Summary
Her beskriver vi en ligetil protokol, der muliggør in vitro-vurdering af overflod af fluorescerende mærkede mikroRNA'er for at studere dynamikken i mikroRNA-emballering og eksport til ekstracellulære vesikler (EV'er).
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV'er) er vigtige mediatorer af cellulær kommunikation, der udskilles af en række forskellige celler. Disse EV'er transporterer bioaktive molekyler, herunder proteiner, lipider og nukleinsyrer (DNA, mRNA'er, mikroRNA'er og andre ikke-kodende RNA'er), fra en celle til en anden, hvilket fører til fænotypiske konsekvenser i modtagercellerne. Af alle de forskellige EV-laster har mikroRNA'er (miRNA'er) fået stor opmærksomhed for deres rolle i udformningen af mikromiljøet og i uddannelsen af modtagerceller på grund af deres klare dysregulering og overflod i EV'er. Yderligere data indikerer, at mange miRNA'er aktivt indlæses i elbiler. På trods af dette klare bevis er forskning i eksportdynamikken og mekanismerne for miRNA-sortering begrænset. Her leverer vi en protokol ved hjælp af flowcytometrianalyse af EV-miRNA, der kan bruges til at forstå dynamikken i EV-miRNA-belastning og identificere de maskiner, der er involveret i miRNA-eksport. I denne protokol konjugeres miRNA'er, der er forudbestemt til at blive beriget i EV'er og udtømt fra donorceller, til en fluorofor og transfekteres ind i donorcellerne. De fluorescerende mærkede miRNA'er verificeres derefter for indlæsning i EV'er og udtømning fra celler ved hjælp af qRT-PCR. Som både en transfektionskontrol og et værktøj til gating den transfekterede population af celler er et fluorescerende mærket cellulært RNA (celle-tilbageholdt og EV-udtømt) inkluderet. Celler transfekteret med både EV-miRNA og celle-tilbageholdt-miRNA evalueres for fluorescerende signaler i løbet af 72 timer. Fluorescenssignalintensiteten, der er specifik for EV-miRNA'erne, falder hurtigt sammenlignet med det celletilbageholdte miRNA. Ved hjælp af denne enkle protokol kunne man nu vurdere dynamikken i miRNA-belastning og identificere forskellige faktorer, der er ansvarlige for at indlæse miRNA'er i EV'er.
Introduction
MicroRNA'er (miRNA'er) er en af de bedst karakteriserede undergrupper af små ikke-kodende RNA'er, som er kendt for deres kritiske rolle i posttranskriptionel genregulering. Ekspressionen og biogenesen af de fleste miRNA'er følger en koordineret række begivenheder, der begynder med transkription af de primære miRNA'er (pri-miRNA'er) i kernen. Efter nuklear behandling af mikroprocessorkomplekset i precursor-miRNA'er (pre-miRNA'er) eksporteres pre-miRNA'erne til cytoplasmaet, hvor de gennemgår yderligere behandling af RNase III-endonukleasen, dicer i 21-23 nukleotidmodne miRNA-duplekser1. En af strengene i det forarbejdede modne miRNA binder til målbudbringer-RNA'er (mRNA'er), hvilket fører til nedbrydning eller translationel undertrykkelse af målene2. Baseret på miRNA'ernes pleiotropiske rolle i samtidig regulering af flere forskellige mål-mRNA'er er det ikke overraskende, at miRNA-ekspression er stramt reguleret3. Faktisk bidrager upassende udtryk til forskellige sygdomstilstande, især i kræft. Den afvigende ekspression af miRNA'er repræsenterer ikke kun en sygdomsspecifik signatur, men har også vist sig som et mål for prognostisk og terapeutisk potentiale 4,5,6. Ud over deres intracellulære roller har miRNA'er også ikke-autonome roller. For eksempel kan miRNA'er selektivt pakkes i EV'er af donorceller og eksporteres til modtagersteder, hvor de fremkalder forskellige fænotypiske reaktioner i normal- og sygdomsfysiologi 7,8,9.
