Summary
Her beskriver vi en enkel protokoll som muliggjør in vitro-vurdering av overflod av fluorescerende merkede mikroRNA for å studere dynamikken til mikroRNA-emballasje og eksport til ekstracellulære vesikler (EV).
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV) er viktige mediatorer for cellulær kommunikasjon som utskilles av en rekke forskjellige celler. Disse EVene transporterer bioaktive molekyler, inkludert proteiner, lipider og nukleinsyrer (DNA, mRNA, mikroRNA og andre ikke-kodende RNAer), fra en celle til en annen, noe som fører til fenotypiske konsekvenser i mottakercellene. Av alle de forskjellige EV-lastene har mikroRNA (miRNA) fått stor oppmerksomhet for sin rolle i å forme mikromiljøet og utdanne mottakerceller på grunn av deres klare dysregulering og overflod i EV. Ytterligere data indikerer at mange miRNA er aktivt lastet inn i elbiler. Til tross for dette klare beviset er forskning på dynamikken i eksport og mekanismer for miRNA-sortering begrenset. Her gir vi en protokoll ved hjelp av flowcytometrianalyse av EV-miRNA som kan brukes til å forstå dynamikken til EV-miRNA-lasting og identifisere maskineriet som er involvert i miRNA-eksport. I denne protokollen blir miRNA som er forhåndsbestemt til å bli beriket i EV og utarmet fra donorceller, konjugert til en fluorofor og transfektet inn i donorcellene. De fluorescerende merkede miRNAene blir deretter verifisert for lasting i EV og uttømming fra celler ved hjelp av qRT-PCR. Som både en transfeksjonskontroll og et verktøy for gating av den transfekterte populasjonen av celler, er et fluorescerende merket cellulært RNA (cellebeholdt og EV-utarmet) inkludert. Celler transfeksjonert med både EV-miRNA og cellebeholdt miRNA evalueres for fluorescerende signaler i løpet av 72 timer. Fluorescenssignalintensiteten som er spesifikk for EV-miRNAene, reduseres raskt sammenlignet med det cellebeholdte miRNA. Ved hjelp av denne enkle protokollen kunne man nå vurdere dynamikken til miRNA-lasting og identifisere ulike faktorer som er ansvarlige for lasting av miRNA i elbiler.
Introduction
MikroRNA (miRNA) er en av de best karakteriserte delmengdene av små ikke-kodende RNAer, som er kjent for sin kritiske rolle i posttranskripsjonell genregulering. Ekspresjonen og biogenesen til de fleste miRNA følger en koordinert serie hendelser som begynner med transkripsjon av de primære miRNAene (pri-miRNAer) i kjernen. Etter kjernefysisk prosessering av mikroprosessorkomplekset til forløper-miRNA (pre-miRNAer), eksporteres pre-miRNAene til cytoplasma, hvor de gjennomgår videre prosessering av RNase III endonuclease, dicer i 21-23 nukleotid modne miRNA duplekser1. En av strengene i det behandlede modne miRNA binder seg til målbringer-RNA (mRNA), noe som fører til nedbrytning eller translasjonell undertrykkelse av målene2. Basert på den pleiotropiske rollen til miRNA i samtidig regulering av flere forskjellige mål-mRNAer, er det ikke overraskende at miRNA-uttrykk er tett regulert3. Faktisk bidrar upassende uttrykk til ulike sykdomstilstander, spesielt i kreft. Det avvikende uttrykket av miRNA representerer ikke bare en sykdomsspesifikk signatur, men har også dukket opp som et mål for prognostisk og terapeutisk potensial 4,5,6. I tillegg til deres intracellulære roller har miRNA også ikke-autonome roller. For eksempel kan miRNA selektivt pakkes inn i EV av donorceller og eksporteres til mottakersteder der de fremkaller forskjellige fenotypiske responser i normal og sykdomsfysiologi 7,8,9.
