Summary
Här tillhandahåller vi det detaljerade protokollet för en enstegs transformationsmetod medierad av Agrobacterium tumefaciens för att producera kompositväxter.
Abstract
Att producera sammansatta växter med transgena rötter och icke-transgena stjälkar och knoppar med hjälp av Agrobacterium rhizogenes-medierad hårig rottransformation är ett kraftfullt verktyg för att studera rotrelaterad biologi. Hårig rottransformation är etablerad i ett brett spektrum av dikotyledoner och i flera monokotyledonarter och är nästan oberoende av genotypen. Den traditionella metoden för hypokotylinjektion med A. rhizogenes för att erhålla sammansatta växter är ineffektiv, tidskrävande, mödosam, och orsakar ofta döden av ömma och små hypokotylväxter. En mycket effektiv, enstegs hårig rottransformation medierad av A. rhizogenes etablerades tidigare, vilket eliminerar behovet av transplantation efter att ha producerat håriga rötter. I denna studie avlägsnades en partiell hypokotyl och primärrot, hypokotylsnittstället belades med A. rhizogenes och sedan planterades hypokotyler i steril vermikulit. Efter 12 dagars odling expanderade hypokotylsnittet och nya håriga rötter inducerades. Denna artikel tillhandahåller det detaljerade protokollet för en enstegs transformationsmetod medierad av A. rhizogenes, med dess effektivitet demonstrerad genom att producera sammansatta växter av vilda sojabönor, Solanum americanum och pumpa.
Introduction
Agrobacterium rhizogenes ingår i släktet Agrobacterium och familjen Rhizobiaceae. A. rhizogenes kan infektera nästan alla dikotyledoner, några monokotyledoner och enskilda gymnospermer genom sår, vilket ger håriga rötter i infekterade växter. Bakterien bär Ri (rotinducerande) plasmid, och T-DNA i Ri-plasmiden bär opinsyntesgenen och rolgenerna (rotlokusgener). Efter att T-DNA från Ri-plasmiden kommer in i en växtcell och integreras i en värdkromosom, inducerar uttrycket av rolgenerna produktion av håriga rötter1. En växtbinär uttrycksvektor som bär en målgen omvandlas till A. rhizogenes, och de transformerade A. rhizogenes används för att infektera en växt. Transgena rötter kan induceras i infekterade växter, vilket producerar sammansatta växter som innehåller transgena rötter och icke-transgena stjälkar och knoppar. I allmänhet kan en kompositväxt erhållas inom 14-20 dagar. A. rhizogenes-medierad hårig rottransformation är i allmänhet inte begränsad av genotyp i dikotyledonösa växter2. De håriga rötterna som produceras av A. rhizogenes-infekterade växter kännetecknas av en snabb tillväxthastighet, stabilt arv och enkel användning. Hårig rottransformation medierad av A. rhizogenes används för närvarande i stor utsträckning för att studera rotrelaterad biologi. Dessutom kan omvandlingen av håriga rötter också användas för att validera och optimera målredigeringseffektiviteten för CRISPR / Cas9-systemet 3,4,5 och proteinsubcellulär lokalisering. Därför är hårig rotomvandling ett viktigt verktyg i forskning om växtgenfunktion, metabolisk teknik och interaktioner mellan rötter och rhizosfärmikroorganismer 6,7,8.
