Summary
Her giver vi den detaljerede protokol for en et-trins transformationsmetode medieret af Agrobacterium tumefaciens til fremstilling af sammensatte planter.
Abstract
Produktion af sammensatte planter med transgene rødder og ikke-transgene stængler og knopper ved hjælp af Agrobacterium rhizogenes-medieret håret rodtransformation er et kraftfuldt værktøj til at studere rodrelateret biologi. Håret rodtransformation er etableret i en bred vifte af dicotyledoner og i flere monocotyledonarter og er næsten uafhængig af genotypen. Den traditionelle metode til hypocotyl injektion med A. rhizogenes til opnåelse af sammensatte planter er ineffektiv, tidskrævende, besværlig, og ofte forårsager død af ømme og små hypocotyl planter. En meget effektiv, et-trins behåret rodtransformation medieret af A. rhizogenes blev tidligere etableret, hvilket eliminerer behovet for transplantation efter produktion af hårede rødder. I denne undersøgelse blev en delvis hypocotyl og primær rod fjernet, hypocotylsnitstedet blev belagt med A. rhizogenes, og derefter blev hypocotyler plantet i steril vermikulit. Efter 12 dages dyrkning udvidede hypocotylsnittet, og nye hårede rødder blev induceret. Denne artikel giver den detaljerede protokol for en et-trins transformationsmetode medieret af A. rhizogenes, med dens effektivitet demonstreret ved at producere sammensatte planter af vilde sojabønner, Solanum americanum og græskar.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes er en gramnegativ jordbakterie fra familien Rhizobiaceae. A. rhizogenes kan inficere næsten alle tokimbladede, nogle få monocotyledoner og individuelle gymnospermer gennem sår, der producerer hårede rødder i inficerede planter. Bakterien bærer Ri (rodinducerende) plasmid, og T-DNA fra Ri-plasmidet bærer opinsyntesegenet og rolgenerne (rodlocusgener). Efter at Ri-plasmidets T-DNA kommer ind i en plantecelle og er integreret i et værtskromosom, inducerer ekspressionen af rol-generne produktion af hårede rødder1. En plante binær ekspressionsvektor, der bærer et målgen, omdannes til A. rhizogenes, og den transformerede A. rhizogenes bruges til at inficere en plante. Transgene rødder kan induceres i inficerede planter, der producerer sammensatte planter, der indeholder transgene rødder og ikke-transgene stængler og knopper. Generelt kan en sammensat plante opnås inden for 14-20 dage. A. rhizogenes-medieret håret rodtransformation er generelt ikke begrænset af genotype i tokimbladede planter2. De hårede rødder produceret af A. rhizogenes-inficerede planter er kendetegnet ved en hurtig vækstrate, stabil arv og nem betjening. Behåret rodtransformation medieret af A. rhizogenes bruges i øjeblikket i vid udstrækning til at studere rodrelateret biologi. Desuden kan transformationen af hårede rødder også bruges til at validere og optimere målredigeringseffektiviteten af CRISPR/Cas9-systemet 3,4,5 og proteinsubcellulær lokalisering. Derfor er hårrodstransformation et vigtigt redskab i forskning i plantegenfunktion, metabolisk teknik og interaktioner mellem rødder og rhizosfæremikroorganismer 6,7,8.
