Summary
هنا ، نصف بروتوكولا مباشرا يتيح التقييم في المختبر لوفرة الحمض النووي الريبي الميكروي المسمى بالفلورسنت لدراسة ديناميكيات تغليف microRNA وتصديره إلى حويصلات خارج الخلية (EVs).
Abstract
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي وسطاء مهمون للاتصال الخلوي الذي تفرزه مجموعة متنوعة من الخلايا المختلفة. تنقل هذه المركبات الكهربائية الجزيئات النشطة بيولوجيا ، بما في ذلك البروتينات والدهون والأحماض النووية (الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي المرسال ، والحمض النووي الريبي الدقيق ، وغيرها من الحمض النووي الريبي غير المشفر) ، من خلية إلى أخرى ، مما يؤدي إلى عواقب النمط الظاهري في الخلايا المتلقية. من بين جميع شحنات EV المختلفة ، حظيت microRNAs (miRNAs) بقدر كبير من الاهتمام لدورها في تشكيل البيئة المكروية وفي تثقيف الخلايا المتلقية بسبب عدم تنظيمها الواضح ووفرة في المركبات الكهربائية. تشير البيانات الإضافية إلى أن العديد من miRNAs يتم تحميلها بنشاط في المركبات الكهربائية. على الرغم من هذا الدليل الواضح ، فإن البحث عن ديناميكيات التصدير وآليات فرز miRNA محدود. هنا ، نقدم بروتوكولا باستخدام تحليل قياس التدفق الخلوي ل EV-miRNA والذي يمكن استخدامه لفهم ديناميكيات تحميل EV-miRNA وتحديد الآلات المشاركة في تصدير miRNA. في هذا البروتوكول ، يتم اقتران miRNAs المحددة مسبقا ليتم تخصيبها في EVs واستنفادها من الخلايا المانحة إلى فلوروفور ونقلها إلى الخلايا المانحة. ثم يتم التحقق من miRNAs الموسومة بالفلورسنت للتحميل في EVs والنضوب من الخلايا باستخدام qRT-PCR. كعنصر تحكم في النقل وأداة لبوابة السكان المنقولين من الخلايا ، يتم تضمين الحمض النووي الريبي الخلوي المسمى بالفلورسنت (الخلايا المحتفظ بها والمستنفدة EV). يتم تقييم الخلايا المنقولة مع كل من EV-miRNA والخلية المحتفظ بها miRNA لإشارات الفلورسنت على مدار 72 ساعة. تتضاءل شدة إشارة التألق الخاصة ب EV-miRNAs بسرعة مقارنة بالحمض النووي الريبي المرسال المحتفظ به بالخلية. باستخدام هذا البروتوكول المباشر ، يمكن للمرء الآن تقييم ديناميكيات تحميل miRNA وتحديد العوامل المختلفة المسؤولة عن تحميل miRNAs في المركبات الكهربائية.
Introduction
تعد MicroRNAs (miRNAs) واحدة من أفضل المجموعات الفرعية المميزة للحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر ، والمعروفة بدورها الحاسم في تنظيم الجينات بعد النسخ. يتبع التعبير والتكوين الحيوي لمعظم miRNAs سلسلة منسقة من الأحداث التي تبدأ بنسخ miRNAs الأولية (pri-miRNAs) في النواة. بعد المعالجة النووية بواسطة مجمع المعالجات الدقيقة إلى سلائف miRNAs (pre-miRNAs) ، يتم تصدير ما قبل miRNAs إلى السيتوبلازم ، حيث تخضع لمزيد من المعالجة بواسطة RNase III endonuclease ، dicer إلى 21-23 نيوكليوتيدات ناضجة miRNAدوبلكس 1. يرتبط أحد خيوط miRNA الناضجة المعالجة بالحمض النووي الريبي المرسال المستهدف (mRNAs) ، مما يؤدي إلى تدهور أو قمع متعدية للأهداف2. استنادا إلى الدور متعدد الخواص ل miRNAs في تنظيم العديد من mRNAs المستهدفة المتنوعة في وقت واحد ، فليس من المستغرب أن يتم تنظيم تعبير miRNA بإحكام3. في الواقع ، يساهم التعبير غير المناسب في حالات مرضية مختلفة ، خاصة في السرطان. لا يمثل التعبير الشاذ عن miRNAs توقيعا خاصا بالمرض فحسب ، بل ظهر أيضا كهدف للإمكانات النذير والعلاجية4،5،6. بالإضافة إلى أدوارها داخل الخلايا ، فإن miRNAs لها أيضا أدوار غير مستقلة. على سبيل المثال ، يمكن تعبئة miRNAs بشكل انتقائي في EVs بواسطة الخلايا المانحة وتصديرها إلى المواقع المتلقية حيث تثير استجابات مظهرية متنوعة في علم وظائف الأعضاء الطبيعي والمرض7،8،9.