På trods af klare beviser for, at EV-associerede miRNA'er er funktionelle biomolekyler, er det ikke helt forstået, hvordan specifikke undergrupper af miRNA'er er dysregulerede i sygdomstilstande som kræft, og hvordan cellulære maskiner vælger og sorterer miRNA'er i Evs10,11. I betragtning af EV-miRNA'ernes potentielle rolle i modulering af mikromiljøet er det afgørende at identificere de mekanismer, der er involveret i eksporten af udvalgte miRNA'er for fuldt ud at belyse EV'ernes rolle i intercellulær kommunikation og sygdomspatogenese. Forståelse af processen med miRNA-frigivelse i EV'er vil ikke kun fremhæve vigtige mediatorer af miRNA-eksport, men kan også give indsigt i potentielle behandlinger. For at opnå dette niveau af viden skal værktøjerne tilpasses til trofast at løse disse nye eksperimentelle spørgsmål. Faktisk vokser undersøgelser, der evaluerer elbiler, eksponentielt på grund af introduktionen af nye teknikker og kontroller12,13. I forhold til evaluering af overflod af eksporterede miRNA'er til EV'er har næste generations sekventering og kvantitativ revers transkriptionspolymerasekædereaktion (qRT-PCR) været de nuværende standardværktøjer. Mens disse værktøjer er nyttige til evaluering af overflod af miRNA'er i elbiler, er der begrænsninger for deres følsomhed og specificitet, og det er ikke tilstrækkeligt at bruge disse statiske tilgange til evaluering af dynamik. At analysere dynamikken i miRNA-eksport til elbiler kræver en kombination af specialiserede værktøjer. Her præsenterer vi en omfattende protokol ved hjælp af fluorescerende konjugerede miRNA'er til at analysere dynamikken i miRNA-frigivelse fra donorceller og inkorporering i EV'er. Vi diskuterer også fordele og begrænsninger ved metoden og giver anbefalinger til optimal brug. Den alsidige metode, der præsenteres i denne artikel, vil være nyttig for forskere, der er interesserede i at studere miRNA-frigivelse i elbiler og deres potentielle roller i cellulær kommunikation og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Som en forudsætning for at anvende denne teknik kræves identifikation og validering af selektivt eksporterede miRNA'er. Da forskellige cellelinjer varierer afhængigt af miRNA-lasten sorteret i deres EV'er, anbefales det, at cellelinjen af interesse og tilhørende EV'er evalueres for miRNA'er før brug. Derudover er lipofektaminbaseret transfektion et af de kritiske trin i protokollen; Det anbefales at forudbestemme transfektionseffektiviteten inden forsøgsopstillingen.
1. Voksende celler i kultur og transfektering af celler med fluoroforkonjugeret EV-miRNA
- Plade 200.000 til 400.000 celler i tredobbelte brønde i en 6-brønds plade i et passende dyrkningsmedium. Hvirvl forsigtigt pladen rundt for at sikre ensartet cellefordeling. Inkuber cellerne, indtil de når 70% -80% sammenløb, ca. 24-48 timer.
- For hvert hul, der skal transfekteres, fortyndes transfektionsreagenset i 100 μL serumfrit medium i et mikrocentrifugerør i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Den optimale koncentration af lipid bør bestemmes for cellelinjen af interesse før denne opsætning. - For hvert hul, der skal transfekteres, fortyndes det fluoroforkonjugerede EV-miRNA (2nM) og celle-miRNA (2nM) separat i et mikrocentrifugerør i 100 μL serumfrie medier.
BEMÆRK: Det samlede volumen skal beregnes for det samlede antal transfekterede brønde. I denne protokol blev fluorescensen evalueret til 7 tidspunkter; derfor var det samlede volumen 700 μL for trin 1.2 og 700 μL for trin 1.3. For trygt at fange den positive fluorescerende population af celler, skal brugeren desuden transfektere celler med et ikke-fluorescerende krypteret miRNA og oprette en port, der udelukker disse celler. - Den fortyndede RNA-blanding (fra trin 1.3) til det fortyndede transfektionsreagens (fra trin 1.2) tilsættes og blandes forsigtigt ved at vende røret 3-4 gange. Lad den kombinerede lipid-RNA-blanding inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Fjern de almindelige kulturmedier fra cellerne, og tilsæt 800 μL serumfrie medier til hvert hul. Der tilsættes forsigtigt 200 μL lipid-RNA-blandingen (fra trin 1.4) dråbevis til cellerne.