Sammansatta växter som innehåller transgena rötter erhållna genom hårig rotomvandling har producerats i stor utsträckning i dikotyledonösa växter, särskilt i baljväxter. Den traditionella metoden att injicera hypokotyl med A. rhizogenes har använts för att producera komposit Lotus corniculatus9, sojabönor 10, tomat11, sötpotatis12 och många andra växter 5,8. Hypokotylinjektionsmetoden är ineffektiv och kommer sannolikt att orsaka död hos unga eller små hypokotylväxter. Därför förbättrades metoden genom att skära av de embryonala rötterna, belägga plantans snitt med A. rhizogenes och sedan placera hypokotylen på sterilt odlingsmedium för rotodling13. Dessa steg utförs dock i en steril miljö, och operationsstegen är relativt besvärliga. I synnerhet måste de resulterande kompositplantorna transplanteras, vilket ökar mängden arbete. I tidigare arbete etablerades enstegs A. rhizogenes-medierad (ARM) hårig rottransformation i gurka, sojabönor, Lotus japonicus, Medicago truncatula och tomat 2,14,15,16,17. Den primära roten och partiell hypokotyl avlägsnades, snittstället för den återstående hypokotylen belades med transformerade A. rhizogenes, och plantan planterades sedan i fuktig steril vermikulit. Efter 12 dagars odling producerades håriga rötter på snittplatsen. ENSTEGS ARM-metoden är mycket effektiv och kräver mindre tid för att producera håriga rötter. Transplantation efter att ha bildat håriga rötter är inte heller nödvändigt. Eftersom mikrobiell kontaminering kan undvikas utan transplantation kan enstegs ARM-metoden vara särskilt användbar när man studerar interaktioner mellan växter och mikroorganismer, såsom symbiotisk kvävefixering mellan baljväxter och Rhizobia, och symbioser mellan växter och arbuskulära mykorrhizasvampar. I detta dokument tillhandahålls ett detaljerat enstegs A. rhizogenes-medierat hårigt rottransformationsprotokoll med exempel på sammansatta växter som produceras i vilda sojabönor, Solanum americanum och pumpa. Med protokollet kan forskare smidigt utföra enstegs ARM-transformation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Växttillväxtförhållanden och A. rhizogenes-kultur
- Frö sådd
NOTERA: Vilda sojabönor samlades in i Yanggu County, Liaocheng, Kina; frön av S. americanum och pumpa lokal sort Yinsu köptes från en marknad.- Samla frön av vild sojabönor, S. americanum och den lokala sorten av pumpa, så dem i vermikulit på ett djup av 1 cm och vattna dem noggrant. Plantera 20 frön i 8 cm x 11 cm x 9 cm plastlådor. Odla plantorna i en tillväxtkammare vid 24 ± 2 °C med en 16 timmars ljus/8 timmars mörk cykel vid cirka 70 % relativ luftfuktighet.
OBS: Skikt av vilda sojabönor frön måste brytas före sådd. Om forskningsfrågan fokuserar på interaktioner mellan växter och mikroorganismer måste frön, vermikulit, plastlådor och vatten steriliseras före användning. - Aktivering och odling av A. rhizogenes K599
OBS: A. rhizogenes K599-stammen hade en binär vektor pRed13052 som bar en röd fluorescerande reportergen DsRed2.- Ta bort A. rhizogenes-stammen K599 från en frys på -80 °C och aktivera bakterierna på fast LB-medium (med 50 mg/l kanamycin och 50 mg/l streptomycin) vid 28 °C i 48 timmar.
- Välj ut en enda klon av stam K599 och odla den i 1 ml flytande antibiotikainnehållande LB-medium i 12 timmar.
- Jämnt fördela 500 μl av bakteriesuspensionen på ett fast antibiotikainnehållande LB-medium, följt av inkubation vid 28 °C i 24 timmar.
- Samla frön av vild sojabönor, S. americanum och den lokala sorten av pumpa, så dem i vermikulit på ett djup av 1 cm och vattna dem noggrant. Plantera 20 frön i 8 cm x 11 cm x 9 cm plastlådor. Odla plantorna i en tillväxtkammare vid 24 ± 2 °C med en 16 timmars ljus/8 timmars mörk cykel vid cirka 70 % relativ luftfuktighet.
2. Ett steg A. rhizogenes-medierad hårig rottransformationsmetod
- Hypokotyl snitt
- Efter 7 dagar (definiera sådd av fröna som dag 0) har planta cotyledoner just utvecklats (Figur 1A), använd en steriliserad, skarp skalpell för att skära ca 0,5-1 cm av hypokotylen (Figur 1B). Kassera den primära roten och en del av den partiella hypokotylen.
