA)が血栓溶解薬として広く使用されています。PAは、患者のプラスミノーゲンを活性プラスミンに活性化してフィブリンを分解することができます。したがって、それらの血栓溶解効率は、患者のプラスミノーゲン状態によって大きく制限されます3,4。メタロプロテイナーゼプラスミンやセリンプラスミンなどの線溶剤は、プラスミンなどの線溶酵素(FE)も含む別のタイプの臨床血栓溶解薬であり、血栓を直接溶解できますが、さまざまなプラスミン阻害剤によって迅速に不活性化されます5。その後、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化するだけでなく、古代ピーナッツワームSipunculus nudus(sFE)の線溶酵素であるフィブリン6を直接分解することで血栓を溶解できる新しいタイプの線溶剤が報告されています6。この二重機能は、特に異常なプラスミノーゲン状態に関して、従来の血栓溶解薬に比べてsFEに他の利点を与えます。他の二官能性線維素溶解剤7,8,9と比較して、sFEは、医薬品開発、特に経口薬のための非食品由来薬剤に比べて、安全性を含むいくつかの利点を示します。これは、Sipunculus nudusのバイオセーフティと生体適合性が十分に確立されているためです10。
微生物、ミミズ、キノコから単離された他の天然線維素溶解剤と同様に、S. nudusからのsFEの精製は非常に複雑であり、組織の均質化、硫酸アンモニウム沈殿、脱塩、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、分子ふるい分けなどの複数の段階が含まれます10,11,12.そのような精製システムは、熟練したスキルと高価な材料に依存するだけでなく、手順全体を完了するのに数日かかります。したがって、sFEの簡単な精製プログラムは、sFEのさらなる発展にとって非常に重要です。幸いなことに、sFEの2つの結晶(PDB:8HZP;PDB: 8HZO) が正常に取得されました (補足ファイル 1 および補足ファイル 2 を参照)。構造解析と分子ドッキング実験により、sFEの触媒コアがアルギニンまたはリジン残基を含むターゲットに特異的に結合できることを発見しました。
ここで、sFEの結晶構造に基づくアフィニティー精製システムが初めて提案されました。このプロトコルに従うことにより、高純度で高活性のsFEを単一のアフィニティー精製段階で粗抽出物から精製することができました。ここで開発されたプロトコルは、sFEの大規模な調製に重要であるだけでなく、他の線維素溶解剤の精製にも適用できます。
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Protocol
1. 事前準備
- サンプル処理
- 新鮮な S. nudus (100 g)を慎重に解剖し、腸とその内液を集めます。
- ホモジナイズ(1,000 rpm、60 s)のために300 mLのトリス塩酸バッファー(0.02 M、pH 7.4)を加えます。
- ホモジネートを3倍凍結解凍します。
- サンプルを遠心分離(10,956 × g、0.5時間、4°C)し、上清を回収します。さらに使用するまでサンプルを4°Cで保存してください。
- タンパク質沈殿
- 上清を飽和硫酸アンモニウム溶液(9倍量)と混合し、4°Cで12時間静置します。
注: プロトコルはここで一時停止し、後で続行できます。 - 遠心分離機(10,956 × g、0.5時間、4°C)でタンパク質沈殿物を得る;後で使用するために4°Cで保管してください。
- 上清を飽和硫酸アンモニウム溶液(9倍量)と混合し、4°Cで12時間静置します。
- タンパク質再懸濁
- タンパク質沈殿物を30 mLのTris-HClバッファー(0.02 M、pH 7.4)で再懸濁します。この粗タンパク質溶液を後で使用するために4°Cで保存してください。
2. アフィニティークロマトグラフィー
- 溶液ろ過
- 粗タンパク質溶液を0.22 μmのフィルターメンブレンでろ過します。後で使用するために、このサンプルを4°Cで保存してください。
- カラムパッキング
- 適量のリジン-アガロースマトリックス培地とアルギニン-アガロースマトリックス培地を5 mLの空のクロマトグラフィーカラムにロードして、アルギニン-アガロースマトリックスアフィニティークロマトグラフィーカラムとリジン-アガロースマトリックスアフィニティークロマトグラフィーカラムを充填します。
注:カラムは、マトリックスを保存バッファー(20%エタノール)に浸した状態で、2〜8°Cで保存できます。
- 適量のリジン-アガロースマトリックス培地とアルギニン-アガロースマトリックス培地を5 mLの空のクロマトグラフィーカラムにロードして、アルギニン-アガロースマトリックスアフィニティークロマトグラフィーカラムとリジン-アガロースマトリックスアフィニティークロマトグラフィーカラムを充填します。
- アフィニティー精製
