Summary
Här beskriver vi ett enkelt protokoll som möjliggör in vitro-bedömning av förekomsten av fluorescerande märkta mikroRNA för att studera dynamiken i mikroRNA-förpackning och export till extracellulära vesiklar (EV).
Abstract
Extracellulära vesiklar (EV) är viktiga förmedlare av cellulär kommunikation som utsöndras av en mängd olika celler. Dessa EV transporterar bioaktiva molekyler, inklusive proteiner, lipider och nukleinsyror (DNA, mRNA, mikroRNA och andra icke-kodande RNA), från en cell till en annan, vilket leder till fenotypiska konsekvenser i mottagarcellerna. Av alla olika EV-laster har mikroRNA (miRNA) fått stor uppmärksamhet för sin roll i att forma mikromiljön och i att utbilda mottagarceller på grund av deras tydliga dysreglering och överflöd i EV. Ytterligare data tyder på att många miRNA aktivt laddas in i EV. Trots dessa tydliga bevis är forskningen om dynamiken i export och mekanismerna för miRNA-sortering begränsad. Här tillhandahåller vi ett protokoll med hjälp av flödescytometrianalys av EV-miRNA som kan användas för att förstå dynamiken i EV-miRNA-laddning och identifiera maskineriet som är involverat i miRNA-export. I detta protokoll konjugeras miRNA som är förutbestämda att anrikas i EV och utarmas från donatorceller till en fluorofor och transfekteras in i donatorcellerna. De fluorescerande märkta miRNA:erna verifieras sedan för laddning i EV och utarmning från celler med hjälp av qRT-PCR. Som både en transfektionskontroll och ett verktyg för att styra den transfekterade populationen av celler, ingår ett fluorescerande märkt cellulärt RNA (cellkvarhållet och EV-utarmat). Celler som transfekterats med både EV-miRNA och cell-retained-miRNA utvärderas för fluorescerande signaler under loppet av 72 timmar. Fluorescenssignalintensiteten som är specifik för EV-miRNA minskar snabbt jämfört med det cellkvarhållna miRNA:t. Med hjälp av detta enkla protokoll kunde man nu bedöma dynamiken i miRNA-laddningen och identifiera olika faktorer som är ansvariga för att ladda miRNA i EV.
Introduction
MikroRNA (miRNA) är en av de bäst karakteriserade undergrupperna av små icke-kodande RNA, som är kända för sin kritiska roll i post-transkriptionell genreglering. Uttrycket och biogenesen av de flesta miRNA följer en koordinerad serie händelser som börjar med transkription av de primära miRNA (pri-miRNA) i kärnan. Efter nukleär bearbetning av mikroprocessorkomplexet till prekursor-miRNA (pre-miRNA), exporteras pre-miRNA till cytoplasman, där de genomgår ytterligare bearbetning av RNas III-endonukleas, dicer till 21-23 nukleotidmogna miRNA-duplexer1. En av strängarna i det bearbetade mogna miRNA:t binder till målbudbärar-RNA (mRNA), vilket leder till nedbrytning eller translationell repression av måltavlorna2. Baserat på miRNA:s pleiotropa roll i att samtidigt reglera flera olika mål-mRNA är det inte förvånande att miRNA-uttrycket är hårt reglerat3. Faktum är att olämpligt uttryck bidrar till olika sjukdomstillstånd, särskilt vid cancer. Det avvikande uttrycket av miRNA representerar inte bara en sjukdomsspecifik signatur utan har också visat sig vara ett mål för prognostisk och terapeutisk potential 4,5,6. Förutom sina intracellulära roller har miRNA också icke-autonoma roller. Till exempel kan miRNA selektivt förpackas i EV av donatorceller och exporteras till mottagarplatser där de framkallar olika fenotypiska svar i normal fysiologioch sjukdomsfysiologi 7,8,9.
