Summary
Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, das eine In-vitro-Bewertung der Häufigkeit von fluoreszenzmarkierten microRNAs ermöglicht, um die Dynamik der microRNA-Verpackung und des Exports in extrazelluläre Vesikel (EVs) zu untersuchen.
Abstract
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind wichtige Vermittler der zellulären Kommunikation, die von einer Vielzahl unterschiedlicher Zellen abgesondert werden. Diese EVs transportieren bioaktive Moleküle, einschließlich Proteine, Lipide und Nukleinsäuren (DNA, mRNAs, microRNAs und andere nicht-kodierende RNAs), von einer Zelle zur anderen, was zu phänotypischen Folgen in den Empfängerzellen führt. Von all den verschiedenen EV-Ladungen haben microRNAs (miRNAs) aufgrund ihrer eindeutigen Dysregulation und Häufigkeit in EVs viel Aufmerksamkeit für ihre Rolle bei der Gestaltung der Mikroumgebung und bei der Bildung von Empfängerzellen auf sich gezogen. Weitere Daten deuten darauf hin, dass viele miRNAs aktiv in EVs geladen werden. Trotz dieser eindeutigen Beweise ist die Forschung über die Dynamik des Exports und die Mechanismen der miRNA-Sortierung begrenzt. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das die durchflusszytometrische Analyse von EV-miRNA verwendet, um die Dynamik der EV-miRNA-Beladung zu verstehen und die am miRNA-Export beteiligten Maschinen zu identifizieren. In diesem Protokoll werden miRNAs, die in EVs angereichert und aus Spenderzellen abgereichert sind, an ein Fluorophor konjugiert und in die Spenderzellen transfiziert. Die fluoreszenzmarkierten miRNAs werden dann mittels qRT-PCR auf das Laden in EVs und die Depletion aus den Zellen überprüft. Sowohl als Transfektionskontrolle als auch als Werkzeug zum Gating der transfizierten Zellpopulation ist eine fluoreszenzmarkierte zelluläre RNA (zellretiniert und EV-depleted) enthalten. Zellen, die sowohl mit der EV-miRNA als auch mit der zellretinierten miRNA transfiziert wurden, werden über einen Zeitraum von 72 h auf Fluoreszenzsignale untersucht. Die für die EV-miRNAs spezifische Fluoreszenzsignalintensität nimmt im Vergleich zur zellretinierten miRNA rapide ab. Mit diesem einfachen Protokoll konnte man nun die Dynamik der miRNA-Beladung beurteilen und verschiedene Faktoren identifizieren, die für das Laden von miRNAs in Elektrofahrzeuge verantwortlich sind.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) sind eine der am besten charakterisierten Untergruppen kleiner nicht-kodierender RNAs, die für ihre entscheidende Rolle bei der posttranskriptionellen Genregulation bekannt sind. Die Expression und Biogenese der meisten miRNAs folgt einer koordinierten Abfolge von Ereignissen, die mit der Transkription der primären miRNAs (pri-miRNAs) im Zellkern beginnt. Nach der Kernprozessierung durch den Mikroprozessorkomplex zu Vorläufer-miRNAs (Prä-miRNAs) werden die Prä-miRNAs in das Zytoplasma exportiert, wo sie von der RNase-III-Endonuklease weiterverarbeitet werden, die zu 21-23 nukleotidreifen miRNA-Duplexen verarbeitet wird1. Einer der Stränge der prozessierten reifen miRNA bindet an Zielboten-RNAs (mRNAs), was zu einem Abbau oder einer translationalen Repression der Ziele führt2. Basierend auf der pleiotropen Rolle von miRNAs bei der gleichzeitigen Regulation mehrerer verschiedener Ziel-mRNAs ist es nicht verwunderlich, dass die miRNA-Expression streng reguliert ist3. In der Tat trägt eine unangemessene Expression zu verschiedenen Krankheitszuständen bei, insbesondere bei Krebs. Die aberrante Expression von miRNAs stellt nicht nur eine krankheitsspezifische Signatur dar, sondern hat sich auch als Ziel für prognostische und therapeutische Potenziale herauskristallisiert 4,5,6. Zusätzlich zu ihren intrazellulären Rollen haben miRNAs auch nicht-autonome Rollen. Zum Beispiel können miRNAs von Spenderzellen selektiv in EVs verpackt und an Empfängerstellen exportiert werden, wo sie verschiedene phänotypische Reaktionen in der normalen und krankheitsphysiologischen Physiologie hervorrufen 7,8,9.