- アフィニティークロマトグラフィーカラムを最初にddH2O(1 mL/min、10カラム容量)、続いてTris-HClバッファー(0.02 M、pH 8.0、1 mL/min、5カラム容量)で平衡化します。
- タンパク質溶液サンプルを事前に平衡化したカラム(1 mL/min、1/3カラム容量)にロードします。
注:サンプル負荷量はsFEの濃度に依存します。 - トリス塩酸バッファー(0.02 M、pH 8.0、5カラム容量)でカラムを洗浄します。
- 0.15 M、0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M、および0.65 M NaCl(1 mL/min、5カラム容量)でカラムを連続して溶出します。
- 0.15 M NaCl 溶出に現れる溶出ピークを探し、5 mL チューブでフラクションを収集します。
- 3 kD超遠心フィルター(3,944 × g、1.5 h、4 °C)を使用して溶出サンプルを濃縮します。後で使用するために、このサンプルを-80°Cで保存してください。
3. 純度評価
- ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲル調製
- 5%濃縮ゲルと12%分離ゲルを用いてレムリの方法に従ってSDS-PAGEゲルを調製する13。
- 電気泳動
- サンプル(15 μL)を5x SDS-PAGEタンパク質ローディングバッファー(1/4容量)と混合し、沸騰水中で5分間加熱し、SDS-PAGEゲルにロードし、ゲルを80 V、60 mAで1.5時間分析します。
- 解析
- 電気泳動後、メーカーのプロトコルに従ってシルバーステインキットでゲルを染色し、化学発光イメージングシステムを使用して染色されたゲルを観察します。
- 標的タンパク質の純度=標的タンパク質の強度値/全タンパク質の強度値を用いて、標的タンパク質の純度を解析します。
4. 線溶活性評価
- フィブリンプレートの準備
- 25 mgのフィブリノーゲンを1.25 mLの生理食塩水と混合してフィブリノーゲン溶液を調製します。
- 100 Uのトロンビンを1.05 mLの生理食塩水と完全に混合してトロンビン溶液を調製します。
- 0.5 gのアガロースを22.5 mLのトリス塩酸緩衝液(0.02 mol/L、pH 7.4)に添加してアガロース溶液を調製します。アガロース溶液を混合し、完全に溶解するまで100°Cで加熱します。
- アガロース溶液を約50°Cまで冷却し、フィブリノーゲン溶液を加えます。次に、すぐにトロンビン溶液を加え、すばやく混合し、60 mmの培養皿に注ぎます。
- 積載
- 滅菌ボーラーを使用して準備したフィブリンプレートに3 mmウェルを打ち込み、ウェルに10 μLのサンプルを充填します。
- 解析
- 37°Cで18時間のインキュベーション後、それらの分解ゾーンのサイズを計算することにより、線溶活性を測定します。線溶活性=(サンプルのゾーンサイズ/ウロキナーゼのゾーンサイズ)x 100U。 ゾーンサイズ=直径x直径。
注:生理食塩水緩衝液、粗タンパク質(プロトコルステップ1.3.1で得られたサンプル)、およびウロキナーゼを、それぞれブランク、ネガティブコントロール、およびポジティブコントロールに使用しました。ウロキナーゼと比較して、精製されたsFEの線溶活性は~19,200 U/mLであることがわかりました。
- 37°Cで18時間のインキュベーション後、それらの分解ゾーンのサイズを計算することにより、線溶活性を測定します。線溶活性=(サンプルのゾーンサイズ/ウロキナーゼのゾーンサイズ)x 100U。 ゾーンサイズ=直径x直径。
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Representative Results
このプロトコルに従って、粗組織ライセートを抽出し、アルギニン-アガロースマトリックスおよびリジン-アガロースマトリックスアフィニティークロマトグラフィーカラムを構築し、精製sFEを取得し、精製sFEの純度および線溶活性をそれぞれSDS-PAGEおよびフィブリンプレートで測定した。
遠心分離後、回収した上清は透明な黄褐色の粘稠な液体であった。この上清を飽和硫酸アンモニウム溶液(9倍量)と混合すると沈殿が始まった。12時間放置した後、チューブの底部に重い沈殿物が形成された。Tris-HClバッファーで再懸濁すると、タンパク質沈殿物はすぐに消失し、バッファーに溶解し、透明な淡黄色の液体として現れました。
タンパク質溶液をアルギニン-アガロースマトリックスアフィニティーカラムにロードすると、明らかなピーク(ピーク1、フロースルーピーク)が~40分に現れ、~66分で溶出を停止しました。グラジエント溶出段階では、0.15 M NaClで溶出すると、~94分で明らかなピーク(ピーク2、溶出ピーク)が現れ、~110分で溶出が停止しました。残りの溶出段階(0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M、および0.65 M NaCl)には明らかな溶出ピークは現れませんでした(図1A)。本研究では、アルギニン-アガロースマトリックスアフィニティーカラムを最大10回まで再利用し、カラムの性能が大きく変化しないことを発見しました。