Trots tydliga bevis för att EV-associerade miRNA är funktionella biomolekyler, är det inte helt klarlagt hur specifika undergrupper av miRNA är dysreglerade i sjukdomstillstånd som cancer och hur cellulärt maskineri selekterar och sorterar miRNA till Evs10,11. Med tanke på den potentiella roll som EV-miRNA spelar för att modulera mikromiljön är det viktigt att identifiera de mekanismer som är involverade i exporten av utvalda miRNA för att fullt ut belysa EV:s roll i intercellulär kommunikation och sjukdomspatogenes. Att förstå processen för miRNA-frisättning i EV kommer inte bara att belysa viktiga mediatorer för miRNA-export utan kan också ge insikter om potentiella terapier. För att uppnå denna kunskapsnivå måste verktygen anpassas för att troget ta itu med dessa nya experimentella frågor. Faktum är att studier som utvärderar elbilar växer exponentiellt på grund av införandet av ny teknik och kontroller 12,13. När det gäller att utvärdera förekomsten av exporterade miRNA till EV har nästa generations sekvensering och kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR) varit de nuvarande standardverktygen. Även om dessa verktyg är användbara för att utvärdera överflödet av miRNA i EV, finns det begränsningar för deras känslighet och specificitet, och att använda dessa statiska metoder för att utvärdera dynamik är otillräckligt. Att avgränsa dynamiken i miRNA-export till EV kräver en kombination av specialiserade verktyg. Här presenterar vi ett omfattande protokoll med hjälp av fluorescerande konjugerade miRNA för att analysera dynamiken i miRNA-frisättning från donatorceller och inkorporering i EV. Vi diskuterar också metodens fördelar och begränsningar och ger rekommendationer för optimal användning. Den mångsidiga metoden som presenteras i denna artikel kommer att vara användbar för forskare som är intresserade av att studera miRNA-frisättning i EV och deras potentiella roller i cellulär kommunikation och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Som en förutsättning för att använda denna teknik krävs identifiering och validering av selektivt exporterade miRNA. Eftersom olika cellinjer varierar beroende på miRNA-lasten som sorteras in i deras EVs, rekommenderas det att cellinjen av intresse och tillhörande EVs utvärderas för miRNA före användning. Dessutom är lipofektaminbaserad transfektion ett av de kritiska stegen i protokollet; Vi rekommenderar att du bestämmer transfektionseffektiviteten i förväg innan du sätter upp experimentet.
1. Odling av celler i odling och transfektering av celler med fluoroforkonjugerat EV-miRNA
- Platta 200 000 till 400 000 celler i tre brunnar i en 6-hålsplatta i ett lämpligt odlingsmedium. Snurra försiktigt plattan för att säkerställa jämn cellfördelning. Inkubera cellerna tills de når 70%-80% sammanflöde, cirka 24-48 timmar.
- För varje brunn som ska transfekteras, späd transfektionsreagenset i 100 μL serumfritt medium i ett mikrocentrifugrör enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Den optimala koncentrationen av lipid bör bestämmas för den cellinje som är av intresse före denna inställning. - För varje brunn som ska transfekteras, späd det fluoroforkonjugerade EV-miRNA (2nM) och cell-miRNA (2nM) separat i ett mikrocentrifugrör i 100 μl serumfritt medium.
OBS: Den totala volymen bör beräknas för det totala antalet transfekterade brunnar. I detta protokoll utvärderades fluorescensen vid 7 tidpunkter; därför var den totala volymen 700 μL för steg 1.2 och 700 μL för steg 1.3. Dessutom, för att med säkerhet fånga den positiva fluorescerande populationen av celler, bör användaren transfektera celler med ett icke-fluorescerande förvrängt miRNA och sätta upp en grind som utesluter dessa celler. - Tillsätt den utspädda RNA-blandningen (från steg 1.3) till det utspädda transfektionsreagenset (från steg 1.2) och blanda försiktigt genom att vända röret 3-4 gånger. Låt den kombinerade lipid-RNA-blandningen inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort de vanliga odlingsmedierna från cellerna och tillsätt 800 μl serumfritt medium till varje brunn. Tillsätt försiktigt 200 μL lipid-RNA-blandningen (från steg 1.4) droppvis till cellerna.