Sammensatte planter indeholdende transgene rødder opnået gennem håret rodtransformation er blevet produceret i vid udstrækning i tokimbladede planter, især i bælgfrugter. Den traditionelle metode til injektion af hypocotyl med A. rhizogenes er blevet brugt til at producere komposit Lotus corniculatus9, sojabønner10, tomat 11, søde kartofler12 og mange andre planter 5,8. Hypocotylinjektionsmetoden er ineffektiv og vil sandsynligvis forårsage død af unge eller små hypocotylplanter. Derfor blev metoden forbedret ved at afskære de embryonale rødder, belægge frøplantesnittet med A. rhizogenes og derefter placere hypocotyl på sterilt dyrkningsmedium til roddyrkning13. Disse trin udføres imidlertid i et sterilt miljø, og betjeningstrinnene er relativt besværlige. Især skal de resulterende sammensatte planter transplanteres, hvilket øger mængden af arbejde. I tidligere arbejde blev et-trins A. rhizogenes-medieret (ARM) håret rodtransformation etableret i agurk, sojabønne, Lotus japonicus, Medicago truncatula, og tomat 2,14,15,16,17. Den primære rod og partielle hypocotyl blev fjernet, snitstedet for den resterende hypocotyl blev belagt med transformeret A. rhizogenes, og frøplanten blev derefter plantet i fugtig steril vermikulit. Efter 12 dages dyrkning blev hårede rødder produceret på snitstedet. Et-trins ARM-metoden er yderst effektiv og kræver mindre tid til at producere hårede rødder. Transplantation efter dannelse af hårede rødder er heller ikke nødvendig. Fordi mikrobiel kontaminering kan undgås uden transplantation, kan et-trins ARM-metoden være særlig nyttig, når man studerer interaktioner mellem planter og mikroorganismer, såsom symbiotisk nitrogenfiksering mellem bælgplanter og Rhizobia og symbioser mellem planter og arbuskulære mycorrhizal svampe. I dette papir er en detaljeret et-trins A. rhizogenes-medieret håret rodtransformationsprotokol forsynet med eksempler på sammensatte planter produceret i vilde sojabønner, Solanum americanum og græskar. Med protokollen kan forskere problemfrit udføre et-trins ARM-transformationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plantevækstbetingelser og A. rhizogenes kultur
- Frø såning
BEMÆRK: Vilde sojabønnefrø blev indsamlet i Yanggu County, Liaocheng, Kina; frø af S. americanum og græskar lokal sort Yinsu blev købt fra et marked.- Saml frø af vilde sojabønner, S. americanum og det lokale udvalg af græskar, så dem i vermiculit på en dybde på 1 cm og vand dem grundigt. Plant 20 frø i 8 cm x 11 cm x 9 cm plastkasser. Dyrk planterne i et vækstkammer ved 24 ± 2 °C med en 16 timers lys/8 timers mørk cyklus ved ca. 70 % relativ luftfugtighed.
BEMÆRK: Frakker af vilde sojabønnefrø skal brydes inden såning. Hvis forskningsspørgsmålet fokuserer på interaktioner mellem planter og mikroorganismer, skal frø, vermikulit, plastkasser og vand steriliseres før brug. - Aktivering og kultur af A. rhizogenes K599
BEMÆRK: A. rhizogenes K599-stammen havde en binær vektor pRed13052 , der bar et rødt fluorescerende reportergen DsRed2.- A. rhizogenes-stammen K599 fjernes fra en -80 °C fryser, og bakterierne aktiveres på fast LB-medium (med 50 mg/l kanamycin og 50 mg/l streptomycin) ved 28 °C i 48 timer.
- Vælg en enkelt klon af stamme K599 og dyrk den i 1 ml flydende antibiotikaholdigt LB-medium i 12 timer.
- 500 μL af bakteriesuspensionen fordeles jævnt på et fast antibiotikaholdigt LB-medium efterfulgt af inkubation ved 28 °C i 24 timer.
- Saml frø af vilde sojabønner, S. americanum og det lokale udvalg af græskar, så dem i vermiculit på en dybde på 1 cm og vand dem grundigt. Plant 20 frø i 8 cm x 11 cm x 9 cm plastkasser. Dyrk planterne i et vækstkammer ved 24 ± 2 °C med en 16 timers lys/8 timers mørk cyklus ved ca. 70 % relativ luftfugtighed.
2. Et-trins A. rhizogenes-medieret håret rodtransformationsmetode
- Hypocotyl snit
- Efter 7 dage (definer såning af frøene som dag 0) har frøplantecotyledoner lige udfoldet sig (figur 1A), brug en steriliseret, skarp skalpel til at skære ca. 0,5-1 cm af hypocotylen (figur 1B). Kassér den primære rod og noget af den delvise hypocotyl.
BEMÆRK: Brug skalpellen forsigtigt.
- Efter 7 dage (definer såning af frøene som dag 0) har frøplantecotyledoner lige udfoldet sig (figur 1A), brug en steriliseret, skarp skalpel til at skære ca. 0,5-1 cm af hypocotylen (figur 1B). Kassér den primære rod og noget af den delvise hypocotyl.
- K599 podning
- Overtræk hypocotylsnittet med K599-bakterier (figur 1C).
- Plant frøplanterne i fugtig vermiculit (figur 1D).
- Inficere 30 planter af hver art via A. rhizogenes-medieret håret rodtransformation. Vand hver plante med 5 ml resuspenderet K599 bakteriel suspension (OD600 = 0,5-0,6) i en kvart styrke (0,25x) Gamborg B-5 basisk medium (figur 1E).