BEMÆRK: Opti-MEM-medier blev brugt til transfektering af den relevante cellelinje (Calu6-celler). Prøv at tilføje lipid-RNA-blandingen direkte til kulturmediet, undgå at tilsætte blandingen til siderne af pladen.
2. Høstning af transfekterede celler på forskellige tidspunkter til analyse af fluorescens
- De transfekterede celler inkuberes ved 37 °C i 7 timer.
BEMÆRK: For at validere konsistent transfektion af begge miRNA'er (EV-miRNA og celle-miRNA) opsamles celler fra en brønd 3 timer efter transfektion for at analysere fluorescensen ved hjælp af flowcytometeret. - Efter 7 timers inkubationsperioden fjernes transfektionskomplekset fra brøndene og erstattes med komplette medier.
- For at evaluere 7-timers tidspunktet skal du høste cellerne og vaske cellerne tre gange med 1x PBS.
- Hvis du arbejder med klæbende celler, tilsættes 200 μL trypsin til en brønd og venter på, at cellerne løsner sig fra pladen. Overfør de løsrevne celler til et mikrocentrifugerør og pellet ved centrifugering ved 200xg i 5 min.
- Supernatanten kasseres forsigtigt for at undgå at forstyrre cellepelletsen. Ved den første PBS-vask resuspenderes pelleten i ~500 μL 1x PBS, og pelleteringen gentages ved hjælp af centrifugeringstrinnene ovenfor. Gentag PBS-vasken yderligere to gange.
- Resuspender cellepellet i 200 μL 2% paraformaldehyd (PFA) opløsning og evaluer fluorescens.
BEMÆRK: Efter tilsætning af 2% PFA kan cellepillen opbevares ved 4 °C i 3-4 dage.
- Høst de resterende tidspunkter ved at følge trinnene i afsnit 2.3. Saml alle de lagrede cellepiller, og fortsæt med trinene i afsnit 3.
3. Flowcytometrianalyse af celle-miRNA og EV-miRNA-signal i celler
- Forbered celler til flowcytometrianalyse. Filtrer cellesuspensionen fra sektion 2 til 35 μm sihætter, der er en del af FACS-rørene af rundbundet polystyren for at muliggøre fjernelse af snavs og celleaggregater, der kan interferere med fluoroforanalyse.
- Opsæt instrumentet ved at følge kalibreringsinstruktionerne. Tænd flowcytometeret, og lad det varme op i mindst 30 minutter før brug. Prim fluidiksystemet med kappevæske, og kontroller og juster laserjusteringen.
- Kør kvalitetskontrol for at bekræfte instrumentfluidik. Fyld ultrarent filtreret vand i flowcytometeret og kør med en passende strømningshastighed for tilstrækkelig anskaffelsestid.
BEMÆRK: Den passende flowhastighed og anskaffelsestid afhænger af celletypen af interesse, prøvekompleksitet og ønsket datakvalitet. - Åbn flowcytometridataanalysesoftwaren, og bekræft detektorens og lasernes ydeevne. Indstil tærskel- og spændingsparametre til detektion baseret på den valgte cellelinje og fluoroforer.
BEMÆRK: Til alle downstream-eksperimenter blev Calu6-celler brugt.- Indstil tærsklen for optagelse af signalet for Calu6-celler ved FSC 5000. Udfør analysen for 1 x 104 celler for hver eksperimentel gentagelse.
- For at tage højde for spektraloverlapningen mellem forskellige fluoroforer skal du bruge ikke-transfekterede celler og celler, der uafhængigt transfekteres med kun en af fluoroforerne til at oprette kompensationskontroller.
- Til påvisning af miRNA-eksport skal du bruge kandidat EV-miRNA'er (miR-451a og miR-150) konjugeret til Alexa-fluor 488 og et kontrolcelle-miRNA (cel-miR-67) konjugeret til Cy3.
- For hvert EV-miRNA konjugeres fluoroforen til 5′-enden af 5p-strengen. Før transfektion anneal den fluoroforkonjugerede streng til dens 100% komplementære 3p-streng.
- Til ekspressionsanalyse i transfekterede celler analyseres prøverne ved hjælp af FSC-, SSC-, FITC- og PE-kanalerne, der er indstillet til henholdsvis 258, 192, 269 og 423 spændingsenheder (figur 1A, B).