OBS: Opti-MEM-media användes för att transfektera cellinjen av intresse (Calu6-celler). Försök att tillsätta lipid-RNA-blandningen direkt till odlingsmediet och undvik att tillsätta blandningen på plattans sidor.
2. Skörd av transfekterade celler vid olika tidpunkter för analys av fluorescens
- Inkubera de transfekterade cellerna vid 37 °C i 7 timmar.
OBS: För att validera konsekvent transfektion av båda miRNA (EV-miRNA och cell-miRNA) samlas celler in från en brunn 3 timmar efter transfektion för att analysera fluorescensen med hjälp av flödescytometern. - Efter inkubationstiden på 7 timmar avlägsnas transfektionskomplexet från brunnarna och ersätts med komplett media.
- För att utvärdera 7-timmarstidpunkten, skörda cellerna och tvätta cellerna tre gånger med 1x PBS.
- Om du arbetar med vidhäftande celler, tillsätt 200 μL trypsin till en brunn och vänta tills cellerna lossnar från plattan. Överför de lossnade cellerna till ett mikrocentrifugrör och pellets genom centrifugering vid 200xg i 5 min.
- Kassera supernatanten försiktigt för att undvika att cellpelleten störs. För den första PBS-tvätten, återsuspendera pelleten i ~500 μL 1x PBS och upprepa pelleteringen med hjälp av centrifugeringsstegen ovan. Upprepa PBS-tvätten ytterligare två gånger.
- Återsuspendera cellpelleten i 200 μL 2% paraformaldehydlösning (PFA) och utvärdera fluorescensen.
OBS: Efter tillsats av 2% PFA kan cellpelleten förvaras vid 4 °C i 3-4 dagar.
- Skörda de återstående tidpunkterna enligt stegen i avsnitt 2.3. Samla upp alla lagrade cellpellets och fortsätt med stegen i avsnitt 3.
3. Flödescytometrianalys av cell-miRNA och EV-miRNA-signal i celler
- Förbereda celler för flödescytometrianalys. Filtrera cellsuspensionen från sektion 2 till 35 μm sillock som ingår i FACS-rören av rundbottnad polystyren för att möjliggöra avlägsnande av skräp och cellaggregat som kan störa fluoroforanalysen.
- Ställ in instrumentet enligt kalibreringsinstruktionerna. Slå på flödescytometern och låt den värmas upp i minst 30 minuter före användning. Fyll fluidiksystemet med mantelvätska och kontrollera och justera laserinriktningen.
- Kör kvalitetskontroll för att bekräfta instrumentfluidik. Ladda ultrarent filtrerat vatten i flödescytometern och kör med lämplig flödeshastighet för tillräcklig insamlingstid.
OBS: Lämplig flödeshastighet och insamlingstid beror på celltypen av intresse, provets komplexitet och önskad datakvalitet. - Öppna programvaran för analys av flödescytometridata och bekräfta detektorns och lasrarnas prestanda. Ställ in tröskel- och spänningsparametrar för detektion baserat på den cellinje du är intresserad av och valda fluoroforer.
OBS: För alla nedströmsexperiment användes Calu6-celler.- Ställ in tröskeln för att fånga signalen för Calu6-celler vid FSC 5000. Utför analysen för 1 x 104 celler för varje experimentell upprepning.
- För att ta hänsyn till den spektrala överlappningen mellan olika fluoroforer, använd icke-transfekterade celler och celler oberoende transfekterade med endast en av fluoroforerna för att ställa in kompensationskontroller.
- För detektion av miRNA-export, använd kandidat EV-miRNA (miR-451a och miR-150) konjugerade till Alexa-fluor 488 och en kontrollcell-miRNA (cel-miR-67) konjugerad till Cy3.
- För varje EV-miRNA, konjugera fluoroforen till 5′-änden av 5p-strängen. Före transfektion, glödga den fluoroforkonjugerade strängen till dess 100 % komplementära 3p-sträng.
- För expressionsanalys i transfekterade celler, analysera samples med hjälp av FSC-, SSC-, FITC- och PE-kanalerna inställda på 258, 192, 269 respektive 423 voltage enheter (figur 1A, B).