タンパク質溶液をリジン-アガロースマトリックスアフィニティーカラムにロードすると、明らかなピーク(ピーク1、フロースルーピーク)が~38分に現れ、~60分で溶出を停止しました。グラジエント溶出段階では、0.15 M NaClで溶出すると、~80分で明らかなピーク(ピーク2、溶出ピーク)が現れ、~86分で溶出が停止しました。残りの溶出段階(0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M、および0.65 M NaCl)には明らかな溶出ピークは現れませんでした(図1B)。アルギニン-アガロースマトリックスアフィニティーカラムとリジン-アガロースマトリックスアフィニティーカラムの溶出プロファイルは類似していた。前述のように、アルギニン-アガロースマトリックスアフィニティーカラムを最大10回再利用しても、このカラムの性能は変わりませんでした。
精製したsFE(10 μL、溶出ピークサンプル、ピーク2)を調製したフィブリンプレートに添加した。さらに、10 μLのウロキナーゼ(100 U)、10 μLの生理食塩水バッファー、および10 μLの粗タンパク質(プロトコルステップ1.3.1で得られたサンプル)を、それぞれポジティブコントロール、ブランクコントロール、およびネガティブコントロールに使用しました。18時間のインキュベーション後、2つのフィブリンプレートが同様の結果を示した:溶解ゾーン(直径1.3cm)がウロキナーゼコントロールに現れた。生理食塩水緩衝液中に溶解ゾーンは観察されなかった。溶解ゾーン(直径2.1 cm)が粗タンパク質ウェルに現れました。精製されたsFEウェルに溶解ゾーン(直径1.8 cm)が現れました(図2)。ウロキナーゼと比較して、精製されたsFEの線溶活性は~19,200 U/mLであることがわかりました。溶出ピークサンプルは、アフィニティーカラムにロードしたサンプルと同じ体積に調整し、アフィニティーカラムの回収率は、フィブリンプレート上の溶解ゾーンのサイズ(直径x直径)で示されます。アフィニティーカラムの回収率は~73.5%であった。
粗タンパク質(プロトコールステップ1.3.1で得られたサンプル)および精製されたsFE(溶出ピークサンプル、ピーク2)を純度分析に使用しました。SDS-PAGEおよび染色後、3つの主要なタンパク質バンド(25、26、および27 kD)および6つのマイナーバンド(20、24、28、35、40、および45 kD)が粗タンパク質に提示されました。1つのメジャーバンド(27 kD)と2つのマイナーバンド(26および28 kD)が精製されたsFEで提示されました(図3)。グレー値分析の結果、精製されたsFEの純度は~92%と高いことがわかりました。
図1:アフィニティー精製のプロファイル 。 (A)粗sFEサンプルをアルギニン-アガロースマトリックスアフィニティー精製により精製した。明らかなフロースルーピークは~40分に現れ、~66分で溶出を停止しました。明らかな溶出ピークは~94分に現れ、~110分で溶出を停止しました。 (B)粗sFEサンプルをリジン-アガロースマトリックスアフィニティー精製により精製しました。明らかなフロースルーピークは~38分に現れ、~60分で溶出を停止しました。明らかな溶出ピークは~80分に現れ、~86分で溶出を停止 しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:線溶活性評価。 試料をフィブリンプレートに添加し、それらの線溶活性を測定し、18時間後にプレート上のそれらの分解ゾーンによって評価した。異なる処理されたサンプルは、赤いアラビア数字で示されます。(A)アルギニン-アガロースマトリックスアフィニティーカラムで精製したsFEの線溶活性。#1、100Uのウロキナーゼ;#2、生理食塩水バッファー;#3、粗タンパク質(プロトコルステップ1.3.1で得られたサンプル);#4、精製されたsFE(溶出ピークサンプル、ピーク2)。(B)リジン-アガロースマトリックスアフィニティーカラムで精製したsFEの線溶活性。#1、100Uのウロキナーゼ;#2、生理食塩水バッファー;#3、粗タンパク質(プロトコルステップ1.3.1で得られたサンプル);#4、精製されたsFE(溶出ピークサンプル、ピーク2)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:純度分析。 精製されたsFEの純度をSDS-PAGEで分析した。(A)アルギニン-アガロースマトリックスアフィニティーカラムで精製したsFEの純度。