- Den negative kontrolprøve indføres i flowcytometeret. Hent cellesignaler efter definition af intensiteter for fremadrettet spredning (FSC) og sidespredning (SSC) i et brugerdefineret regneark.
- I plottet skal du vælge FSC for X-aksen, SSC for Y-aksen og porten for populationen af interesse ved at tegne en polygon omkring den (se figur 1B, nederste panel).
- Opret et nyt plot ved hjælp af den lukkede befolkning.
- Indstil X-aksen til fluorescenssignal 1 (FS1) til celle-miRNA-detektion og Y-aksen til fluorescenssignal 2 (FS2) til EV-miRNA-detektion. Opsæt kompensationsparametre for de enkelte fluoroforer ved hjælp af celler, der uafhængigt transfekteres med hver af de fluorescerende mærkede miRNA'er. I det nye plot, port på befolkningen af interesse.
- Til påvisning af EV-miRNA skal du bruge FITC-kanalen. Til evaluering af celle-miRNA-signal skal du bruge PE-kanalen. I softwaren skal du oprette en port omkring de celler, der var positive for både FITC og PE ved at tegne en polygon omkring den dobbelte fluorescenspopulation, når FITC blev valgt til X-aksen og PE blev valgt til Y-aksen.
- Registrer statistikken for den lukkede befolkning.
- Registrer procentdelen af celler i den lukkede befolkning, der er positive for både FITC og PE, såvel som for dem, der er positive for enten FITC eller PE.
- Gentag ovenstående trin for eventuelle yderligere prøver eller kontroller i eksperimentet.
4. Isolering af elbiler fra transfekterede celler
- For celler, der dyrkes i serumholdige medier, nedbrydes EV'er fra serumet for at forhindre krydskontaminering.
- For at generere EV-forarmet serum fortyndes serumet til 50% i cellekulturmedier for at reducere viskositeten og centrifugere det resulterende 50% serum ved 110.000 x g i 18 timer.
- Supernatanten (EV-frit serum) opsamles forsigtigt, og filtreres med et 0,2 μm filter. Brug det resulterende 50% EV-fri serum til at generere komplette medier, i dette tilfælde RPMI plus 10% serum.
- For at indsamle elbiler skal du tilføje det EV-udtømte komplette medie til cellerne og indsamle EV'erne 48 timer efter inkubation.
BEMÆRK: Protokollen beskrevet nedenfor er blevet ændret fra Kowal et al.14.
- Voks celler i 15 cm vævskultur retter til 80% sammenløb. Transfekter cellerne separat med cell-miRNA og EV-miRNA i 10 ml Opti-MEM efter transfektionsprotokollen i afsnit 1 i protokollen.
BEMÆRK: Ikke alle transfektionsprotokoller skaleres lineært op. Det kan være vigtigt først at tilpasse og evaluere transfektionsbetingelserne i 15 cm plader. - Efter 7 timer aspireres transfektionsmediet, og det udskiftes med det EV-udtømte medie (15 ml). Voks celler i det EV-udtømte medie i 48 timer.
- Fjern det konditionerede medie fra cellerne, og fordel det i et 50 ml centrifugerør inde i biosikkerhedsskabet. Det konditionerede medie centrifugeres ved 2000 x g i 10 minutter ved 4 °C for at fjerne døde celler og cellerester. Den resulterende supernatant overføres til et frisk glas.
- Supernatanten centrifugeres ved 10.000 x g i 40 minutter ved 4 °C. Supernatanten fjernes og filtreres med et 0,2 μm filter.
- Overfør det filtrerede cellekulturmedie til et sterilt ultracentrifugerør inde i biosikkerhedsskabet. Vej og afbalancer rørene mod hinanden. Centrifuger prøverne ved 110.000 x g i 90 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres.
- Pellet resuspenderes i et passende volumen på 1x PBS for at vaske og centrifugere ved 110.000 x g i 90 min 4 °C.
BEMÆRK: EV-pelleten blev resuspenderet i 60 ml 1x PBS baseret på det maksimalt tilladte volumen for de fastvinklede rotorrør, der blev brugt i denne undersøgelse. - Opsug PBS og opslæm EV-pelleten i et passende volumen (50-100 μL) frisk 1x PBS og hvirvelstrøm. Opbevar elbiler ved -80 °C til senere brug.