- För in det negativa kontrollprovet i flödescytometern. Samla in cellsignaler efter att ha definierat intensiteten för framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) i ett anpassat kalkylblad.
- I diagrammet väljer du FSC för X-axeln, SSC för Y-axeln och grind för den intressanta populationen genom att rita en polygon runt den (se figur 1B, nedre panelen).
- Skapa en ny tomt med hjälp av den inhägnade befolkningen.
- Ställ in X-axeln på fluorescenssignal 1 (FS1) för cell-miRNA-detektion och Y-axeln på fluorescenssignal 2 (FS2) för EV-miRNA-detektion. Ställ in kompensationsparametrar för de enskilda fluoroforerna med hjälp av celler som oberoende transfekterats med vart och ett av de fluorescerande märkta miRNA:erna. I den nya tomten, grind på befolkningen av intresse.
- För detektion av EV-miRNA, använd FITC-kanalen. För utvärdering av cell-miRNA-signal, använd PE-kanalen. I programvaran skapar du en grind runt cellerna som var positiva för både FITC och PE genom att rita en polygon runt dubbelfluorescenspopulationen när FITC valdes för X-axeln och PE valdes för Y-axeln.
- Registrera statistiken för den inhägnade populationen.
- Registrera procentandelen celler i den gated populationen som är positiva för både FITC och PE, samt för de som är positiva för antingen FITC eller PE.
- Upprepa stegen ovan för eventuella ytterligare exempel eller kontroller i experimentet.
4. Isolering av EV från transfekterade celler
- För celler som odlats i seruminnehållande medier ska EV tas bort från serumet för att förhindra korskontaminering.
- För att generera EV-utarmat serum, späd serumet till 50 % i cellodlingsmedia för att minska viskositeten och centrifugera det resulterande 50 %-serumet vid 110 000 x g i 18 timmar.
- Samla upp supernatanten (EV-fritt serum) försiktigt och filtrera den med en 0,2 μm filterenhet. Använd det resulterande 50 % EV-fria serumet för att generera kompletta medier, i det här fallet RPMI plus 10 % serum.
- För att samla in EVs, tillsätt EV-utarmade kompletta medier till cellerna och samla in EVs 48 timmar efter inkubation.
OBS: Protokollet som beskrivs nedan har modifierats från Kowal et al.14.
- Odla celler i 15 cm vävnadsodlingsskålar till 80 % sammanflöde. Transfektera cellerna separat med cell-miRNA och EV-miRNA i 10 ml Opti-MEM enligt transfektionsprotokollet i avsnitt 1 i protokollet.
OBS: Inte alla transfektionsprotokoll skalas upp linjärt. Det kan vara viktigt att först anpassa och utvärdera transfektionsförhållandena i 15 cm plattor. - Efter 7 timmar aspirerar du transfektionsmediet och ersätter det med det EV-utarmade mediet (15 ml). Odla celler i det EV-utarmade mediet i 48 timmar.
- Ta bort det konditionerade mediet från cellerna och fördela det i ett 50 ml centrifugrör inuti biosäkerhetsskåpet. Centrifugera det konditionerade mediet vid 2000 x g i 10 minuter vid 4 °C för att avlägsna döda celler och cellrester. Överför den resulterande supernatanten till ett nytt rör.
- Centrifugera supernatanten vid 10 000 x g i 40 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och filtrera den med en 0,2 μm filterenhet.
- Överför det filtrerade cellodlingsmediet till ett sterilt ultracentrifugrör inuti biosäkerhetsskåpet. Väg och balansera rören mot varandra. Centrifugera proverna vid 110 000 x g i 90 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i en lämplig volym av 1 x PBS för att tvätta och centrifugera vid 110 000 x g i 90 minuter 4 °C.
OBS: EV-pelleten återsuspenderades i 60 ml 1x PBS baserat på den maximala volymen som tillåts för rotorrören med fast vinkel som användes i denna studie. - Aspirera PBS och suspendera EV-pelleten i en lämplig volym (50-100 μL) färsk 1x PBS och virvel. Förvara elbilar vid -80 °C för senare användning.