على الرغم من الأدلة الواضحة على أن miRNAs المرتبطة ب EV هي جزيئات حيوية وظيفية ، إلا أنه ليس من المفهوم تماما كيف يتم تنظيم مجموعات فرعية معينة من miRNAs في حالات المرض مثل السرطان وكيف تختار الآلية الخلوية وفرز miRNAs إلى Evs10,11. بالنظر إلى الدور المحتمل ل EV-miRNAs في تعديل البيئة المكروية ، من الأهمية بمكان تحديد الآليات التي ينطوي عليها تصدير miRNAs المختارة لتوضيح دور المركبات الكهربائية بشكل كامل في الاتصال بين الخلايا والتسبب في المرض. إن فهم عملية إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية لن يسلط الضوء على الوسطاء المهمين لتصدير miRNA فحسب ، بل يمكن أن يوفر أيضا رؤى حول العلاجات المحتملة. لتحقيق هذا المستوى من المعرفة ، يجب تكييف الأدوات لمعالجة هذه الأسئلة التجريبية الجديدة بأمانة. في الواقع ، تنمو الدراسات التي تقيم المركبات الكهربائية بشكل كبير بسبب إدخال تقنيات وضوابط جديدة12,13. فيما يتعلق بتقييم وفرة miRNAs المصدرة إلى EVs ، كان تسلسل الجيل التالي وتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) هي الأدوات القياسية الحالية. في حين أن هذه الأدوات مفيدة لتقييم وفرة miRNAs في المركبات الكهربائية ، إلا أن هناك قيودا على حساسيتها وخصوصيتها ، واستخدام هذه الأساليب الثابتة لتقييم الديناميكيات غير كاف. يتطلب تحديد ديناميكيات تصدير miRNA إلى المركبات الكهربائية مجموعة من الأدوات المتخصصة. هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا باستخدام miRNAs المترافقة بالفلورسنت ، لتحليل ديناميكيات إطلاق miRNA من الخلايا المانحة ودمجها في EVs. نناقش أيضا مزايا وقيود الطريقة ونقدم توصيات للاستخدام الأمثل. ستكون الطريقة متعددة الاستخدامات المقدمة في هذه الورقة مفيدة للباحثين المهتمين بدراسة إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية وأدوارها المحتملة في الاتصالات الخلوية والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: كشرط مسبق لاستخدام هذه التقنية ، يلزم تحديد والتحقق من صحة miRNAs المصدرة بشكل انتقائي. نظرا لأن خطوط الخلايا المختلفة تختلف بناء على شحنة miRNA المصنفة في المركبات الكهربائية الخاصة بها ، فمن المستحسن تقييم خط الاهتمام الخلوي والمركبات الكهربائية المرتبطة به ل miRNAs قبل الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك ، يعد النقل القائم على ليبوفيكتامين أحد الخطوات الحاسمة في البروتوكول. يوصى بالتحديد المسبق لكفاءة النقل قبل إعداد التجربة.
1. نمو الخلايا في الثقافة ونقل الخلايا باستخدام EV-miRNA المترافق بالفلوروفور
- صفيحة 200,000 إلى 400,000 خلية في آبار ثلاثية في صفيحة من 6 آبار في وسط استزراع مناسب. قم بتدوير اللوحة برفق لضمان توزيع موحد للخلايا. احتضان الخلايا حتى تصل إلى التقاء 70٪ -80٪ ، حوالي 24-48 ساعة.
- لكل بئر يتم نقله ، قم بتخفيف كاشف النقل في 100 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل في أنبوب طرد مركزي دقيق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: يجب تحديد التركيز الأمثل للدهون لخط اهتمام الخلية قبل هذا الإعداد. - لكل بئر يتم نقله ، قم بتخفيف EV-miRNA المترافق بالفلوروفور (2nM) و cell-miRNA (2nM) بشكل منفصل في أنبوب طرد مركزي دقيق في 100 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل.
ملاحظة: يجب حساب الحجم الإجمالي للعدد الإجمالي للآبار التي تم نقلها. في هذا البروتوكول ، تم تقييم التألق في 7 نقاط زمنية. لذلك ، كان الحجم الإجمالي 700 ميكرولتر للخطوة 1.2 و 700 ميكرولتر للخطوة 1.3. بالإضافة إلى ذلك ، لالتقاط السكان الفلورسنت الإيجابي للخلايا بثقة ، يجب على المستخدم نقل الخلايا باستخدام miRNA المخفوق غير الفلوري وإنشاء بوابة تستبعد هذه الخلايا. - أضف مزيج الحمض النووي الريبي المخفف (من الخطوة 1.3) إلى كاشف النقل المخفف (من الخطوة 1.2) واخلطه برفق عن طريق قلب الأنبوب 3-4 مرات. دع مزيج الحمض النووي الريبي الدهني المركب يحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- قم بإزالة وسائط الاستزراع العادية من الخلايا وأضف 800 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى كل بئر. أضف برفق 200 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي الريبي الدهني (من الخطوة 1.4) بالتنقيط إلى الخلايا.