Til tross for klare bevis på at EV-assosierte miRNA er funksjonelle biomolekyler, er det ikke helt forstått hvordan spesifikke delmengder av miRNA er dysregulert i sykdomstilstander som kreft og hvordan cellulært maskineri velger og sorterer miRNA i Evs10,11. Gitt den potensielle rollen som EV-miRNA i modulering av mikromiljøet, er det avgjørende å identifisere mekanismene som er involvert i eksport av utvalgte miRNA for fullt ut å belyse EVs rolle i intercellulær kommunikasjon og sykdomspatogenese. Å forstå prosessen med miRNA-frigjøring i elbiler vil ikke bare fremheve viktige mediatorer for miRNA-eksport, men kan også gi innsikt i potensielle terapier. For å oppnå dette kunnskapsnivået må verktøyene tilpasses for å trofast adressere disse nye eksperimentelle spørsmålene. Faktisk vokser studier som evaluerer elbiler eksponentielt på grunn av introduksjonen av nye teknikker og kontroller12,13. I forhold til evaluering av overflod av eksporterte miRNA til EV, har neste generasjons sekvensering og kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) vært dagens standardverktøy. Selv om disse verktøyene er nyttige for å evaluere overflod av miRNA i EV, er det begrensninger i deres følsomhet og spesifisitet, og bruk av disse statiske tilnærmingene for å evaluere dynamikk er utilstrekkelig. Å avgrense dynamikken i miRNA-eksport til elbiler krever en kombinasjon av spesialiserte verktøy. Her presenterer vi en omfattende protokoll ved hjelp av fluorescerende konjugerte miRNAer, for å analysere dynamikken i miRNA-frigjøring fra donorceller og inkorporering i EV. Vi diskuterer også fordeler og begrensninger ved metoden og gir anbefalinger for optimal bruk. Den allsidige metoden som presenteres i dette papiret, vil være nyttig for forskere som er interessert i å studere miRNA-utslipp til EV og deres potensielle roller i cellulær kommunikasjon og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Som en forutsetning for å bruke denne teknikken, er identifisering og validering av selektivt eksporterte miRNA nødvendig. Siden forskjellige cellelinjer varierer basert på miRNA-lasten sortert i EV-ene, anbefales det at cellelinjen av interesse og tilhørende EV-er evalueres for miRNA før bruk. I tillegg er lipofektaminbasert transfeksjon et av de kritiske trinnene i protokollen; Det anbefales å forhåndsbestemme transfeksjonseffektiviteten før eksperimentet konfigureres.
1. Voksende celler i kultur og transfeksjonerende celler med fluoroforkonjugert EV-miRNA
- Plate 200.000 til 400.000 celler i triplikate brønner i en 6-brønns plate i et passende kulturmedium. Roter platen forsiktig for å sikre jevn cellefordeling. Inkuber cellene til de når 70% -80% sammenløp, omtrent 24-48 timer.
- For hver brønn som skal transfeksjoneres, fortynn transfeksjonsreagenset i 100 μl serumfritt medium i et mikrosentrifugerør i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Den optimale konsentrasjonen av lipid bør bestemmes for cellelinjen av interesse før dette oppsettet. - For hver brønn som skal transfekteres, fortynn fluoroforkonjugert EV-miRNA (2nM) og celle-miRNA (2nM) separat i et mikrosentrifugerør i 100 μL serumfrie medier.
MERK: Det totale volumet skal beregnes for totalt antall brønner transfeksjonert. I denne protokollen ble fluorescensen evaluert ved 7 tidspunkter; Derfor var totalvolumet 700 μL for trinn 1,2 og 700 μL for trinn 1,3. I tillegg, for å trygt fange den positive fluorescerende populasjonen av celler, bør brukeren transfektere celler med et ikke-fluorescerende kryptert miRNA og sette opp en port som ekskluderer disse cellene. - Tilsett den fortynnede RNA-blandingen (fra trinn 1.3) til det fortynnede transfeksjonsreagenset (fra trinn 1.2) og bland forsiktig ved å snu røret 3-4 ganger. La det kombinerte lipid-RNA-blandingen inkubere i 30 minutter ved romtemperatur (RT).