5. Flödescytometrianalys av cell-miRNA och EV-miRNA-signal i EV
- För att bereda EV-suspension för flödescytometrianalys, späd EV i en lämplig volym ultrafiltrerad 1x PBS.
OBS: Belastningsvolymen för flödescytometrianalysen av EV bör bestämmas baserat på antalet EV i samples. Grovt räknat, om det finns ~30 000 partiklar i EV-suspensionen, bör den slutliga volymen vara ~500-600 μL i 1x PBS. Ett rent prov har cirka 35-50 partiklar/μL. - Använd nanoflödescytometern eller en alternativ utrustning som är tillräckligt kraftfull för att analysera partiklar i nanostorlek.
OBS: Här användes Attune NxT nanoflödescytometer. - Öppna programvaran och ställ in instrumentet enligt de rekommenderade kalibreringsinstruktionerna. Utför prestandatestet med hjälp av prestandananopärlor. Om nanopärlorna detekteras i standardstorleksintervallet är prestandan optimal. Bestäm lämplig flödeshastighet för detektion av EV-partiklar.
- Kör kvalitetskontroll med ultrarent filtrerat vatten för att bekräfta instrumentfluidik och prestanda för detektor och lasrar.
- Använd kalibreringspärlor som är lämpliga för experimentet, ställ in flödescytometern så att den exakt detekterar pärlor av olika storlek och mäter fluorescenssignaler.
OBS: För inställning av EV-analys med flödescytometri användes ApogeeMix-pärlor. Dessa pärlor innehåller en blandning av icke-fluorescerande kiseldioxidpärlor och fluorescerande polystyrenpärlor i storlekar från 80 nm till 1300 nm.- Ställ in parametrarna för att bedöma känsligheten och upplösningen hos olika populationer i strängblandningen enligt tillverkarens protokoll. Använd lämplig grind för att lösa upp pärlpopulationen från instrumentbruset.
- Virvla proverna noggrant för att jämnt fördela EV innan de laddas för analys.
- Öppna programvaran för analys av flödescytometridata och introducera ultrafiltrerad PBS. Ställ in grinden för EV-partiklar med hjälp av ultrafiltrerad PBS samtidigt som du ser till att grinden motsvarar lämplig storlek på partiklar baserat på pärlorna i steg 5.5.
- Ladda det negativa kontrollprovet för att analysera EV när de passerar genom flödescytometern. Fånga EV-signaler samtidigt som du plottar FSC på X-axeln och SSC på Y-axeln.
OBS: SSC-tröskeln för att fånga elbilar sattes till 300. Insamlingsvolymen fastställdes till 95 μL från totalt 145 μL uttagsvolym. Flödeshastigheten var inställd på 12,5 μL/min. Analysen utfördes med 1 x 106 EV-partiklar. Elbilspopulationen är heterogen och kommer att resultera i en del skräp som isoleras tillsammans med elbilar. Den övergripande partikeldetektionen i FSC vs. SSC-diagrammet belyser partiklar i ett varierat intervall, vilket förväntas vid användning av råa EV-preparat. - Skapa en ny tomt med hjälp av den inhägnade befolkningen.
- Den här gången väljer du fluorescenssignal 1 (FS1) för cell-miRNA-detektion på X-axeln och fluorescenssignal 2 (FS2) för EV-miRNA-detektion på Y-axeln.
- Ställ in kompensationsparametrar för fluoroforerna med hjälp av EV-proverna isolerade från celler transfekterade med ett enda miRNA. I den nya tomten, grind på EV-populationen av intresse.
- För expressionsanalys av fluoroforkonjugerade miRNA i EV isolerade från de transfekterade cellerna, analysera EV-proverna med hjälp av FSC-, SSC-, BL1- och YL1-kanalerna inställda på 370, 370, 400 respektive 400 spänningsenheter (Figur 2A, B).
- Registrera statistiken för den gated populationen och visualisera den med hjälp av histogram och punktdiagram.
- Upprepa stegen ovan för eventuella ytterligare exempel eller kontroller i experimentet.