ملاحظة: تم استخدام وسائط Opti-MEM لنقل خط اهتمام الخلية (خلايا Calu6). حاول إضافة مزيج الحمض النووي الريبي الدهني مباشرة إلى وسائط الاستزراع ، وتجنب إضافة الخليط إلى جوانب اللوحة.
2. حصاد الخلايا المنقولة في نقاط زمنية مختلفة لتحليل التألق
- احتضان الخلايا المنقولة عند 37 درجة مئوية لمدة 7 ساعات.
ملاحظة: للتحقق من صحة النقل المتسق لكل من miRNAs (EV-miRNA و cell-miRNA) ، يتم جمع الخلايا من بئر واحد بعد 3 ساعات من النقل لتحليل التألق باستخدام مقياس التدفق الخلوي. - بعد فترة الحضانة 7 ساعات ، قم بإزالة مجمع النقل من الآبار واستبدله بوسائط كاملة.
- لتقييم النقطة الزمنية 7 ساعات ، احصد الخلايا واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1x PBS.
- إذا كنت تعمل مع خلايا ملتصقة ، أضف 200 ميكرولتر من التربسين إلى بئر واحد وانتظر حتى تنفصل الخلايا عن اللوحة. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق والحبيبات عن طريق الطرد المركزي في 200xg لمدة 5 دقائق.
- تخلص من المادة الطافية بعناية لتجنب تعطيل حبيبات الخلية. لغسل PBS الأول, أعد تعليق الحبيبات في ~ 500 ميكرولتر من 1x PBS وكرر التكوير باستخدام خطوات الطرد المركزي أعلاه. كرر غسل PBS مرتين إضافيتين.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهايد (PFA) بنسبة 2٪ وتقييم التألق.
ملاحظة: بعد إضافة 2٪ PFA, يمكن تخزين بيليه الخلية في 4 °C لمدة 3-4 أيام.
- احصد النقاط الزمنية المتبقية باتباع الخطوات الواردة في القسم 2.3. اجمع كل كريات الخلايا المخزنة وتابع الخطوات الواردة في القسم 3.
3. تحليل التدفق الخلوي لإشارة الخلية miRNA و EV-miRNA في الخلايا
- تحضير الخلايا لتحليل التدفق الخلوي. قم بتصفية تعليق الخلية من أغطية المصفاة من القسم 2 إلى 35 ميكرومتر التي تشكل جزءا من أنابيب البوليسترين FACS ذات القاع المستدير لتمكين إزالة الحطام وركام الخلايا التي قد تتداخل مع تحليل الفلوروفور.
- قم بإعداد الجهاز باتباع تعليمات المعايرة. قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي واتركه يسخن لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. قم بتجهيز نظام الموائع بسائل غمد ، وتحقق من محاذاة الليزر واضبطها.
- قم بتشغيل مراقبة الجودة لتأكيد سوائل الأجهزة. قم بتحميل المياه المفلترة عالية النقاء في مقياس التدفق الخلوي وقم بتشغيلها بمعدل تدفق مناسب لوقت اكتساب كاف.
ملاحظة: يعتمد معدل التدفق المناسب ووقت الاستحواذ على نوع الخلية محل الاهتمام وتعقيد العينة وجودة البيانات المطلوبة. - افتح برنامج تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي وتأكد من أداء الكاشف والليزر. قم بإعداد معلمات العتبة والجهد للكشف بناء على خط اهتمام الخلية والفلوروفورات المختارة.
ملاحظة: بالنسبة لجميع التجارب النهائية، تم استخدام خلايا Calu6.- قم بتعيين عتبة التقاط الإشارة لخلايا Calu6 عند FSC 5000. قم بإجراء التحليل ل 1 × 104 خلايا لكل تكرار تجريبي.
- لحساب التداخل الطيفي بين الفلوروفورات المختلفة ، استخدم الخلايا غير المنقولة والخلايا المنقولة بشكل مستقل مع واحد فقط من الفلوروفورات لإعداد ضوابط التعويض.
- للكشف عن تصدير miRNA ، استخدم EV-miRNAs المرشحة (miR-451a و miR-150) مترافقة مع Alexa-fluor 488 ، وخلية تحكم miRNA (cel-miR-67) مترافقة مع Cy3.
- لكل EV-miRNA ، اقترن الفلوروفور بنهاية 5 من حبلا 5p. قبل النقل ، قم بتلدين حبلا الفلوروفور المترافق إلى حبلا 3p التكميلي بنسبة 100٪.
- لتحليل التعبير في الخلايا المنقولة ، قم بتحليل العينات باستخدام قنوات FSC و SSC و FITC و PE المضبوطة على 258 و 192 و 269 و 423 وحدة جهد ، على التوالي (الشكل 1A ، B).
- أدخل عينة التحكم السلبية في مقياس التدفق الخلوي. التقط إشارات الخلية بعد تحديد شدة التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC) في ورقة عمل مخصصة.
- في المخطط ، اختر FSC للمحور X ، و SSC للمحور Y ، وبوابة للسكان محل الاهتمام عن طريق رسم مضلع حوله (انظر الشكل 1B ، اللوحة السفلية).