Trotz eindeutiger Beweise dafür, dass EV-assoziierte miRNAs funktionelle Biomoleküle sind, ist nicht vollständig verstanden, wie bestimmte Untergruppen von miRNAs in Krankheitszuständen wie Krebs fehlreguliert sind und wie die zelluläre Maschinerie miRNAs selektiert und in Evs10,11 sortiert. Angesichts der potenziellen Rolle von EV-miRNAs bei der Modulation der Mikroumgebung ist es von entscheidender Bedeutung, die Mechanismen zu identifizieren, die am Export ausgewählter miRNAs beteiligt sind, um die Rolle von EVs in der interzellulären Kommunikation und der Krankheitspathogenese vollständig aufzuklären. Das Verständnis des Prozesses der miRNA-Freisetzung in EVs wird nicht nur wichtige Mediatoren des miRNA-Exports hervorheben, sondern kann auch Einblicke in potenzielle Therapeutika geben. Um diesen Wissensstand zu erreichen, müssen die Werkzeuge angepasst werden, um diese neuen experimentellen Fragen getreu zu beantworten. In der Tat nehmen Studien, die Elektrofahrzeuge bewerten, aufgrund der Einführung neuer Techniken und Kontrollen exponentiell zu12,13. In Bezug auf die Bewertung der Häufigkeit von exportierten miRNAs in EVs sind die Sequenzierung der nächsten Generation und die quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) die aktuellen Standardwerkzeuge. Diese Werkzeuge sind zwar nützlich, um die Häufigkeit von miRNAs in Elektrofahrzeugen zu bewerten, aber es gibt Einschränkungen in Bezug auf ihre Sensitivität und Spezifität, und die Verwendung dieser statischen Ansätze zur Bewertung der Dynamik ist unzureichend. Um die Dynamik des miRNA-Exports in Elektrofahrzeuge zu beschreiben, ist eine Kombination spezialisierter Werkzeuge erforderlich. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll vor, das fluoreszenzkonjugierte miRNAs verwendet, um die Dynamik der miRNA-Freisetzung aus Spenderzellen und des Einbaus in EVs zu analysieren. Außerdem gehen wir auf die Vorteile und Grenzen der Methode ein und geben Empfehlungen für den optimalen Einsatz. Die vielseitige Methode, die in dieser Arbeit vorgestellt wird, wird für Forscher nützlich sein, die daran interessiert sind, die miRNA-Freisetzung in EVs und ihre potenzielle Rolle bei zellulärer Kommunikation und Krankheiten zu untersuchen.
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Protocol
HINWEIS: Als Voraussetzung für die Verwendung dieser Technik ist die Identifizierung und Validierung selektiv exportierter miRNAs erforderlich. Da verschiedene Zelllinien je nach der in ihre EVs einsortierten miRNA-Fracht variieren, wird empfohlen, die interessierende Zelllinie und die zugehörigen EVs vor der Verwendung auf miRNAs zu untersuchen. Darüber hinaus ist die Lipofectamin-basierte Transfektion einer der kritischen Schritte im Protokoll. Es wird empfohlen, die Transfektionseffizienz vor dem Aufbau des Experiments im Voraus zu bestimmen.
1. Züchtung von Zellen in Kultur und Transfizierung von Zellen mit Fluorophor-konjugierter EV-miRNA
- Platte von 200.000 bis 400.000 Zellen in dreifachen Vertiefungen in einer 6-Well-Platte in einem geeigneten Nährmedium. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen, bis sie eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreicht haben, etwa 24-48 Stunden.
- Für jede zu transfizierende Vertiefung wird das Transfektionsreagenz in 100 μl serumfreiem Medium in einem Mikrozentrifugenröhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnt.
HINWEIS: Die optimale Lipidkonzentration sollte vor diesem Aufbau für die gewünschte Zelllinie bestimmt werden. - Für jede zu transfizierende Vertiefung werden die Fluorophor-konjugierte EV-miRNA (2 nM) und die Zell-miRNA (2 nM) separat in einem Mikrozentrifugenröhrchen in 100 μl serumfreiem Medium verdünnt.
HINWEIS: Das Gesamtvolumen sollte für die Gesamtzahl der transfizierten Bohrungen berechnet werden. In diesem Protokoll wurde die Fluoreszenz zu 7 Zeitpunkten ausgewertet; daher betrug das Gesamtvolumen 700 μl für Schritt 1.2 und 700 μl für Schritt 1.3. Um die positive fluoreszierende Population von Zellen sicher zu erfassen, sollte der Benutzer außerdem Zellen mit einer nicht-fluoreszierenden verschlüsselten miRNA transfizieren und ein Gate einrichten, das diese Zellen ausschließt. - Die verdünnte RNA-Mischung (aus Schritt 1.3) wird in das verdünnte Transfektionsreagenz (aus Schritt 1.2) gegeben und vorsichtig gemischt, indem das Röhrchen 3-4 Mal umgedreht wird. Lassen Sie das kombinierte Lipid-RNA-Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
- Entfernen Sie die normalen Kulturmedien aus den Zellen und geben Sie 800 μl serumfreies Medium in jede Vertiefung. Geben Sie vorsichtig 200 μl des Lipid-RNA-Gemischs (aus Schritt 1.4) tropfenweise zu den Zellen.
HINWEIS: Opti-MEM-Medien wurden für die Transfektion der interessierenden Zelllinie (Calu6-Zellen) verwendet. Versuchen Sie, die Lipid-RNA-Mischung direkt in das Nährmedium zu geben, und vermeiden Sie es, die Mischung an den Seiten der Platte hinzuzufügen.
2. Entnahme transfizierter Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten zur Analyse der Fluoreszenz
- Die transfizierten Zellen werden bei 37 °C für 7 h inkubiert.