5. Flowcytometrianalyse af celle-miRNA og EV-miRNA-signal i EV'er
- For at forberede EV-suspension til flowcytometrianalyse fortyndes EV'er i et passende volumen ultrafiltreret 1x PBS.
BEMÆRK: Belastningsvolumenet til flowcytometrianalyse af EV'er bør bestemmes ud fra antallet af EV'er i prøver. Groft sagt, hvis der er ~ 30,000 partikler i EV-suspensionen, skal det endelige volumen være ~ 500-600 μL i 1x PBS. En ren prøve har omkring 35-50 partikler/μL. - Brug nanoflowcytometeret eller et alternativt udstyr, der er kraftigt nok til at analysere partikler i nanostørrelse.
BEMÆRK: Her blev Attune NxT nano-flow cytometer brugt. - Åbn softwaren, og indstil instrumentet ved at følge de anbefalede kalibreringsinstruktioner. Udfør præstationstesten ved hjælp af ydeevne nanoperler. Hvis nanoperlerne detekteres i standardstørrelsesområdet, er ydeevnen optimal. Bestem den passende strømningshastighed til påvisning af EV-partikler.
- Kør kvalitetskontrol ved hjælp af ultrarent filtreret vand for at bekræfte instrumentfluidik og ydeevne af detektor og lasere.
- Brug kalibreringsperler, der er egnede til eksperimentet, til at indstille flowcytometeret til nøjagtigt at detektere perler i forskellige størrelser og måle fluorescenssignaler.
BEMÆRK: Til opsætning af EV-analyse ved flowcytometri blev ApogeeMix-perler brugt. Disse perler indeholder en blanding af ikke-fluorescerende silicaperler og fluorescerende polystyrenperler, der spænder i størrelser fra 80 nm til 1300 nm.- Indstil parametrene til at vurdere følsomheden og opløsningen af forskellige populationer i perleblandingen i henhold til producentens protokol. Brug den passende gating til at løse perlepopulationen fra instrumentstøjen.
- Vortex prøverne grundigt for at fordele elbilerne jævnt, før de læsses til analyse.
- Åbn flowcytometridataanalysesoftwaren, og introducer ultrafiltreret PBS. Indstil gatingen til EV-partikler ved hjælp af ultrafiltreret PBS, samtidig med at det sikres, at gatingen svarer til den passende størrelse partikler baseret på perlerne i trin 5.5.
- Indlæs den negative kontrolprøve for at analysere elbiler, når de passerer gennem flowcytometeret. Optag EV-signaler, mens du plotter FSC på X-aksen og SSC på Y-aksen.
BEMÆRK: SSC-tærsklen for opsamling af elbiler blev sat til 300. Anskaffelsesvolumen blev fastsat til 95 μL fra i alt 145 μL trukket volumen. Strømningshastigheden blev indstillet til 12,5 μL/min. Analysen blev udført med 1 x 106 EV-partikler. EV-populationen er heterogen og vil resultere i, at noget affald isoleres sammen med elbiler. Samlet partikeldetektion i FSC vs. SSC-plottet fremhæver partikler i et forskelligt område, hvilket forventes ved anvendelse af rå EV-præparater. - Opret et nyt plot ved hjælp af den lukkede befolkning.
- Denne gang skal du vælge fluorescenssignal 1 (FS1) til celle-miRNA-detektion på X-aksen og fluorescenssignal 2 (FS2) til EV-miRNA-detektion på Y-aksen.
- Opsæt kompensationsparametre for fluoroforerne ved hjælp af EV-prøverne isoleret fra celler transfekteret med et enkelt miRNA. I det nye plot, gate på EV befolkning af interesse.
- Til ekspressionsanalyse af fluoroforkonjugerede miRNA'er i EV'er isoleret fra de transfekterede celler analyseres EV-prøverne ved hjælp af FSC-, SSC-, BL1- og YL1-kanalerne indstillet til henholdsvis 370, 370, 400 og 400 spændingsenheder (figur 2A, B).
- Optag statistikken for den lukkede befolkning og visualiser dem ved hjælp af histogrammer og prikplot.
- Gentag ovenstående trin for eventuelle yderligere prøver eller kontroller i eksperimentet.
6. Validering af frigivelsen af miRNA'er i elbiler gennem qRT-PCR
- Uddrag RNA fra elbiler og moderceller ved hjælp af miRVana RNA-isolationssæt efter producentens anvisninger.