- Dæk gryderne med en meget gennemsigtig plastpose (figur 1F) og læg dem i et vækstkammer.
3. Behåret rodproduktion
- Dyrk planterne i ~ 12 dage efter podning, nye hårede rødder vil blive induceret og genereret på snitstedet. Efter 15 dage når de behårede rodlængder typisk 2-5 cm (figur 2).
- For at afgøre, om de hårede rødder, der produceres, er transgene, skal du undersøge ekspressionen af reportergener, der er afhængige af den transformerede vektor i K599.
- Detekter ekspressionen af reportergenet DsRed2 ved hjælp af et kemiluminescensbilleddannelsessystem med grønt excitationslys ved 540 nm og emission ved 600 nm (figur 2B, figur 2D og figur 2F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Meget effektiv et-trins A. rhizogenes-medieret håret rodtransformation
Behårede rødder blev produceret på hypocotylsnitstedet 12 dage efter podning med konstrueret K599. Transgene hårede rødder blev bestemt ud fra ekspressionen af reportergenet indeholdt i den binære vektor. Transgene rødder transformeret med reportergenet DsRed2 af sammensat vild sojabønne, S. americanum og græskar blev observeret under naturligt (figur 2A, figur 2C og figur 2E) og grønt excitationslys (figur 2B, figur 2D og figur 2F).
Når en sammensat plante indeholdt mindst en transgen rod, blev den udpeget som en transgen sammensat plante. Blandt de 30 inokulerede planter af hver af de tre arter var 28 vilde sojabønner, 18 S. Americanum og 30 græskarplanter transgene kompositter. Således var den hårede rodtransformationseffektivitet 93,3% (sojabønne), 60% (S. americanum) og 100% (græskar). En sammenligning af de tre typer planter viste, at planter med tykke hypocotyls producerede mere transgene hårede rødder end dem med tynde hypocotyls.
Figur 1: Et-trins A. rhizogenes-medieret håret rodtransformation. (A) Syv dage gamle græskarplanter. (B) Apikal del af hypocotyl skåret i K599 bakteriel opløsning. C) K599 bakteriemasse, der dækker hypocotylsnittet. (D) Explant plantet i våd, steril vermiculit. (E) Vanding med 5 ml resuspenderet K599 bakterieopløsning i kvartstyrke (0,25x) Gamborg B-5 basisk medium. (F) Meget gennemsigtig plastposeoverdækning. Vægtstænger = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Sammensatte planter opnået fra et-trins A. rhizogenes-medieret håret rodtransformation. Rødder af sammensatte planter af (A, B) vilde sojabønner, (C, D) Solanum americanum og (E, F) græskar under (A, C, E) naturligt og (B, D, F) grønt excitationslys. Hvide pile angiver transgene hårede rødder; Sorte pile angiver ikke-transgene hårede rødder. Vægtstænger = 1 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den et-trins A. rhizogenes-medierede hårede rodmetode er en enklere og mere effektiv metode til fremstilling af sammensatte planter end hypocotylinjektionsmetoden. Et-trins ARM-metoden forbedrer effektiviteten af hårrodstransformation betydeligt, forkorter tiden til at producere hårede rødder, øger antallet af hårede rødder og reducerer mængden af involveret arbejde. Den forbedrede transformationsprotokol er optimal til undersøgelser af symbioser mellem bælgplanter og rhizobia og mellem planter og arbuskulære mycorrhizal svampe. Dette kan tilskrives det faktum, at transplantation af sammensatte planter efter produktion af hårede rødder ikke er påkrævet, hvilket undgår forurening med ikke-inokulerede stammer, der opstår under transplantation. Desuden var transformationseffektiviteten 100% i en planteart (græskar).
Følgende årsager kan forklare, hvorfor et-trins ARM-metoden var mere effektiv end hypocotylinjektionsmetoden i hårrodstransformation. For det første, selvom den primære rod blev fjernet, blev frøplantetranspiration opretholdt. Således lettede transpirationstræk A. rhizogenes invasion af hypocotylceller i snittet. For det andet var sårområdet forårsaget af hypocotylsnittet større end det, der var forårsaget af hypocotylinjektionsmetoden, og derfor blev flere planteceller inficeret af A. rhizogenes. Sidst, efter fjernelse af den primære rod, blev hypocotylsnittet begravet i mørk og fugtig vermikulit, hvilket er et gunstigt miljø til at producere rødder18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskningsfonden ved Liaocheng University (318012028) og Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2020MC034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