HINWEIS: Um eine konsistente Transfektion beider miRNAs (EV-miRNA und Zell-miRNA) zu validieren, werden die Zellen 3 Stunden nach der Transfektion aus einer Vertiefung entnommen, um die Fluoreszenz mit dem Durchflusszytometer zu analysieren. - Nach der 7-stündigen Inkubationszeit wird der Transfektionskomplex aus den Vertiefungen entfernt und durch vollständige Medien ersetzt.
- Um den 7-Stunden-Zeitpunkt zu bewerten, ernten Sie die Zellen und waschen Sie die Zellen dreimal mit 1x PBS.
- Wenn Sie mit adhärenten Zellen arbeiten, geben Sie 200 μl Trypsin in eine Vertiefung und warten Sie, bis sich die Zellen von der Platte gelöst haben. Die abgelösten Zellen werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und durch Zentrifugation bei 200xg für 5 Minuten zentrifugiert.
- Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, um eine Störung des Zellpellets zu vermeiden. Für die erste PBS-Wäsche wird das Pellet in ~500 μl 1x PBS resuspendiert und die Pelletierung mit den oben genannten Zentrifugationsschritten wiederholt. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche noch zwei weitere Male.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl 2%iger Paraformaldehyd (PFA)-Lösung und bewerten Sie die Fluoreszenz.
HINWEIS: Nach Zugabe von 2% PFA kann das Zellpellet 3-4 Tage bei 4 °C gelagert werden.
- Ernten Sie die verbleibenden Zeitpunkte, indem Sie die Schritte in Abschnitt 2.3 ausführen. Sammeln Sie alle gelagerten Zellpellets und fahren Sie mit den Schritten in Abschnitt 3 fort.
3. Durchflusszytometrische Analyse des Zell-miRNA- und EV-miRNA-Signals in Zellen
- Bereiten Sie die Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse vor. Filtern Sie die Zellsuspension aus Abschnitt 2 bis zu 35-μm-Siebkappen, die Teil der FACS-Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden sind, um die Entfernung von Ablagerungen und Zellaggregaten zu ermöglichen, die die Fluorophoranalyse beeinträchtigen könnten.
- Richten Sie das Gerät gemäß den Kalibrierungsanweisungen ein. Schalten Sie das Durchflusszytometer ein und lassen Sie es vor Gebrauch mindestens 30 Minuten lang aufwärmen. Entlüften Sie das Fluidiksystem mit Mantelflüssigkeit und überprüfen und justieren Sie die Laserausrichtung.
- Führen Sie eine Qualitätskontrolle durch, um die Fluidik des Geräts zu bestätigen. Laden Sie hochreines gefiltertes Wasser in das Durchflusszytometer und lassen Sie es mit einer geeigneten Durchflussrate für eine angemessene Aufnahmezeit laufen.
HINWEIS: Die geeignete Flussrate und Erfassungszeit hängt vom gewünschten Zelltyp, der Komplexität der Probe und der gewünschten Datenqualität ab. - Öffnen Sie die Datenanalysesoftware für die Durchflusszytometrie und überprüfen Sie die Leistung des Detektors und der Laser. Richten Sie Schwellenwert- und Spannungsparameter für die Detektion basierend auf der gewünschten Zelllinie und den Fluorophoren Ihrer Wahl ein.
HINWEIS: Für alle nachgeschalteten Experimente wurden Calu6-Zellen verwendet.- Stellen Sie den Schwellenwert für die Erfassung des Signals für Calu6-Zellen auf FSC 5000 ein. Führen Sie die Analyse für 1 x 104 Zellen für jede experimentelle Wiederholung durch.
- Um die spektrale Überlappung zwischen verschiedenen Fluorophoren zu berücksichtigen, verwenden Sie nicht transfizierte Zellen und Zellen, die unabhängig voneinander mit nur einem der Fluorophore transfiziert wurden, um Kompensationskontrollen einzurichten.
- Für den Nachweis des miRNA-Exports werden EV-miRNA-Kandidaten (miR-451a und miR-150) verwendet, die an Alexa-fluor 488 konjugiert sind, und eine Kontrollzell-miRNA (cel-miR-67), die an Cy3 konjugiert ist.
- Für jede EV-miRNA wird das Fluorophor an das 5'-Ende des 5p-Strangs konjugiert. Vor der Transfektion wird der Fluorophor-konjugierte Strang zu seinem 100% komplementären 3p-Strang geglüht.
- Für die Expressionsanalyse in transfizierten Zellen werden die Proben mit den Spannungseinheiten 258, 192, 269 bzw. 423 Spannungseinheiten FSC, SSC, FITC und PE analysiert (Abbildung 1A, B).
- Die negative Kontrollprobe wird in das Durchflusszytometer eingeführt. Erfassen Sie Zellensignale, nachdem Sie die Intensitäten der Vorwärtsstreuung (FSC) und der Seitenstreuung (SSC) in einem benutzerdefinierten Arbeitsblatt definiert haben.