M:タンパク質マーカー;レーン1:粗タンパク質(プロトコルステップ1.3.1で得られたサンプル);レーン2:精製されたsFE(溶出ピークサンプル、ピーク2)。(B)リジン-アガロースマトリックスアフィニティーカラムで精製したsFEの純度。M:タンパク質マーカー;レーン1:粗タンパク質(プロトコルステップ1.3.1で得られたサンプル);レーン2:精製されたsFE(溶出ピークサンプル、ピーク2)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:8ZHP:snFPITE-n1の結晶構造。 PDB X線構造検証レポート。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:8ZHO:snFPITE-n2の結晶構造。 PDB X線構造検証レポート。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
sFEの正確な遺伝子配列が利用できないため、現在使用されているsFEを新鮮なS.nudus14から抽出しました。さらに、文献で報告されているsFEの精製手順は、分子量、等電点、イオン強度、極性などのsFEの一般的な特徴に基づいているため、複雑で費用がかかりました15,16。sFEのアフィニティー精製プロトコルはこれまでに報告されていません。本研究では、sFEの結晶構造の知見に基づいて、sFEのアフィニティー精製プロトコルの開発に成功しました。報告された精製方法と比較して、このアフィニティー精製方法は、操作が容易で、安価で、ユーザーフレンドリーでした。また、この方法を用いることで活性sFEの回収率がかなり高いことが認められた。
線維素溶解酵素の多くの親和性精製法が報告されているが、それらは抗体17、阻害剤18、リガンド、および受容体16に基づいていた。これらの抗体、阻害剤、リガンド、および受容体の調製は、技術的に困難で手間がかかります。さらに、これらの分子をマトリックスに結合させるためには特別な努力が必要である。対照的に、アルギニン-アガロースマトリックスとリジン-アガロースマトリックスは市販の材料であり、すぐに使用でき、安定性が高く、スケールアップが容易です19。最近、リジン-アガロースマトリックスがプラスミノーゲン20,21のアフィニティー精製に使用されています。しかしながら、プラスミノーゲンはプラスミンのプロ酵素であり、活性型ではない15。リジン-アガロースマトリックスがプラスミンのアフィニティー精製に適しているかどうかは不明です。理論的には、この研究でアルギニン-アガロースマトリックスとリジン-アガロースマトリックスを使用して精製されたsFEは、結晶モデルがsFEの触媒トライアドのみがアルギニンおよびリジン残基と相互作用できることを示したため、活性型にすぎません。したがって、このプロトコルは他のセリンプラスミンの精製に適用でき、他のセリンプラスミン薬の開発を加速する可能性があります。
sFEとアフィニティーカラム間の結合はそれほど強くないため、精製を成功させるには、正確なNaCl濃度と適切な溶出速度を維持することが非常に重要です。もう一つの重要な要素は、精製に深刻な影響を与えるシステムのpHです。これらの3つのパラメータは、私たちによって最適化されています。確かに、この研究における活性sFEの回収率は比較的低く、アガロースマトリックスの表面で利用可能なアルギニン残基またはリジン残基の数が少ないために制限されていた可能性があります。したがって、リジン/アルギニンとアガロースマトリックス間のリンカーは、回収率を高めるために長くする必要があります。一方、sFEと同様の触媒トライアドを持つ他のセリンタンパク質がこのシステムの下で溶出される可能性を排除することはできませんでした。したがって、限外ろ過などの分子量ベースの精製技術を追加して、sFEから他のセリンタンパク質を分離することをお勧めします。同様に、結合能の増強、寿命の延長、手順のさらなる簡素化など、他の多くの問題は、戦略(例えば、アルギニン/リジンをポリアルギニン/リジンで置換し、リンカーを修飾する)によって将来の研究で対処する必要があります。
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Disclosures
著者は、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、厦門市科学技術局(3502Z20227197)と福建省科学技術局(No.2019J01070、No.2021Y0027)から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| Consumable Material | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
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