BEMÆRK: Kvantificering af RNA isoleret fra EV'er er ikke mulig, fordi den samlede mængde RNA isoleret fra EV'er typisk ikke krydser minimumsmængdetærsklen for et standard Nano-drop. Dette skyldes udtømningen af ribosomalt RNA fra EV-prøver, som kan valideres ved hjælp af Agilent Bioanalyzer. Således er integritetsscoren for EV-RNA-kvantificering normalt ikke pålidelig og er ikke den sande repræsentation af EV-RNA-mængde. Til qRT-PCR-kvantificering af EV-RNA og celle-RNA blev der derfor anvendt lige store mængder RNA-isolater efter isolering fra et tilsvarende antal celler. Til normalisering af qRT-PCR blev miRNA'er, der var allestedsnærværende til stede på tværs af flere prøver som bestemt ud fra tidligere erhvervede RNA-sekventeringsdata, anvendt. - Konverter det ekstraherede RNA til cDNA ved hjælp af et revers transkriptasesæt, der er specifikt for små RNA'er.
- Opsæt qRT-PCR-reaktionen ved hjælp af en cDNA-skabelon og miRNA-specifikke primere efter producentens anvisninger.
BEMÆRK: Til valideringseksperimenter blev miRCURY LNA qRT PCR-kit og tilsvarende primere fra producenten brugt til at evaluere ekspressionen af celle-miRNA og EV-miRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her bruger vi flowcytometri som et kraftfuldt værktøj til at undersøge frigivelsen af miRNA fra cellerne til elbiler. Ved hjælp af denne protokol afslørede flowcytometrianalyse af celler transfekteret med celle-miRNA og EV-miRNA et sekventielt fald i fluorescenssignal svarende til EV-miRNA, mens signalet svarende til celle-miRNA blev bevaret i cellerne. For at sikre, at fluoroforkonjugering ikke forstyrrer miRNA-frigivelse i EV'er, blev miR-451a konjugeret til to separate fluoroforer (dvs. Alexa fluor 488 og Alexa fluor 750), og celleretention blev evalueret. Resultaterne indikerer minimal variabilitet mellem detektionen af de separate fluoroforsignaler efter transfektion, hvilket validerer pålideligheden af denne fremgangsmåde (figur 3A, B).
Fordi forskellige årsager kunne forklare tabet af fluorescerende mærket miR-451a fra cellerne, herunder RNA-nedbrydning, var det afgørende at verificere, at cellulært tab faldt sammen med EV-overflod. Ved hjælp af flowcytometri blev akkumulering af miR-451a konjugeret med Alexa fluor-488 i EV'er observeret på en tidsafhængig måde, hvilket gav bevis for effektiv emballering og eventuel frigivelse af miRNA i EV'er. I modsætning hertil blev fluorescenssignalet svarende til cellens tilbageholdte miRNA, cel-miR-67 ikke detekteret i EV'erne (figur 4). Disse fund ved hjælp af denne nye tilgang blev valideret ved hjælp af qRT-PCR, som afslørede et signifikant højere EV / celleekspressionsforhold for miR-150, et yderligere EV-miRNA, sammenlignet med celle-miRNA, cel-miR-67 (figur 5).