- Wählen Sie im Diagramm FSC für die X-Achse, SSC für die Y-Achse und Gate für die interessierende Grundgesamtheit aus, indem Sie ein Polygon um sie herum zeichnen (siehe Abbildung 1B, unteres Feld).
- Erstellen Sie ein neues Diagramm mit der abgegrenzten Bevölkerung.
- Stellen Sie die X-Achse auf Fluoreszenzsignal 1 (FS1) für die Zell-miRNA-Detektion und die Y-Achse auf Fluoreszenzsignal 2 (FS2) für die EV-miRNA-Detektion ein. Richten Sie Kompensationsparameter für die einzelnen Fluorophore ein, indem Sie Zellen verwenden, die unabhängig voneinander mit jeder der fluoreszenzmarkierten miRNAs transfiziert wurden. Im neuen Diagramm wird die interessierende Population angezeigt.
- Für den Nachweis von EV-miRNA verwenden Sie den FITC-Kanal. Für die Auswertung des Zell-miRNA-Signals verwenden Sie den PE-Kanal. Erstellen Sie in der Software ein Gatter um die Zellen, die sowohl für FITC als auch für PE positiv waren, indem Sie ein Polygon um die Doppelfluoreszenzpopulation zeichnen, wenn FITC für die X-Achse und PE für die Y-Achse ausgewählt wurde.
- Zeichnen Sie die Statistiken für die Gated Population auf.
- Notieren Sie den Prozentsatz der Zellen in der abgegrenzten Population, die sowohl für FITC als auch für PE positiv sind, sowie für diejenigen, die entweder FITC oder PE positiv sind.
- Wiederholen Sie die obigen Schritte für alle weiteren Proben oder Kontrollen im Experiment.
4. Isolierung von EVs aus transfizierten Zellen
- Bei Zellen, die in serumhaltigen Medien kultiviert wurden, sollten EVs aus dem Serum entfernt werden, um eine Kreuzkontamination zu verhindern.
- Um EV-abgereichertes Serum zu erzeugen, verdünnen Sie das Serum auf 50 % in Zellkulturmedien, um die Viskosität zu reduzieren, und zentrifugieren Sie das resultierende 50%ige Serum bei 110.000 x g für 18 Stunden.
- Sammeln Sie den Überstand (EV-freies Serum) sorgfältig und filtern Sie ihn mit einer 0,2-μm-Filteranordnung. Verwenden Sie das resultierende 50 % EV-freie Serum, um vollständige Medien zu erzeugen, in diesem Fall RPMI plus 10 % Serum.
- Um EVs zu sammeln, geben Sie die EV-armen kompletten Medien in die Zellen und sammeln Sie die EVs 48 Stunden nach der Inkubation.
HINWEIS: Das unten beschriebene Protokoll wurde von Kowal et al.14 modifiziert.
- Züchten Sie Zellen in 15 cm großen Gewebekulturschalen bis zu 80 % Konfluenz. Transfizieren Sie die Zellen separat mit Zell-miRNA und EV-miRNA in 10 ml Opti-MEM gemäß dem Transfektionsprotokoll in Abschnitt 1 des Protokolls.
HINWEIS: Nicht alle Transfektionsprotokolle skalieren linear. Es kann notwendig sein, zunächst die Transfektionsbedingungen in 15-cm-Platten anzupassen und zu bewerten. - Nach 7 h wird das Transfektionsmedium abgesaugt und durch das EV-abgereicherte Medium (15 ml) ersetzt. Züchten Sie die Zellen 48 Stunden lang in den EV-armen Medien.
- Entnehmen Sie das konditionierte Medium aus den Zellen und geben Sie es in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen in der Biosicherheitswerkbank. Das konditionierte Medium wird bei 2000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um abgestorbene Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Den entstandenen Überstand in ein frisches Röhrchen überführen.
- Den Überstand bei 10.000 x g 40 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und filtern Sie ihn mit einer 0,2-μm-Filterbaugruppe.
- Überführen Sie die filtrierten Zellkulturmedien in ein steriles Ultrazentrifugenröhrchen in der Biosicherheitswerkbank. Wiegen und balancieren Sie die Röhrchen gegeneinander. Die Proben werden bei 110.000 x g für 90 min bei 4 °C geschleudert. Verwerfen Sie den Überstand.
- Das Pellet wird in einem geeigneten Volumen von 1x PBS zum Waschen und Zentrifugieren bei 110.000 x g für 90 min 4 °C resuspendiert.
HINWEIS: Das EV-Pellet wurde in 60 ml 1x PBS resuspendiert, basierend auf dem maximal zulässigen Volumen für die in dieser Studie verwendeten Rotorrohre mit festem Winkel. - Saugen Sie PBS ab und suspendieren Sie das EV-Pellet in einem geeigneten Volumen (50-100 μl) frischer 1x PBS und Vortex. Lagern Sie Elektrofahrzeuge bei -80 °C für die spätere Verwendung.
5. Durchflusszytometrische Analyse des Zell-miRNA- und EV-miRNA-Signals in EVs
- Um die EV-Suspension für die Durchflusszytometrie-Analyse vorzubereiten, verdünnen Sie EVs in einem geeigneten Volumen ultrafiltrierter 1x PBS.