- إنشاء مؤامرة جديدة باستخدام السكان المسورة.
- اضبط المحور X على إشارة التألق 1 (FS1) للكشف عن الخلية miRNA والمحور Y على إشارة التألق 2 (FS2) لاكتشاف EV-miRNA. قم بإعداد معلمات التعويض للفلوروفورات الفردية باستخدام الخلايا التي تم نقلها بشكل مستقل مع كل من miRNAs الموسومة بالفلورسنت. في المؤامرة الجديدة ، بوابة على السكان من الاهتمام.
- للكشف عن EV-miRNA ، استخدم قناة FITC. لتقييم إشارة الخلية miRNA ، استخدم قناة PE. في البرنامج ، قم بإنشاء بوابة حول الخلايا التي كانت موجبة لكل من FITC و PE عن طريق رسم مضلع حول مجموعة التألق المزدوج عندما تم اختيار FITC للمحور X وتم اختيار PE للمحور Y.
- سجل إحصائيات السكان المسورين.
- سجل النسبة المئوية للخلايا في السكان المسورة الموجبة لكل من FITC و PE ، وكذلك لتلك الموجبة إما ل FITC أو PE.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه لأي عينات أو عناصر تحكم إضافية في التجربة.
4. عزل EVs من الخلايا المنقولة
- بالنسبة للخلايا المزروعة في وسائط تحتوي على المصل ، استنفد EVs من المصل لمنع التلوث المتبادل.
- لتوليد مصل مستنفد EV ، قم بتخفيف المصل إلى 50٪ في وسائط زراعة الخلايا لتقليل اللزوجة وأجهزة الطرد المركزي للمصل الناتج بنسبة 50٪ عند 110000 × جم لمدة 18 ساعة.
- اجمع المادة الطافية (المصل الخالي من EV) بعناية وقم بترشيحها باستخدام مجموعة مرشح 0.2 ميكرومتر. استخدمي المصل الناتج الخالي من EV بنسبة 50٪ لتوليد وسائط كاملة ، في هذه الحالة ، RPMI بالإضافة إلى مصل 10٪.
- لجمع EVs ، أضف الوسائط الكاملة المستنفدة ل EV إلى الخلايا واجمع EVs بعد 48 ساعة من الحضانة.
ملاحظة: عدل البروتوكول المبين أدناه من Kowal et al.14.
- تنمو الخلايا في أطباق زراعة الأنسجة 15 سم إلى التقاء 80٪. قم بنقل الخلايا بشكل منفصل باستخدام cell-miRNA و EV-miRNA في 10 مل من Opti-MEM باتباع بروتوكول النقل في القسم 1 من البروتوكول.
ملاحظة: لا يتم توسيع نطاق جميع بروتوكولات النقل خطيا. قد يكون من الضروري أولا تكييف وتقييم ظروف النقل في ألواح 15 سم. - بعد 7 ساعات ، قم بشفط وسائط النقل واستبدلها بالوسائط المستنفدة للمركبات الكهربائية (15 مل). تنمو الخلايا في الوسائط المستنفدة EV لمدة 48 ساعة.
- قم بإزالة الوسائط المكيفة من الخلايا ووزعها في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل داخل خزانة السلامة البيولوجية. أجهزة الطرد المركزي للوسائط المكيفة عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا الميتة وحطام الخلايا. نقل طاف الناتجة إلى أنبوب جديد.
- جهاز طرد مركزي طاف عند 10000 × جم لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وتصفيتها باستخدام مجموعة مرشح 0.2 ميكرومتر.
- انقل وسائط زراعة الخلايا المفلترة إلى أنبوب طرد مركزي فائق معقم داخل خزانة السلامة البيولوجية. وزن وموازنة الأنابيب ضد بعضها البعض. قم بتدوير العينات عند 110000 × جم لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية.
- أعد تعليق الحبيبات في حجم مناسب من 1x PBS للغسيل والطرد المركزي عند 110,000 × g لمدة 90 دقيقة 4 درجة مئوية.
ملاحظة: تم إعادة تعليق حبيبات EV في 60 مل من 1x PBS بناء على الحد الأقصى للحجم المسموح به للأنابيب الدوارة ذات الزاوية الثابتة المستخدمة في هذه الدراسة. - نضح PBS وتعليق حبيبات EV في حجم مناسب (50-100 ميكرولتر) من 1x PBS جديد ودوامة. قم بتخزين المركبات الكهربائية في درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
5. تحليل التدفق الخلوي لإشارة الخلية miRNA و EV-miRNA في المركبات الكهربائية
- لإعداد تعليق EV لتحليل قياس التدفق الخلوي ، قم بتخفيف EVs في حجم مناسب من 1x PBS فائق الترشيح.