6. Validering av frisättningen av miRNA i EV genom qRT-PCR
- Extrahera RNA från EV och moderceller med hjälp av miRVana RNA-isoleringskit enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Kvantifiering av RNA isolerat från EV är inte möjligt eftersom den totala mängden RNA som isolerats från EV vanligtvis inte överskrider tröskelvärdet för minimal kvantitet för en standard Nano-drop. Detta beror på utarmningen av ribosomalt RNA från EV-prover, som kan valideras med hjälp av Agilent Bioanalyzer. Således är integritetspoängen för EV-RNA-kvantifiering vanligtvis inte tillförlitlig och är inte den sanna representationen av EV-RNA-kvantiteten. För qRT-PCR-kvantifiering av EV-RNA och cell-RNA användes därför lika stora volymer RNA-isolat efter isolering från lika många celler. För normalisering av qRT-PCR användes miRNA som finns överallt i flera prover enligt tidigare inhämtade RNA-sekvenseringsdata. - Konvertera det extraherade RNA:t till cDNA med hjälp av ett omvänt transkriptaskit som är specifikt för små RNA.
- Ställ in qRT-PCR-reaktionen med hjälp av en cDNA-mall och miRNA-specifika primers enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: För valideringsexperiment användes miRCURY LNA qRT PCR-kit och motsvarande primers från tillverkaren för att utvärdera uttrycket av cell-miRNA och EV-miRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här använder vi flödescytometri som ett kraftfullt verktyg för att undersöka frisättningen av miRNA från cellerna till EV. Med hjälp av detta protokoll visade flödescytometrianalys av celler transfekterade med cell-miRNA och EV-miRNA en sekventiell minskning av fluorescenssignalen motsvarande EV-miRNA, medan signalen som motsvarade cell-miRNA behölls i cellerna. För att säkerställa att fluoroforkonjugering inte stör miRNA-frisättningen i EV konjugerades miR-451a till två separata fluoroforer (dvs. Alexa fluor 488 och Alexa fluor 750), och cellretention utvärderades. Resultaten indikerar minimal variabilitet mellan detektionen av de separata fluoroforsignalerna efter transfektionen, vilket validerar tillförlitligheten hos detta tillvägagångssätt (Figur 3A,B).
Eftersom olika orsaker kunde förklara förlusten av fluorescerande märkt miR-451a från cellerna, inklusive RNA-nedbrytning, var det viktigt att verifiera att cellulär förlust sammanföll med EV-överflöd. Med hjälp av flödescytometri observerades ackumulering av miR-451a konjugerad till Alexa fluor-488 i EV på ett tidsberoende sätt, vilket ger bevis på effektiv förpackning och eventuell frisättning av miRNA till EV. Fluorescenssignalen som motsvarar cellens miRNA, cel-miR-67, detekterades däremot inte i EV (figur 4). Dessa fynd med hjälp av detta nya tillvägagångssätt validerades med hjälp av qRT-PCR, som avslöjade ett signifikant högre EV/celluttrycksförhållande för miR-150, ett extra EV-miRNA, jämfört med cell-miRNA, cel-miR-67 (Figur 5).