OBS: Använd skalpellen varsamt.
- Efter 7 dagar (definiera sådd av fröna som dag 0) har planta cotyledoner just utvecklats (Figur 1A), använd en steriliserad, skarp skalpell för att skära ca 0,5-1 cm av hypokotylen (Figur 1B). Kassera den primära roten och en del av den partiella hypokotylen.
- K599 ympning
- Belägg hypokotylsnittet med K599-bakterier (figur 1C).
- Plantera plantorna i fuktig vermikulit (figur 1D).
- Infektera 30 växter av varje art via A. rhizogenes-medierad hårig rottransformation. Vattna varje växt med 5 ml återsuspenderad K599 bakteriesuspension (OD600 = 0,5-0,6) i en kvartsstyrka (0,25x) Gamborg B-5 basmedium (figur 1E).
- Täck krukorna med en mycket genomskinlig plastpåse (figur 1F) och placera dem i en tillväxtkammare.
3. Hårig rotproduktion
- Odla växterna i ~ 12 dagar efter inokulering, nya håriga rötter kommer att induceras och genereras vid snittplatsen. Efter 15 dagar når de håriga rotlängderna vanligtvis 2-5 cm (figur 2).
- För att avgöra om de håriga rötterna som produceras är transgena, undersök uttrycket av reportergener beroende av den transformerade vektorn i K599.
- Detektera uttrycket av reportergenen DsRed2 med hjälp av ett kemiluminiscensavbildningssystem med grönt excitationsljus vid 540 nm och emission vid 600 nm (figur 2B, figur 2D och figur 2F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Högeffektiv enstegs A. rhizogenes-medierad hårig rottransformation
Håriga rötter producerades vid hypokotylsnittet 12 dagar efter inokulering med konstruerad K599. Transgena håriga rötter bestämdes baserat på uttrycket av reportergenen i den binära vektorn. Transgena rötter transformerade med reportergenen DsRed2 av sammansatt vild sojaböna, S. americanum och pumpa observerades under naturligt (figur 2A, figur 2C och figur 2E) och grönt excitationsljus (figur 2B, figur 2D och figur 2F).
När en sammansatt växt innehöll minst en transgen rot, betecknades den som en transgen sammansatt växt. Bland de 30 inokulerade växterna av var och en av de tre arterna var 28 vilda sojabönor, 18 S. Americanum och 30 pumpaväxter transgena kompositer. Således var den håriga rottransformationseffektiviteten 93,3% (sojabönor), 60% (S. americanum) och 100% (pumpa). En jämförelse av de tre typerna av växter indikerade att växter med tjocka hypokotyler producerade mer transgena håriga rötter än de med tunna hypokotyler.
Figur 1: Enstegs A. rhizogenes-medierad hårig rottransformation. (A) Sju dagar gamla pumpaplantor. (B) Apikal del av hypokotyl skuren i K599 bakterielösning. (C) K599 bakteriemassa som täcker hypokotylsnittet. d) Explanterad i våt, steril vermikulit. (E) Bevattning med 5 ml återsuspenderad K599 bakterielösning i kvartsstyrka (0,25x) Gamborg B-5 basmedium. (F) Mycket genomskinlig plastpåse. Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Sammansatta växter erhållna från enstegs A. rhizogenes-medierad hårig rottransformation. Rötter av sammansatta växter av (A,B) vilda sojabönor, (C,D) Solanum americanum och (E,F) pumpa under (A,C,E) naturligt och (B,D,F) grönt excitationsljus. Vita pilar indikerar transgena håriga rötter; Svarta pilar indikerar icke-transgena håriga rötter. Skalstreck = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enstegs A. rhizogenes-medierad hårrotsmetod är en enklare och effektivare metod för att producera kompositväxter än hypokotylinjektionsmetoden. ENSTEGS ARM-metoden förbättrar effektiviteten av hårig rotomvandling avsevärt, förkortar tiden för att producera håriga rötter, ökar antalet håriga rötter och minskar mängden arbete som är involverat. Det förbättrade transformationsprotokollet är optimalt för studier av symbioser mellan baljväxter och rhizobia och mellan växter och arbuskulära mykorrhizasvampar. Detta kan hänföras till det faktum att transplantation av kompositväxter efter produktion av håriga rötter inte krävs, vilket undviker förorening med icke-inokulerade stammar som uppstår vid transplantation. Dessutom var omvandlingseffektiviteten 100% i en växtart (pumpa).