ملاحظة: يجب تحديد حجم التحميل لتحليل قياس التدفق الخلوي للمركبات الكهربائية بناء على عدد المركبات الكهربائية في العينات. تقريبا ، إذا كان هناك ~ 30000 جسيم في تعليق EV ، فيجب أن يكون الحجم النهائي ~ 500-600 ميكرولتر في 1x PBS. تحتوي العينة النظيفة على حوالي 35-50 جسيما / ميكرولتر. - استخدم مقياس التدفق الخلوي النانوي أو جهاز بديل قوي بما يكفي لتحليل الجسيمات بحجم النانو.
ملاحظة: هنا ، تم استخدام مقياس التدفق الخلوي النانوي Attune NxT. - افتح البرنامج وقم بإعداد الجهاز باتباع تعليمات المعايرة الموصى بها. قم بإجراء اختبار الأداء باستخدام خرز نانو الأداء. إذا تم الكشف عن حبات النانو في نطاق الحجم القياسي ، يكون الأداء هو الأمثل. تحديد معدل التدفق المناسب للكشف عن جزيئات EV.
- قم بتشغيل مراقبة الجودة باستخدام المياه المفلترة عالية النقاء لتأكيد سوائل الجهاز وأداء الكاشف والليزر.
- باستخدام حبات المعايرة المناسبة للتجربة ، اضبط مقياس التدفق الخلوي لاكتشاف الخرزات ذات الأحجام المختلفة بدقة وقياس إشارات التألق.
ملاحظة: لإعداد تحليل EV عن طريق قياس التدفق الخلوي ، تم استخدام حبات ApogeeMix. تحتوي هذه الخرزات على خليط من حبات السيليكا غير الفلورية وحبات البوليسترين الفلورية التي تتراوح أحجامها من 80 نانومتر إلى 1300 نانومتر.- قم بإعداد المعلمات لتقييم حساسية ودقة المجموعات السكانية المختلفة في مزيج الخرزة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدم البوابة المناسبة لحل عدد الخرزات من ضوضاء الجهاز.
- دوامة العينات بدقة لتوزيع المركبات الكهربائية بالتساوي قبل التحميل للتحليل.
- افتح برنامج تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي وقدم برنامج تلفزيوني فائق التصفية. قم بإعداد البوابة لجزيئات EV باستخدام PBS فائق التصفية مع التأكد من أن البوابة تتوافق مع الحجم المناسب للجسيمات بناء على الخرزات في الخطوة 5.5.
- قم بتحميل عينة التحكم السلبية لتحليل المركبات الكهربائية أثناء مرورها عبر مقياس التدفق الخلوي. التقط إشارات EV أثناء رسم FSC على المحور X و SSC على المحور Y.
ملاحظة: تم تعيين عتبة SSC لالتقاط المركبات الكهربائية عند 300. تم تحديد حجم الاستحواذ عند 95 ميكرولتر من إجمالي حجم مسحوب قدره 145 ميكرولتر. تم ضبط معدل التدفق على 12.5 ميكرولتر / دقيقة. تم إجراء التحليل باستخدام 1 × 106 جسيمات EV. سكان المركبات الكهربائية غير متجانسة وستؤدي إلى عزل بعض الحطام جنبا إلى جنب مع المركبات الكهربائية. يسلط الكشف الشامل عن الجسيمات في مخطط FSC مقابل SSC الضوء على الجسيمات في نطاق متنوع ، وهو أمر متوقع عند استخدام مستحضرات EV الخام. - إنشاء مؤامرة جديدة باستخدام السكان المسورة.
- هذه المرة ، اختر إشارة مضان 1 (FS1) للكشف عن الخلية miRNA على المحور X وإشارة مضان 2 (FS2) للكشف عن EV-miRNA على المحور Y.
- قم بإعداد معلمات التعويض للفلوروفورات باستخدام عينات EV المعزولة من الخلايا المنقولة باستخدام miRNA واحد. في المؤامرة الجديدة ، بوابة على السكان EV من الاهتمام.
- لتحليل التعبير عن miRNAs المترافق بالفلوروفور في المركبات الكهربائية المعزولة من الخلايا المنقولة ، قم بتحليل عينات EV باستخدام قنوات FSC و SSC و BL1 و YL1 المضبوطة على 370 و 370 و 400 و 400 وحدة جهد ، على التوالي (الشكل 2A ، B).
- سجل إحصائيات السكان المسورة وتصورها باستخدام الرسوم البيانية ومخططات النقاط.
- كرر الخطوات المذكورة أعلاه لأي عينات أو عناصر تحكم إضافية في التجربة.