HINWEIS: Das Beladungsvolumen für die Durchflusszytometrie-Analyse von EVs sollte auf der Grundlage der Anzahl der EVs in den Proben bestimmt werden. Grob gesagt, wenn sich ~30.000 Partikel in der EV-Suspension befinden, sollte das endgültige Volumen ~500-600 μL in 1x PBS betragen. Eine saubere Probe hat etwa 35-50 Partikel/μl. - Verwenden Sie das Nano-Durchflusszytometer oder ein alternatives Gerät, das leistungsstark genug ist, um Partikel in Nanogröße zu analysieren.
HINWEIS: Hier wurde das Nano-Durchflusszytometer Attune NxT verwendet. - Öffnen Sie die Software und richten Sie das Gerät gemäß den empfohlenen Kalibrierungsanweisungen ein. Führen Sie den Leistungstest mit Performance-Nanoperlen durch. Werden die Nanoperlen im Standardgrößenbereich detektiert, ist die Leistung optimal. Bestimmen Sie die geeignete Durchflussrate für die Detektion von EV-Partikeln.
- Führen Sie eine Qualitätskontrolle mit hochreinem gefiltertem Wasser durch, um die Fluidik des Instruments und die Leistung von Detektor und Lasern zu bestätigen.
- Stellen Sie das Durchflusszytometer unter Verwendung von für das Experiment geeigneten Kalibrierperlen so ein, dass es unterschiedlich große Kügelchen genau erkennt und Fluoreszenzsignale misst.
HINWEIS: Für den Aufbau der EV-Analyse mittels Durchflusszytometrie wurden ApogeeMix-Kügelchen verwendet. Diese Kügelchen enthalten eine Mischung aus nicht fluoreszierenden Kieselsäurekügelchen und fluoreszierenden Polystyrolkügelchen in Größen von 80 nm bis 1300 nm.- Richten Sie die Parameter ein, um die Empfindlichkeit und Auflösung verschiedener Populationen in der Perlenmischung gemäß dem Protokoll des Herstellers zu bewerten. Verwenden Sie das geeignete Gating, um die Perlenpopulation aus dem Instrumentenrauschen aufzulösen.
- Vortexen Sie die Proben gründlich, um die EVs gleichmäßig zu verteilen, bevor sie zur Analyse geladen werden.
- Öffnen Sie die Datenanalysesoftware für die Durchflusszytometrie und führen Sie ultrafiltriertes PBS ein. Richten Sie das Gating für EV-Partikel mit ultrafiltriertem PBS ein und stellen Sie sicher, dass das Gating der entsprechenden Größe der Partikel entspricht, die auf den Kügelchen in Schritt 5.5 basieren.
- Laden Sie die negative Kontrollprobe, um EVs zu analysieren, während sie das Durchflusszytometer passieren. Erfassen Sie EV-Signale, während Sie FSC auf der X-Achse und SSC auf der Y-Achse aufzeichnen.
HINWEIS: Der SSC-Schwellenwert für die Erfassung von Elektrofahrzeugen wurde auf 300 festgelegt. Das Erfassungsvolumen wurde auf 95 μl von insgesamt 145 μl gezogenem Volumen festgelegt. Die Durchflussrate wurde auf 12,5 μl/min eingestellt. Die Analyse wurde mit 1 x 106 EV-Partikeln durchgeführt. Die Population von Elektrofahrzeugen ist heterogen und führt dazu, dass einige Trümmer zusammen mit Elektrofahrzeugen isoliert werden. Die Gesamtpartikeldetektion im FSC- vs. SSC-Diagramm hebt Partikel in einem vielfältigen Bereich hervor, was bei der Verwendung von rohen EV-Präparaten zu erwarten ist. - Erstellen Sie ein neues Diagramm mit der abgegrenzten Bevölkerung.
- Wählen Sie dieses Mal das Fluoreszenzsignal 1 (FS1) für die Zell-miRNA-Detektion auf der X-Achse und das Fluoreszenzsignal 2 (FS2) für die EV-miRNA-Detektion auf der Y-Achse.
- Richten Sie Kompensationsparameter für die Fluorophore ein, indem Sie die EV-Proben verwenden, die aus Zellen isoliert wurden, die mit einer einzigen miRNA transfiziert wurden. Im neuen Diagramm wird die EV-Population von Interesse angezeigt.
- Für die Expressionsanalyse von Fluorophor-konjugierten miRNAs in EVs, die aus den transfizierten Zellen isoliert wurden, werden die EV-Proben mit den FSC-, SSC-, BL1- und YL1-Kanälen analysiert, die auf 370, 370, 400 bzw. 400 Spannungseinheiten eingestellt sind (Abbildung 2A, B).
- Zeichnen Sie die Statistiken für die Gated Population auf und visualisieren Sie sie mithilfe von Histogrammen und Punktdiagrammen.
- Wiederholen Sie die obigen Schritte für alle weiteren Proben oder Kontrollen im Experiment.