- Fjern de vanlige dyrkningsmediene fra cellene og tilsett 800 μL serumfrie medier til hver brønn. Tilsett forsiktig 200 μL av lipid-RNA-blandingen (fra trinn 1.4) dråpevis til cellene.
MERK: Opti-MEM-medier ble brukt til å transfektere cellelinjen av interesse (Calu6-celler). Prøv å legge lipid-RNA-blandingen direkte til kulturmediet, unngå å tilsette blandingen til sidene av platen.
2. Høsting av transfekterte celler på forskjellige tidspunkter for analyse av fluorescens
- Inkuber de transfekterte cellene ved 37 °C i 7 timer.
MERK: For å validere konsistent transfeksjon av begge miRNA (EV-miRNA og celle-miRNA), samles celler fra en brønn 3 timer etter transfeksjon for å analysere fluorescensen ved hjelp av strømningscytometeret. - Etter 7 timers inkubasjonsperiode, fjern transfeksjonskomplekset fra brønnene og erstatt det med komplette medier.
- For å evaluere 7-timers tidspunktet, høst cellene og vask cellene tre ganger med 1x PBS.
- Hvis du arbeider med adherente celler, tilsett 200 μL trypsin til en brønn og vent på at cellene løsner fra platen. Overfør de frittliggende cellene til et mikrosentrifugerør og pellet ved sentrifugering ved 200xg i 5 minutter.
- Kast supernatanten forsiktig for å unngå å forstyrre cellepelleten. For første PBS-vask, resuspender pelleten i ~ 500 μL 1x PBS og gjenta pelleteringen ved hjelp av sentrifugeringstrinnene ovenfor. Gjenta PBS, vask ytterligere to ganger.
- Resuspender cellepelleten i 200 μL 2% paraformaldehyd (PFA) løsning og evaluer fluorescens.
MERK: Etter tilsetning av 2% PFA kan cellepelleten lagres ved 4 °C i 3-4 dager.
- Høst de resterende tidspunktene ved å følge trinnene i pkt. 2.3. Samle alle de lagrede cellepelletsene og fortsett med trinnene i seksjon 3.
3. Flowcytometrianalyse av celle-miRNA og EV-miRNA-signal i celler
- Klargjøre celler for flowcytometrianalyse. Filtrer cellesuspensjonen fra seksjon 2 til 35 μm silhetter som er en del av FACS-rørene med rundbunnspolystyren for å muliggjøre fjerning av rusk og celleaggregater som kan forstyrre fluoroforanalysen.
- Sett opp instrumentet i henhold til kalibreringsinstruksjonene. Slå på flowcytometeret og la det varmes opp i minst 30 minutter før bruk. Prime fluidics-systemet med hylstervæske, og kontroller og juster laserjusteringen.
- Kjør kvalitetskontroll for å bekrefte instrumentfluidikk. Legg ultrarent filtrert vann inn i strømningscytometeret og kjør med en passende strømningshastighet for tilstrekkelig innsamlingstid.
MERK: Riktig strømningshastighet og innsamlingstid vil avhenge av celletype av interesse, prøvekompleksitet og ønsket datakvalitet. - Åpne programvaren for dataanalyse av flowcytometri og bekreft ytelsen til detektoren og laserne. Sett opp terskel- og spenningsparametere for deteksjon basert på cellelinjen av interesse og fluoroforer du velger.
MERK: For alle nedstrøms eksperimenter ble Calu6-celler brukt.- Sett terskelen for å fange signalet for Calu6-celler ved FSC 5000. Utfør analysen for 1 x 104 celler for hver eksperimentell repetisjon.
- For å ta hensyn til spektral overlapping mellom forskjellige fluoroforer, bruk ikke-transfekterte celler og celler uavhengig transfektet med bare en av fluoroforene for å sette opp kompensasjonskontroller.
- For påvisning av miRNA-eksport, bruk kandidat EV-miRNA (miR-451a og miR-150) konjugert til Alexa-fluor 488, og en kontrollcelle-miRNA (cel-miR-67) konjugert til Cy3.