6. التحقق من صحة إطلاق miRNAs في المركبات الكهربائية من خلال qRT-PCR
- استخرج الحمض النووي الريبي من المركبات الكهربائية والخلايا الأم باستخدام مجموعة عزل miRVana RNA باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: القياس الكمي للحمض النووي الريبي المعزول من المركبات الكهربائية غير ممكن لأن الكمية الإجمالية للحمض النووي الريبي المعزول من المركبات الكهربائية لا تتجاوز عادة الحد الأدنى لكمية قطرة نانو القياسية. ويرجع ذلك إلى استنفاد الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي من عينات EV ، والتي يمكن التحقق من صحتها باستخدام المحلل الحيوي Agilent. وبالتالي ، فإن درجة السلامة للقياس الكمي EV-RNA عادة ما تكون غير موثوقة وليست التمثيل الحقيقي لكمية EV-RNA. لذلك ، من أجل القياس الكمي qRT-PCR ل EV-RNA و RNA الخلوي ، تم استخدام أحجام متساوية من عزلات الحمض النووي الريبي بعد العزل من عدد متساو من الخلايا. لتطبيع qRT-PCR ، تم استخدام miRNAs الموجودة في كل مكان عبر عينات متعددة كما هو محدد من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي المكتسبة سابقا. - قم بتحويل الحمض النووي الريبي المستخرج إلى cDNA باستخدام مجموعة النسخ العكسي الخاصة بالحمض النووي الريبي الصغير.
- قم بإعداد تفاعل qRT-PCR باستخدام قالب cDNA وبادئات خاصة ب miRNA باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
ملاحظة: لتجارب التحقق من الصحة ، تم استخدام مجموعة miRCURY LNA qRT PCR والبادئات المقابلة من الشركة المصنعة لتقييم تعبير الخلية miRNA و EV-miRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا ، نستخدم قياس التدفق الخلوي كأداة قوية للتحقيق في إطلاق miRNA من الخلايا إلى EVs. باستخدام هذا البروتوكول ، كشف تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا المنقولة باستخدام cell-miRNA و EV-miRNA عن انخفاض متسلسل في إشارة التألق المقابلة ل EV-miRNA ، بينما تم الاحتفاظ بالإشارة المقابلة ل cell-miRNA في الخلايا. للتأكد من أن اقتران الفلوروفور لا يتداخل مع إطلاق miRNA في EVs ، تم اقتران miR-451a إلى فلوروفورين منفصلين (أي Alexa fluor 488 و Alexa fluor 750) ، وتم تقييم احتباس الخلايا. تشير النتائج إلى الحد الأدنى من التباين بين اكتشاف إشارات الفلوروفور المنفصلة بعد النقل ، مما يؤكد موثوقية هذا النهج (الشكل 3 أ ، ب).
نظرا لأن الأسباب المختلفة يمكن أن تفسر فقدان miR-451a الموسوم بالفلورسنت من الخلايا ، بما في ذلك تدهور الحمض النووي الريبي ، كان من الأهمية بمكان التحقق من أن فقدان الخلايا تزامن مع وفرة EV. باستخدام قياس التدفق الخلوي ، لوحظ تراكم miR-451a المترافق مع Alexa fluor-488 في EVs بطريقة تعتمد على الوقت ، مما يوفر دليلا على التعبئة الفعالة والإطلاق النهائي ل miRNA في المركبات الكهربائية. في المقابل ، احتفظت إشارة التألق المقابلة للخلية miRNA ، لم يتم اكتشاف cel-miR-67 في EVs (الشكل 4). تم التحقق من صحة هذه النتائج باستخدام هذا النهج الجديد باستخدام qRT-PCR ، والتي كشفت عن نسبة تعبير EV / خلية أعلى بكثير ل miR-150 ، وهو EV-miRNA إضافي ، عند مقارنته ب cell-miRNA ، cel-miR-67 (الشكل 5).
الشكل 1: إعداد معلمات مقياس التدفق الخلوي للكشف عن الإشارات في الخلايا. (أ) لتحليل مضان الخلية ، باستخدام البرنامج ، تم إعداد الفولتية المميزة للمعلمات المشار إليها. تم إعداد الأداة لتسجيل 10000 خلية لكل عينة. تؤكد طريقة عرض المفتش المعلمات التي تم إعدادها للكشف والتحليل. (ب) لتحليل مضان الخلية ، تم تعيين عتبة معلمة FSC عند 5000 تحت علامة تبويب إعدادات مقياس الخلايا في البرنامج. تعرض اللوحة العلوية اليمنى إعدادات الليزر لالتقاط البيانات. تعرض اللوحات السفلية ورقة عمل عمومية نشطة أثناء تقدم الكشف عن الخلايا. تم تشغيل العينات بتدفق متوسط وتم التقاطها أثناء إنشاء FSC-A و SSC-A كمعلمات للمحور x والمحور y ، على التوالي. تم تعيين البوابة باستخدام أداة مضلع الرسم حول السكان المعنيين. قد تختلف البوابة بالنسبة لخط اهتمام خلية آخر اعتمادا على تنوع عدد الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إعداد معلمات قياس التدفق الخلوي للكشف عن الإشارات في المركبات الكهربائية. (أ) للكشف عن المركبات الكهربائية وتحليلها في المراحل النهائية ، تم تحديد حجم الاستحواذ عند 95 ميكرولتر مع ضبط سرعة التدفق على 12.5 ميكرولتر / دقيقة. كانت العتبة المختارة للكشف عن EV 0.3 × 1000 ضمن علامة تبويب إعدادات الجهاز في البرنامج بناء على حبات المعايرة