6. Validierung der Freisetzung von miRNAs in EVs durch qRT-PCR
- Extrahieren Sie RNA aus EVs und Elternzellen mit dem miRVana RNA-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Die Quantifizierung von RNA, die aus EVs isoliert wurde, ist nicht möglich, da die Gesamtmenge der aus EVs isolierten RNA in der Regel nicht die minimale Mengenschwelle eines Standard-Nanotropfens überschreitet. Dies ist auf die Verarmung der ribosomalen RNA aus EV-Proben zurückzuführen, die mit dem Agilent Bioanalyzer validiert werden kann. Daher ist der Integritätswert für die EV-RNA-Quantifizierung in der Regel nicht zuverlässig und entspricht nicht der wahren Darstellung der EV-RNA-Menge. Daher wurden für die qRT-PCR-Quantifizierung der EV-RNA und der Zell-RNA gleiche Volumina an RNA-Isolaten nach der Isolierung aus einer gleichen Anzahl von Zellen verwendet. Für die Normalisierung der qRT-PCR wurden miRNAs verwendet, die ubiquitär in mehreren Proben vorhanden sind, wie aus zuvor erworbenen RNA-Sequenzierungsdaten bestimmt. - Wandeln Sie die extrahierte RNA in cDNA um, indem Sie ein Reverse-Transkriptase-Kit verwenden, das speziell für kleine RNAs geeignet ist.
- Richten Sie die qRT-PCR-Reaktion mit einem cDNA-Template und miRNA-spezifischen Primern gemäß den Anweisungen des Herstellers ein.
HINWEIS: Für Validierungsexperimente wurden das miRCURY LNA qRT PCR-Kit und die entsprechenden Primer des Herstellers verwendet, um die Expression von Zell-miRNA und EV-miRNA zu bewerten.
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Representative Results
Hier nutzen wir die Durchflusszytometrie als leistungsfähiges Werkzeug, um die Freisetzung von miRNA aus den Zellen in EVs zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Protokolls ergab die Durchflusszytometrie-Analyse von Zellen, die mit Zell-miRNA und EV-miRNA transfiziert wurden, eine sequentielle Abnahme des Fluoreszenzsignals, das der EV-miRNA entspricht, während das Signal, das der Zell-miRNA entspricht, in den Zellen erhalten blieb. Um sicherzustellen, dass die Fluorophor-Konjugation die miRNA-Freisetzung in EVs nicht beeinträchtigt, wurde miR-451a mit zwei separaten Fluorophoren (d. h. Alexa fluor 488 und Alexa fluor 750) konjugiert und die Zellretention untersucht. Die Ergebnisse deuten auf eine minimale Variabilität zwischen der Detektion der einzelnen Fluorophorsignale nach der Transfektion hin, was die Zuverlässigkeit dieses Ansatzes bestätigt (Abbildung 3A,B).
Da verschiedene Gründe den Verlust von fluoreszenzmarkiertem miR-451a aus den Zellen erklären könnten, einschließlich des RNA-Abbaus, war es wichtig zu überprüfen, ob der Zellverlust mit der EV-Häufigkeit zusammenfiel. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde die Akkumulation von miR-451a, das mit Alexa fluor-488 konjugiert ist, in EVs zeitabhängig beobachtet, was einen Beweis für eine effiziente Verpackung und eventuelle Freisetzung der miRNA in EVs liefert. Im Gegensatz dazu wurde das Fluoreszenzsignal, das der zellerhaltenen miRNA cel-miR-67 entspricht, in den EVs nicht nachgewiesen (Abbildung 4). Diese Ergebnisse mit diesem neuen Ansatz wurden mittels qRT-PCR validiert, die ein signifikant höheres EV/Zellexpressionsverhältnis für miR-150, eine zusätzliche EV-miRNA, im Vergleich zur Zell-miRNA cel-miR-67 ergab (Abbildung 5).