Följande skäl kan förklara varför enstegs ARM-metoden var effektivare än hypokotylinjektionsmetoden vid hårig rottransformation. Först, även om den primära roten avlägsnades, upprätthölls transpiration av plantor. Således underlättade transpiration dra A. rhizogenes invasion av hypokotylceller i snittet. För det andra var sårområdet som orsakades av hypokotylsnittet större än det som orsakades av hypokotylinjektionsmetoden, och därför infekterades fler växtceller av A. rhizogenes. Sist, efter att ha tagit bort den primära roten, begravdes hypokotylsnittet i mörk och fuktig vermikulit, vilket är en gynnsam miljö för att producera rötter18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskningsfonden vid Liaocheng University (318012028) och Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2020MC034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A506636 | |
| LB medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113 | |
| plastic box | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| pumpkin | local variety Yinsu | ||
| streptomycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
References
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al. A fast, simple, high efficient and one-step generation of composite cucumber plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 141, 207-216 (2020).
- Du, H., et al. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. Journal of Biotechnology. 217, 90-97 (2016).
- Nguyen, D. V., et al. An efficient hairy root system for validation of plant transformation vector and CRISPR/Cas construct activities in cucumber (Cucumis sativus L.). Frontiers in Plant Science. 12, 770062 (2022).
- Liu, S., et al. AtGCS promoter-driven clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 highly efficiently generates homozygous/biallelic mutations in the transformed roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 952428 (2022).
- Irigoyen, S., et al. Plant hairy roots enable high throughput identification of antimicrobials against Candidatus Liberibacter spp. Nature Communications. 11 (1), 5802 (2020).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotechnology Journal. 14 (6), 1381-1393 (2016).
- Gutierrez-Valdes, N., et al. Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications. Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).
- Stougaard, J. Agrobacterium rhizogenes as a vector for transforming higher plants. Application in Lotus corniculatus transformation. Methods in Molecular Biology. 49, 49-61 (1995).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Yu, Y., et al. Overexpression of phosphatidylserine synthase IbPSS1 affords cellular Na+ homeostasis and salt tolerance by activating plasma membrane Na+/H+ antiport activity in sweet potato roots. Horticulture Research. 7, 131 (2020).
- Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 14 (6), 695-700 (2001).
- Fan, Y., et al. One-step generation of composite soybean plants with transgenic roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. BMC Plant Biology. 20 (1), 208 (2020).
- Fan, Y., et al. Anthocyanin, a novel and user-friendly reporter for convenient, non-destructive, low cost, directly visual selection of transgenic hairy roots in the study of rhizobia-legume symbiosis. Plant Methods. 16, 94 (2020).
- Wang, X., et al. Application of AtMYB75 as a reporter gene in the study of symbiosis between tomato and Funneliformis mosseae. Mycorrhiza. 33 (3), 181-185 (2023).
- Wang, X., et al. Development of a set of novel binary expression vectors for plant gene function analysis and genetic transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 1104905 (2023).
- Li, Q. Q., et al. Phytochrome B inhibits darkness-induced hypocotyl adventitious root formation by stabilizing IAA14 and suppressing ARF7 and ARF19. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 105 (6), 1689-1702 (2021).