المستخدمة. كانت الفولتية ل FSC و SSC و BL1 و YL1 370 و 370 و 400 و 400 على التوالي. (ب) إعداد بوابات لالتقاط مجموعات المركبات الكهربائية غير المتجانسة وتمييز المركبات الكهربائية عن ضوضاء خلفية الجهاز. تم استخدام عينة PBS فارغة (أعلى) كعنصر تحكم سلبي لحل ضوضاء الخلفية من سكان EV. تظهر عينة EV (أسفل) أن السكان محل الاهتمام يمثلون 1.8٪ فقط من إجمالي السكان لأن العينة غير متجانسة مع جزيئات متداخلة في نطاق الحجم. ومع ذلك ، تم اختيار بوابات صارمة لضمان الكشف عن سكان EV موضع الاهتمام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: اكتشاف الإشارات في الخلايا من خلال قياس التدفق الخلوي. (أ) تم الكشف عن مضان مناظر ل EV-miRNA و miRNA الخلوي في الخلايا في الأوقات المشار إليها بين 7 ساعات و 72 ساعة بعد النقل. تضاءلت الإشارة المقابلة ل EV-miR-451a (Alexa fluor-488) بمرور الوقت مقارنة بالإشارة من الخلية المحتفظ بها miRNA ، cel-miR-67. (ب) أظهر التألق المقابل ل EV-miR-451a المسمى ب Alexa fluor-750 نفس الاتجاه مثل Alexa Fluro-488 المسمى miR-451a ، مما يشير إلى أن الفلوروفور لا يؤثر على احتفاظ الخلايا ب miRNAs. بشكل عام ، تشير النتائج التمثيلية إلى أن miRNA المنقول يتصرف بشكل مشابه ل miRNA الداخلي المنشأ بناء على تصدير miRNA إلى EVs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: اكتشاف الإشارات في المركبات الكهربائية من خلال قياس التدفق الخلوي. تم الكشف عن مضان يتوافق مع EV-miR-451a و cell-cel-miR-67 في EVs 24 ساعة و 48 ساعة بعد النقل. تم التقاط الإشارة المقابلة ل EV-miR-451a (Alexa fluor-488) في EVs بعد 48 ساعة من النقل. في المقابل ، لم يتم اكتشاف إشارة cel-miR-67 في المركبات الكهربائية. تم استخدام عينة PBS فارغة لإعداد البوابة لهذه التجربة ، كما هو موضح في الشكل 2B. تم استخدام عينات EV المعزولة من الخلايا المنقولة بالحمض النووي الريبي المخفوق غير الفلوري كعنصر تحكم سلبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: القياس الكمي ل EV-miRNA و miRNA الخلوي في الخلايا والمركبات الكهربائية باستخدام qRT-PCR. تم نقل خلايا Calu6 ب 2 نانومتر من miR-150 و cel-miR-67 لكل منهما. تم جمع المركبات الكهربائية بعد 48 ساعة من النقل. تم حساب إثراء EV على أنه نسبة تعبير EV مقسومة على التعبير الخلوي في خلايا Calu6 المنقولة ل miR-150 و cel-miR-67. استنادا إلى نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي التي تقارن تعبير miRNAs في خلايا Calu6 والمركبات الكهربائية المقابلة لها ، تم استخدام miR-30c كعنصر تحكم داخلي وطبيعي لحساب تغيير الطيات. البيانات المقدمة مأخوذة من نسخة بيولوجية واحدة ، حيث تقدم كل نقطة بيانات تفاعلات qRT-PCR ثلاثية النسخ. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SD ، وتم حساب قيم p باستخدام اختبار t غير مزاوج مع تصحيح ويلش (** p < 0.01). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| نقاط القوه | الضعف |
| يسمح بالتقييم المتزامن للتصدير الانتقائي للعديد من miRNAs في الخلايا والمركبات الكهربائية ذات الصلة | تتطلب إجراءات إضافية للتمييز بين ظاهرة التصدير النشطة والسلبية |
| من الممكن تقييم التجمعات الخام غير المتجانسة ولا يتطلب فصلا مسبقا لمجموعات المركبات الكهربائية. يمكن استخدامها لتحليل أنواع مختلفة من المركبات الكهربائية ملاحظة: ستختلف عتبة الكشف عن أنواع مختلفة من الجسيمات |
لا تسمح الحساسية المنخفضة باكتشاف تركيزات محدودة من miRNAs في الخلايا أو المركبات الكهربائية. يمكن التغلب على ذلك من خلال دمج تحليل qRT-PCR النهائي بعد عزل الحمض النووي الريبي من المركبات الكهربائية |
| يتطلب فترة زمنية قصيرة للإعداد والتحليل مقارنة بالطرق القياسية المستخدمة في القياس الكمي miRNA | عدم وجود بروتوكولات توحيد لأنواع مختلفة من المعدات وخطوط الخلايا والفلوروفورات المختلفة. |
الجدول 1: نقاط القوة والضعف الرئيسية في البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتيح البروتوكول الذي تم إنشاؤه حديثا التقاط حركية إطلاق miRNA في المركبات الكهربائية بعد نقل EV-miRNAs. يسمح هذا النهج بالتحليل المتزامن للعديد من EV-miRNAs و cell-miRNAs ، وفقا لقدرات مقياس الخلايا. علاوة على ذلك ، في حين أن تحليل قياس التدفق الخلوي يمكن أن يوفر رؤى قيمة في بيولوجيا EV miRNA ، إلا أنه لا يخلو من القيود. وإن كان يمكن التغلب على بعض القيود عند استخدامها جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى لفهم أكثر شمولا.