Abbildung 1: Aufbau von Durchflusszytometerparametern zur Detektion von Signalen in Zellen. (A) Für die Analyse der Zellfluoreszenz wurden mit Hilfe der Software die markierten Spannungen für die angegebenen Parameter eingestellt. Das Gerät wurde so eingerichtet, dass es 10.000 Zellen pro Probe aufzeichnet. Die Inspektoransicht bestätigt die für die Erkennung und Analyse eingerichteten Parameter. (B) Für die Analyse der Zellfluoreszenz wurde der Schwellenwert für den FSC-Parameter auf der Registerkarte Zytometereinstellungen der Software auf 5.000 festgelegt. Im oberen rechten Bereich werden die Lasereinstellungen für die Datenerfassung angezeigt. Die unteren Bereiche zeigen ein aktives globales Arbeitsblatt während des Fortschritts der Erkennung von Zellen. Die Proben wurden bei einem mittleren Durchfluss durchgeführt und erfasst, wobei FSC-A und SSC-A als Parameter der x-Achse bzw. der y-Achse bestimmt wurden. Das Gating wurde mit einem Polygon-Zeichenwerkzeug um die interessierende Grundgesamtheit herum festgelegt. Das Gating kann für eine andere Zelllinie von Interesse unterschiedlich sein, abhängig von der Diversität der Zellpopulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Aufbau von Durchflusszytometrie-Parametern für die Signaldetektion in EVs. (A) Für die Detektion und nachgeschaltete Analyse von EVs wurde das Erfassungsvolumen auf 95 μl und die Flussgeschwindigkeit auf 12,5 μl/min eingestellt. Der gewählte Schwellenwert für die EV-Erkennung betrug 0,3 x 1000 auf der Registerkarte "Geräteeinstellungen" der Software, basierend auf den verwendeten Kalibrierungsperlen. Die Spannungen für FSC, SSC, BL1 und YL1 betrugen 370, 370, 400 bzw. 400. (B) Einrichtung eines Gatings zur Erfassung heterogener EV-Populationen und zur Unterscheidung von EVs vom Hintergrundrauschen des Instruments. Eine leere PBS-Probe (oben) wurde als Negativkontrolle verwendet, um das Hintergrundrauschen der EV-Bevölkerung aufzulösen. Die EV-Stichprobe (unten) zeigt, dass die interessierende Grundgesamtheit nur 1,8 % der Gesamtpopulation ausmacht, da die Stichprobe heterogen ist und sich überlappende Partikel im Größenbereich aufweist. Es wurde jedoch ein strenges Gating gewählt, um die Erkennung der interessierenden EV-Population zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Signaldetektion in Zellen durch Durchflusszytometrie. (A) Fluoreszenz, die EV-miRNA und Zell-miRNA entspricht, wurde in Zellen zu Zeitpunkten nachgewiesen, die zwischen 7 und 72 Stunden nach der Transfektion angegeben waren. Das Signal, das EV-miR-451a (Alexa fluor-488) entspricht, nahm mit der Zeit im Vergleich zum Signal der zellretained-miRNA, cel-miR-67, ab. (B) Die Fluoreszenz, die EV-miR-451a mit Alexa fluor-750 markiert war, zeigte den gleichen Trend wie die Alexa Fluro-488 mit miR-451a, was darauf hindeutet, dass das Fluorophor die Retention von miRNAs durch die Zellen nicht beeinflusst. Insgesamt deuten die repräsentativen Ergebnisse darauf hin, dass sich die transfizierte miRNA ähnlich wie die endogene miRNA verhält, basierend auf dem Export der miRNA in EVs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Signaldetektion in EVs durch Durchflusszytometrie. Fluoreszenz, die EV-miR-451a und Zell-cel-miR-67 entspricht, wurde in EVs 24 h und 48 h nach der Transfektion nachgewiesen. Das Signal, das EV-miR-451a (Alexa fluor-488) entspricht, wurde 48 Stunden nach der Transfektion in EVs erfasst. Im Gegensatz dazu wurde das Signal für cel-miR-67 in Elektrofahrzeugen nicht detektiert. Eine leere PBS-Probe wurde verwendet, um das Gating für dieses Experiment einzurichten, wie in Abbildung 2B dargestellt. EV-Proben, die aus Zellen isoliert wurden, die mit nicht-fluoreszierender verschlüsselter RNA transfiziert wurden, wurden als Negativkontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Quantifizierung von EV-miRNA und Zell-miRNA in Zellen und EVs mittels qRT-PCR. Calu6-Zellen wurden mit jeweils 2 nM miR-150 und cel-miR-67 transfiziert. Die EVs wurden 48 Stunden nach der Transfektion gesammelt. Die EV-Anreicherung wurde berechnet als das Verhältnis der EV-Expression dividiert durch die zelluläre Expression in transfizierten Calu6-Zellen für miR-150 und cel-miR-67. Basierend auf RNA-Sequenzierungsergebnissen, die die Expression von miRNAs in Calu6-Zellen und ihren entsprechenden EVs verglichen, wurde miR-30c als endogene Kontrolle und Normalisierer für die Berechnung von Faltungsänderungen verwendet. Die dargestellten Daten stammen von einem biologischen Replikat, wobei jeder Datenpunkt dreifache qRT-PCR-Reaktionen aufweist. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt, und die p-Werte wurden mit einem ungepaarten t-Test mit Welch-Korrektur berechnet (**p < 0,01). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Stärken | Schwächen |
| Ermöglicht die gleichzeitige Bewertung des selektiven Exports mehrerer miRNAs in Zellen und entsprechende EVs | Erfordern Sie zusätzliche Verfahren zur Unterscheidung zwischen aktivem und passivem Exportphänomen |
| Die Bewertung der groben heterogenen Population ist möglich und erfordert keine vorherige Trennung der EV-Populationen. Kann verwendet werden, um verschiedene Arten von Elektrofahrzeugen zu analysieren HINWEIS: Der Schwellenwert für den Nachweis verschiedener Arten von Partikeln variiert |
Die geringe Empfindlichkeit ermöglicht es nicht, begrenzte Konzentrationen von miRNAs in Zellen oder EVs nachzuweisen. Dies kann durch die Einbeziehung einer nachgeschalteten qRT-PCR-Analyse nach der RNA-Isolierung aus EVs überwunden werden |
| Erfordert eine kurze Zeit für die Einrichtung und Analyse im Vergleich zu Standardmethoden zur miRNA-Quantifizierung | Fehlen von Standardisierungsprotokollen für verschiedene Arten von Geräten, Zelllinien und verschiedenen Fluorophoren. |
Tabelle 1: Die wichtigsten Stärken und Schwächen des Protokolls.