Figur 1: Inställning av flödescytometerparametrar för detektion av signaler i celler. (A) För analys av cellfluorescens, med hjälp av programvaran, ställdes de markerade spänningarna in för de angivna parametrarna. Instrumentet var inställt för att registrera 10 000 celler per prov. Kontrollvyn bekräftar de parametrar som ställts in för identifiering och analys. (B) För analys av cellfluorescens sattes tröskeln för FSC-parametern till 5 000 under fliken cytometerinställningar i programvaran. Den övre högra panelen visar laserinställningarna för datainsamlingen. De nedre panelerna visar ett aktivt globalt kalkylblad under förloppet för detektering av celler. Proverna kördes med ett medelhögt flöde och fångades samtidigt som FSC-A och SSC-A etablerades som x-axel- respektive y-axelparametrar. Grinden sattes med hjälp av ett ritpolygonverktyg runt den intressanta populationen. Grinden kan vara annorlunda för en annan cellinje av intresse beroende på cellpopulationens mångfald. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Inställning av flödescytometriparametrar för signaldetektion i EV. (A) För detektering och nedströmsanalys av EV sattes insamlingsvolymen till 95 μL med flödeshastigheten inställd på 12,5 μL/min. Det valda tröskelvärdet för EV-detektering var 0,3 x1000 under fliken Instrumentinställningar i programvaran baserat på de kalibreringspärlor som användes. Spänningarna för FSC, SSC, BL1 och YL1 var 370, 370, 400 respektive 400. (B) Installation av grind för att fånga heterogen EV-population och särskilja EV från instrumentets bakgrundsbrus. Ett blankt PBS-prov (överst) användes som en negativ kontroll för att lösa upp bakgrundsbrus från EV-populationen. EV-urvalet (nederst) visar att populationen av intresse endast är 1,8 % av den totala populationen eftersom urvalet är heterogent med överlappande partiklar i storleksintervallet. Sträng grind valdes dock för att säkerställa upptäckten av den EV-population som är av intresse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Signaldetektion i celler genom flödescytometri. (A) Fluorescens motsvarande EV-miRNA och cell-miRNA detekterades i celler vid tidpunkter som indikerades mellan 7 timmar och 72 timmar efter transfektion. Signalen som motsvarar EV-miR-451a (Alexa fluor-488) minskade med tiden i jämförelse med signalen från det cellkvarhållna miRNA:t, cel-miR-67. (B) Fluorescens motsvarande EV-miR-451a märkt med Alexa fluor-750 visade samma trend som Alexa Fluro-488 märkt miR-451a, vilket indikerar att fluoroforen inte påverkar cellernas retention av miRNA. Sammantaget indikerar de representativa resultaten att det transfekterade miRNA:t beter sig på samma sätt som det endogena miRNA:t baserat på exporten av miRNA:t till EV. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Signaldetektion i EV genom flödescytometri. Fluorescens motsvarande EV-miR-451a och cell-cel-miR-67 detekterades i EV 24 timmar och 48 timmar efter transfektion. Signalen som motsvarar EV-miR-451a (Alexa fluor-488) fångades upp i EV 48 timmar efter transfektion. Däremot detekterades inte signalen för cel-miR-67 i elbilar. Ett blankt PBS-prov användes för att ställa in grinden för detta experiment, som visas i figur 2B. EV-prover isolerade från celler transfekterade med icke-fluorescerande förvrängt RNA användes som en negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Kvantifiering av EV-miRNA och cell-miRNA i celler och EV med hjälp av qRT-PCR. Calu6-celler transfekterades med 2 nM miR-150 och cel-miR-67 vardera. EV samlades in 48 timmar efter transfektion. EV-anrikning beräknades som förhållandet mellan EV-uttryck dividerat med cellulärt uttryck i transfekterade Calu6-celler för miR-150 och cel-miR-67. Baserat på RNA-sekvenseringsresultat som jämförde uttrycket av miRNA i Calu6-celler och deras motsvarande EV, användes miR-30c som en endogen kontroll och en normaliserare för beräkning av veckförändring. De data som presenteras kommer från ett biologiskt replikat, där varje datapunkt uppvisar tre qRT-PCR-reaktioner. Data uttrycks som medelvärde ± SD och p-värdena beräknades med hjälp av ett oparat t-test med Welchs korrigering (**p < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Styrkor | Svagheter |
| Möjliggör samtidig bedömning av selektiv export av flera miRNA i celler och respektive EV | Kräva ytterligare förfaranden för att skilja mellan aktiv och passiv export |
| Bedömning av heterogen råpopulation är möjlig och kräver inte föregående separation av EV-populationer. Kan användas för att analysera olika typer av elbilar OBS: Tröskeln för detektering av olika typer av partiklar kommer att variera |
Låg känslighet gör det inte möjligt att detektera begränsade koncentrationer av miRNA i celler eller EV. Detta kan övervinnas genom att införliva nedströms qRT-PCR-analys efter RNA-isolering från EV |
| Kräver kort tid för installation och analys jämfört med standardmetoder som används för miRNA-kvantifiering | Brist på standardiseringsprotokoll för olika typer av utrustning, cellinjer och olika fluoroforer. |
Tabell 1: Protokollets viktigaste styrkor och svagheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nyetablerade protokollet gör det möjligt att fånga kinetiken för miRNA-frisättning i EV efter transfektion av EV-miRNA. Tillvägagångssättet möjliggör samtidig analys av flera EV-miRNA och cell-miRNA, beroende på cytometerns kapacitet. Dessutom, även om flödescytometrianalys kan ge värdefulla insikter i EV miRNA-biologi, är det inte utan begränsningar. Även om vissa av begränsningarna kan övervinnas när de används tillsammans med andra tekniker för en mer omfattande förståelse.