أحد مجالات الاهتمام الناشئة في بيولوجيا المركبات الكهربائية هو فهم التصدير الانتقائي ل miRNAs إلى المركبات الكهربائية15,16. في حين أن هذا البروتوكول يوفر أداة قوية للسماح بدراسة التصدير الانتقائي للحمض النووي الريبوزي المرسال ، فإن أحد التحديات الحاسمة هو التمييز بين التصدير النشط والسلبي. يجب توخي الحذر لأن الإفراط في التعبير عن miRNA بتركيز عال بما فيه الكفاية يمكن أن يغير تصدير miRNA ، مما قد يؤدي إلى تحميل سلبي غير مناسب. لذلك ، فإن التجريب لتحديد تركيزات النقل المثلى ل miRNAs أمر بالغ الأهمية أثناء دراسة التصدير الانتقائي.
علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول ، عند دمجه مع التقنيات التكميلية مثل تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، يمكن الباحث من تقييم عدد جسيمات EV مع تقييم إطلاق miRNA ولديه القدرة على تمكين التمييز بين التغييرات في مسارات التكوين الحيوي للمركبات الكهربائية وآليات تصدير miRNA. هذا مهم بشكل خاص بسبب تداخل الوسطاء لهذه العمليات17. بالنظر إلى أن miRNAs يمكن أن تؤثر على أنماط ظاهرية مختلفة ، بما في ذلك بعض المشاركين في التكوين الحيوي EV ، سيكون من الحكمة تقييم عدد الجسيمات بعد نقل miRNAs18. للتغلب على هذه العقبة ، هناك خيار آخر يتمثل في دمج EV-miRNA الذي يظل دون تغيير في ظل الظروف التجريبية ، وبالتالي استبعاد العوامل التي ينطوي عليها التكوين الحيوي للمركبات الكهربائية مع تسليط الضوء على المسارات التي ينطوي عليها تصدير EV-miRNA.
قامت العديد من الدراسات بقياس miRNAs باستخدام qRT-PCR ، وهي طريقة قياسية لقياس miRNA الداخلي10،11،16. ومع ذلك ، فإنه يفتقر إلى القدرة على التقاط إطلاق miRNAs ديناميكيا في المركبات الكهربائية. عند مقارنة قياس التدفق الخلوي ب qRT-PCR ، فإنها تختلف اختلافا كبيرا بناء على حساسية الفحص والتصميم. في حين أن qRT-PCR هي تقنية حساسة للغاية وقادرة نظريا على تحديد الحد الأدنى من عدد نسخ miRNA ، فإن التمييز بين عينتين يتطلب فرقا لا يقل عن 2 أضعاف (100٪) في عدد نسخ miRNAs ذات الأهمية. من ناحية أخرى ، يلتقط قياس التدفق الخلوي الاختلافات القائمة على الإشارات بناء على وفرة miRNA المسمى بالفلورسنت ويمكنه التمييز بين التغيرات الصغيرة في النسبة المئوية في الإشارات. ومع ذلك ، فإن حساسيته المنخفضة تقيد اكتشاف miRNAs بأرقام نسخ محدودة. تكمل التقنيتان بعضهما البعض بشكل تآزري عند استخدامهما بالتزامن ، كما هو موضح في البروتوكول.
باختصار ، يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة للتحقيق في ديناميكيات تصدير miRNA الانتقائية. على الرغم من التحديات المذكورة أعلاه ، تكمن قوة هذا البروتوكول في قدرته على تحليل العديد من miRNAs في وقت واحد ، مما يساهم في فهم أفضل لبيولوجيا miRNA وتصديرها ودورها في بيولوجيا المركبات الكهربائية. وترد في الجدول 1 نقاط القوة والضعف الرئيسية في البروتوكول التي يتعين النظر فيها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نحن نقدر الدعم والمشورة من الدكتورة جيل هاتشكروفت ، مديرة المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي في جامعة بوردو. تم دعم هذا العمل من قبل R01CA226259 و R01CA205420 إلى A.L.K. ، وجائزة الابتكار من جمعية الرئة الأمريكية (ANALA2023) IA-1059916 إلى ALK ، ومنحة Purdue Shared Resources Facility P30CA023168 ، ومنحة فولبرايت للدكتوراه الرائدة التي منحتها وزارة الخارجية بالولايات المتحدة الأمريكية إلى H.H.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