Figur 1: Opsætning af flowcytometerparametre til detektion af signaler i celler. (A) Til analyse af cellefluorescens ved hjælp af softwaren blev de fremhævede spændinger indstillet til de angivne parametre. Instrumentet blev sat op til at optage 10.000 celler pr. prøve. Infovisningen bekræfter de parametre, der er konfigureret til registrering og analyse. (B) Til analyse af cellefluorescens blev tærsklen for FSC-parameteren sat til 5.000 under fanen cytometerindstillinger i softwaren. Panelet øverst til højre viser laserindstillingerne for datafangsten. De nederste paneler viser et aktivt globalt regneark under forløbet af detekteringen af celler. Prøverne blev kørt med et medium flow og fanget, mens FSC-A og SSC-A blev etableret som henholdsvis x-akse- og y-akseparametre. Gating blev sat ved hjælp af et tegningspolygonværktøj omkring befolkningen af interesse. Gating kan være anderledes for en anden cellelinje af interesse afhængigt af mangfoldigheden af cellepopulationen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Opsætning af flowcytometriparametre til signaldetektion i EV'er. (A) Til detektion og downstream-analyse af EV'er blev anskaffelsesvolumen sat til 95 μL med strømningshastigheden indstillet til 12,5 μL/min. Den valgte tærskel for EV-detektion var 0,3 x1000 under fanen Instrumentindstillinger i softwaren baseret på de anvendte kalibreringsperler. Spændinger for FSC, SSC, BL1 og YL1 var henholdsvis 370, 370, 400 og 400. (B) Opsætning af gating til at fange heterogen EV-population og skelne EV'er fra instrumentets baggrundsstøj. En tom PBS-prøve (øverst) blev brugt som negativ kontrol til at løse baggrundsstøj fra EV-populationen. EV-prøve (nederst) viser, at populationen af interesse kun er 1,8% af den samlede befolkning, fordi prøven er heterogen med overlappende partikler i størrelsesområdet. Imidlertid blev streng gating valgt for at sikre påvisning af EV-populationen af interesse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Signaldetektion i celler gennem flowcytometri. (A) Fluorescens svarende til EV-miRNA og celle-miRNA blev påvist i celler på tidspunkter angivet mellem 7 timer og 72 timer efter transfektion. Signalet svarende til EV-miR-451a (Alexa fluor-488) faldt med tiden sammenlignet med signalet fra det celleholdte-miRNA, cel-miR-67. (B) Fluorescens svarende til EV-miR-451a mærket med Alexa fluor-750 viste den samme tendens som Alexa Fluro-488 mærket miR-451a, hvilket indikerer, at fluoroforen ikke påvirker cellernes tilbageholdelse af miRNA'er. Samlet set indikerer de repræsentative resultater, at det transfekterede miRNA opfører sig på samme måde som det endogene miRNA baseret på eksporten af miRNA'et til EV'er. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Signaldetektion i elbiler gennem flowcytometri. Fluorescens svarende til EV-miR-451a og cell-cel-miR-67 blev påvist i EV'er 24 timer og 48 timer efter transfektion. Signalet svarende til EV-miR-451a (Alexa fluor-488) blev fanget i EV'er 48 timer efter transfektion. I modsætning hertil blev signalet for cel-miR-67 ikke detekteret i elbiler. En tom PBS-prøve blev brugt til at opsætte gatingen til dette eksperiment, som vist i figur 2B. EV-prøver isoleret fra celler transfekteret med ikke-fluorescerende krypteret RNA blev anvendt som en negativ kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kvantificering af EV-miRNA og celle-miRNA i celler og EV'er ved hjælp af qRT-PCR. Calu6-celler blev transfekteret med 2 nM miR-150 og cel-miR-67 hver. Elbiler blev indsamlet 48 timer efter transfektion. EV-berigelse blev beregnet som forholdet mellem EV-ekspression divideret med cellulær ekspression i transfekterede Calu6-celler for miR-150 og cel-miR-67. Baseret på RNA-sekventeringsresultater, der sammenlignede ekspressionen af miRNA'er i Calu6-celler og deres tilsvarende EV'er, blev miR-30c anvendt som en endogen kontrol og en normalisator til beregning af foldændring. De præsenterede data er fra en biologisk replikat, hvor hvert datapunkt præsenterer tredobbelte qRT-PCR-reaktioner. Data udtrykkes som gennemsnit ± SD, og p-værdier blev beregnet ved hjælp af en uparret t-test med Welchs korrektion (**p < 0,01). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Styrker | Svagheder |
| Giver mulighed for samtidig vurdering af selektiv eksport af flere miRNA'er i celler og respektive EV'er | Kræve yderligere procedurer for at skelne mellem aktiv og passiv eksport |
| Vurdering af rå heterogen population er mulig og kræver ikke forudgående adskillelse af EV-populationer. Kan bruges til at analysere forskellige typer elbiler BEMÆRK: Tærskelværdien for detektion af forskellige typer partikler varierer |
Lav følsomhed tillader ikke påvisning af begrænsede koncentrationer af miRNA'er i celler eller EV'er. Dette kan overvindes ved at inkorporere nedstrøms qRT-PCR-analyse efter RNA-isolering fra elbiler |
| Kræver kort tid til opsætning og analyse sammenlignet med standardmetoder, der anvendes til miRNA-kvantificering | Mangel på standardiseringsprotokoller for forskellige typer udstyr, cellelinjer og forskellige fluoroforer. |
Tabel 1: Protokollens vigtigste styrker og svagheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nyetablerede protokol gør det muligt at fange kinetik af miRNA-frigivelse i EV'er efter transfektion af EV-miRNA'er. Fremgangsmåden tillader samtidig analyse af flere EV-miRNA'er og celle-miRNA'er, underlagt cytometerets muligheder. Desuden, mens flowcytometrianalyse kan give værdifuld indsigt i EV miRNA-biologi, er det ikke uden begrænsninger. Omend nogle af begrænsningerne kan overvindes, når de bruges sammen med andre teknikker til en mere omfattende forståelse.