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Discussion
Das neu etablierte Protokoll ermöglicht es, die Kinetik der miRNA-Freisetzung in EVs nach der Transfektion von EV-miRNAs zu erfassen. Der Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer EV-miRNAs und Zell-miRNAs, abhängig von den Fähigkeiten des Zytometers. Darüber hinaus kann die Durchflusszytometrie zwar wertvolle Einblicke in die Biologie von EV-miRNAs liefern, ist aber nicht ohne Einschränkungen. Einige der Einschränkungen können jedoch überwunden werden, wenn sie in Verbindung mit anderen Techniken für ein umfassenderes Verständnis verwendet werden.
Ein aufstrebendes Interessengebiet in der EV-Biologie ist das Verständnis des selektiven Exports von miRNAs in EVs15,16. Während dieses Protokoll ein leistungsfähiges Werkzeug bietet, um den selektiven Export von miRNA zu untersuchen, besteht eine der entscheidenden Herausforderungen darin, zwischen aktivem und passivem Export zu unterscheiden. Es ist Vorsicht geboten, da die Überexpression einer miRNA in einer ausreichend hohen Konzentration den Export von miRNA verändern könnte, was möglicherweise zu einer unangemessenen passiven Beladung führen kann. Daher ist das Experimentieren zur Bestimmung der optimalen Transfektionskonzentrationen von miRNAs bei der Untersuchung des selektiven Exports von entscheidender Bedeutung.
Darüber hinaus ermöglicht das Protokoll in Kombination mit komplementären Techniken wie der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) dem Forscher, die EV-Partikelzahl zu bewerten und gleichzeitig die miRNA-Freisetzung zu bewerten, und hat das Potenzial, zwischen Veränderungen in den EV-Biogenese-Signalwegen und miRNA-Exportmechanismen zu unterscheiden. Dies ist besonders wichtig, da sich die Mediatoren dieser Prozesse überlappen17. In Anbetracht der Tatsache, dass miRNAs verschiedene Phänotypen beeinflussen können, einschließlich einiger, die an der EV-Biogenese beteiligt sind, wäre es ratsam, die Partikelzahl nach der Transfektion von miRNAs zu bewerten18. Um diese Hürde zu überwinden, wäre eine weitere Möglichkeit, eine EV-miRNA einzubauen, die unter den experimentellen Bedingungen unverändert bleibt, wodurch Faktoren ausgeschlossen werden, die an der EV-Biogenese beteiligt sind, und gleichzeitig die Wege des EV-miRNA-Exports hervorgehoben werden.
In mehreren Studien wurden miRNAs mittels qRT-PCR, einer Standardmethode zur endogenen miRNA-Quantifizierung, quantifiziert 10,11,16. Es fehlt jedoch die Fähigkeit, die Freisetzung von miRNAs in Elektrofahrzeuge dynamisch zu erfassen. Beim Vergleich der Durchflusszytometrie mit der qRT-PCR unterscheiden sie sich stark in Bezug auf die Empfindlichkeit und das Design des Assays. Während die qRT-PCR eine hochempfindliche Technik ist und theoretisch in der Lage ist, minimale miRNA-Kopienzahlen zu quantifizieren, erfordert die Unterscheidung von zwei Proben einen mindestens 2-fachen (100%) Unterschied in der Kopienzahl der interessierenden miRNAs. Die Durchflusszytometrie hingegen erfasst signalbasierte Unterschiede basierend auf der Häufigkeit fluoreszenzmarkierter miRNA und kann kleine prozentuale Änderungen in Signalen unterscheiden. Seine geringe Empfindlichkeit schränkt jedoch den Nachweis von miRNAs mit begrenzter Kopienzahl ein. Die beiden Techniken ergänzen sich synergetisch, wenn sie zusammen verwendet werden, wie im Protokoll angegeben.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der selektiven miRNA-Exportdynamik bietet. Trotz der oben genannten Herausforderungen liegt die Stärke dieses Protokolls in seiner Fähigkeit, mehrere miRNAs gleichzeitig zu analysieren, was zu einem besseren Verständnis der miRNA-Biologie, ihres Exports und ihrer Rolle in der EV-Biologie beiträgt. Die wichtigsten Stärken und Schwächen des Protokolls, die berücksichtigt werden müssen, sind in Tabelle 1 aufgeführt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Jill Hutchcroft, Direktorin der Flow Cytometry Core Facility an der Purdue University, für die Unterstützung und den Rat. Diese Arbeit wurde von R01CA226259 und R01CA205420 an A.L.K., einem American Lung Association Innovation Award (ANALA2023) IA-1059916 an A.L.K., einem Purdue Shared Resource Facility Grant P30CA023168 und einem Flaggschiff-Fulbright-Promotionsstipendium unterstützt, das vom Department of the State, USA, an S.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
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