Ett framväxande intresseområde inom EV-biologi är att förstå den selektiva exporten av miRNA till EV15,16. Även om detta protokoll erbjuder ett kraftfullt verktyg för att studera selektiv export av miRNA, är en av de kritiska utmaningarna att skilja mellan aktiv och passiv export. Försiktighet måste iakttas eftersom överuttryck av ett miRNA vid en tillräckligt hög koncentration kan förändra exporten av miRNA, vilket kan leda till olämplig passiv laddning. Därför är experiment för att bestämma de optimala transfektionskoncentrationerna av miRNA avgörande när man studerar selektiv export.
Dessutom gör protokollet, i kombination med kompletterande tekniker som nanopartikelspårningsanalys (NTA), det möjligt för forskaren att bedöma EV-partikelantalet samtidigt som miRNA-frisättningen utvärderas och har potential att göra det möjligt att skilja mellan förändringar i EV-biogenesvägar och miRNA-exportmekanismer. Detta är särskilt viktigt på grund av de överlappande medlarna i dessa processer17. Med tanke på att miRNA kan påverka olika fenotyper, inklusive vissa som är involverade i EV-biogenes, skulle det vara klokt att utvärdera partikelantalet efter transfektion av miRNA18. För att övervinna detta hinder skulle ett annat alternativ vara att införliva ett EV-miRNA som förblir oförändrat under de experimentella förhållandena, och därigenom utesluta faktorer som är involverade i EV-biogenes samtidigt som man belyser de vägar som är involverade i EV-miRNA-export.
Flera studier har kvantifierat miRNA med hjälp av qRT-PCR, en standardmetod för endogen miRNA-kvantifiering 10,11,16. Den saknar dock förmågan att dynamiskt fånga frisättningen av miRNA till EV. När man jämför flödescytometri med qRT-PCR skiljer de sig mycket beroende på analysens känslighet och design. Även om qRT-PCR är en mycket känslig teknik och teoretiskt kapabel att kvantifiera minimala antal miRNA-kopior, kräver det minst en 2-faldig (100 %) skillnad i antalet kopior av miRNA av intresse för att skilja två prover åt. Flödescytometri, å andra sidan, fångar signalbaserade skillnader baserat på överflödet av fluorescerande märkt miRNA och kan differentiera små procentuella förändringar i signaler. Icke desto mindre begränsar dess låga känslighet detektionen av miRNA med begränsat antal kopior. De två teknikerna kompletterar varandra synergistiskt när de används tillsammans, vilket anges i protokollet.
Sammanfattningsvis erbjuder detta protokoll ett värdefullt verktyg för att undersöka selektiv miRNA-exportdynamik. Trots de ovan nämnda utmaningarna ligger styrkan i detta protokoll i dess förmåga att analysera flera miRNA samtidigt, vilket bidrar till en bättre förståelse av miRNA-biologi, deras export och deras roll i EV-biologi. De viktigaste styrkorna och svagheterna i protokollet som måste beaktas anges i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar för stöd och råd från Dr. Jill Hutchcroft, chef för Flow Cytometry Core Facility vid Purdue University. Detta arbete stöddes av R01CA226259 och R01CA205420 till A.L.K., American Lung Association Innovation Award (ANALA2023) IA-1059916 till A.L.K., ett Purdue Shared resource facility-bidrag P30CA023168 och ett flaggskeppsstipendium från Fulbright Doctoral Scholarship som delas ut av Department of the State, USA till H.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