Et voksende interesseområde inden for EV-biologi er at forstå den selektive eksport af miRNA'er til EV'er15,16. Mens denne protokol tilbyder et kraftfuldt værktøj til at studere selektiv eksport af miRNA, er en af de kritiske udfordringer at skelne mellem aktiv og passiv eksport. Der skal udvises forsigtighed, da overekspression af et miRNA ved en høj nok koncentration kan ændre eksporten af miRNA, hvilket potentielt kan resultere i uhensigtsmæssig passiv belastning. Derfor er eksperimentering for at bestemme de optimale transfektionskoncentrationer af miRNA'er afgørende, når man studerer selektiv eksport.
Desuden gør protokollen, når den kombineres med komplementære teknikker såsom nanopartikelsporingsanalyse (NTA), det muligt for forskeren at vurdere EV-partikelantallet, samtidig med at miRNA-frigivelsen evalueres og har potentialet til at muliggøre at skelne mellem ændringer i EV-biogeneseveje og miRNA-eksportmekanismer. Dette er især vigtigt på grund af de overlappende mæglere i disse processer17. I betragtning af at miRNA'er kan påvirke forskellige fænotyper, herunder nogle involveret i EV-biogenese, ville det være klogt at evaluere partikeltallet efter transfektion af miRNA'er18. For at overvinde denne forhindring ville en anden mulighed være at inkorporere et EV-miRNA, der forbliver uændret under de eksperimentelle betingelser, og derved udelukke faktorer, der er involveret i EV-biogenese, samtidig med at de veje, der er involveret i EV-miRNA-eksport, fremhæves.
Flere undersøgelser har kvantificeret miRNA'er ved hjælp af qRT-PCR, en standardmetode til endogen miRNA-kvantificering 10,11,16. Det mangler dog evnen til dynamisk at fange frigivelsen af miRNA'er i elbiler. Når man sammenligner flowcytometri med qRT-PCR, adskiller de sig meget baseret på analysefølsomheden og designet. Mens qRT-PCR er en meget følsom teknik og teoretisk i stand til at kvantificere minimale miRNA-kopitællinger, kræver det mindst en 2 gange (100%) forskel i kopiantallet af miRNA'er af interesse, at skelne mellem to prøver. Flowcytometri fanger derimod signalbaserede forskelle baseret på overflod af fluorescerende mærket miRNA og kan differentiere små procentvise ændringer i signaler. Ikke desto mindre begrænser dens lave følsomhed påvisningen af miRNA'er med begrænset kopiantal. De to teknikker supplerer hinanden synergistisk, når de anvendes sammen, som angivet i protokollen.
Sammenfattende tilbyder denne protokol et værdifuldt værktøj til at undersøge selektiv miRNA-eksportdynamik. På trods af de førnævnte udfordringer ligger styrken ved denne protokol i dens evne til at analysere flere miRNA'er samtidigt, hvilket bidrager til en bedre forståelse af miRNA-biologi, deres eksport og deres rolle i EV-biologi. De vigtigste styrker og svagheder ved protokollen, der skal tages i betragtning, er anført i tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender støtte og rådgivning fra Dr. Jill Hutchcroft, direktør for Flow Cytometry Core Facility ved Purdue University. Dette arbejde blev støttet af R01CA226259 og R01CA205420 til A.L.K., en American Lung Association Innovation Award (ANALA2023) IA-1059916 til A.L.K., et Purdue Shared resource facilitet tilskud P30CA023168 og et flagskib Fulbright Doctoral Scholarship tildelt af Department of the State, USA til H.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