- For hvert EV-miRNA, konjugere fluoroforen til 5'-enden av 5p-strengen. Før transfeksjon, anneal den fluoroforkonjugerte strengen til sin 100% komplementære 3p-streng.
- For ekspresjonsanalysen i transfekterte celler, analyser prøvene ved hjelp av FSC-, SSC-, FITC- og PE-kanalene satt til henholdsvis 258, 192, 269 og 423 spenningsenheter (figur 1A, B).
- Innfør den negative kontrollprøven i flowcytometeret. Registrer cellesignaler etter å ha definert foroverpunktintensitet (FSC) og sidepunktintensitet (SSC) i et egendefinert regneark.
- I plottet velger du FSC for X-aksen, SSC for Y-aksen og porten for populasjonen av interesse ved å tegne en polygon rundt den (se figur 1B, nederste panel).
- Opprett en ny tomt ved hjelp av den inngjerdede populasjonen.
- Sett X-aksen til fluorescenssignal 1 (FS1) for celle-miRNA-deteksjon og Y-aksen til fluorescenssignal 2 (FS2) for EV-miRNA-deteksjon. Sett opp kompensasjonsparametere for de enkelte fluoroforene ved hjelp av celler som er uavhengig transfektert med hver av de fluorescerende merkede miRNAene. I den nye tomten, gate på befolkningen av interesse.
- For påvisning av EV-miRNA, bruk FITCH-kanalen. For evaluering av celle-miRNA-signal, bruk PE-kanalen. I programvaren lager du en port rundt cellene som var positive for både FITC og PE ved å tegne et polygon rundt dobbeltfluorescenspopulasjonen når FITC ble valgt for X-aksen og PE ble valgt for Y-aksen.
- Registrer statistikken for den inngjerdede populasjonen.
- Registrer prosentandelen celler i den inngjerdede populasjonen som er positive for både FITC og PE, samt for de som er positive for enten FITC eller PE.
- Gjenta trinnene ovenfor for eventuelle andre eksempler eller kontroller i eksperimentet.
4. Isolere elbiler fra transfekterte celler
- For celler dyrket i serumholdige medier, tøm EV fra serumet for å forhindre krysskontaminering.
- For å generere EV-utarmet serum, fortynn serumet til 50% i cellekulturmedier for å redusere viskositeten og sentrifuge det resulterende 50% serumet ved 110 000 x g i 18 timer.
- Samle supernatanten (EV-fritt serum) forsiktig og filtrer den ved hjelp av en 0,2 μm filterenhet. Bruk det resulterende 50% EV-frie serumet for å generere komplette medier, i dette tilfellet RPMI pluss 10% serum.
- For å samle elbiler, legg til det EV-utarmede komplette mediet til cellene og samle elbilene 48 timer etter inkubering.
MERK: Protokollen som er skissert nedenfor er endret fra Kowal et al.14.
- Voks celler i 15 cm vevskulturretter til 80% konfluens. Transfekt cellene separat med celle-miRNA og EV-miRNA i 10 ml Opti-MEM etter transfeksjonsprotokollen i avsnitt 1 i protokollen.
MERK: Ikke alle transfeksjonsprotokoller skaleres lineært. Det kan være viktig å først tilpasse og evaluere transfeksjonsforholdene i 15 cm plater. - Etter 7 timer, aspirer transfeksjonsmediet og erstatt det med EV-utarmede medier (15 ml). Dyrk celler i EV-utarmede medier i 48 timer.
- Fjern det kondisjonerte mediet fra cellene og dispenser det i et 50 ml sentrifugerør inne i biosikkerhetsskapet. Sentrifuger det kondisjonerte mediet ved 2000 x g i 10 minutter ved 4 °C for å fjerne døde celler og celleavfall. Overfør den resulterende supernatanten til et nytt rør.
- Sentrifuger supernatanten ved 10 000 x g i 40 minutter ved 4 °C. Fjern supernatanten og filtrer den ved hjelp av en 0,2 μm filterenhet.
- Overfør det filtrerte cellekulturmediet til et sterilt ultrasentrifugerør inne i biosikkerhetsskapet. Vei og balanser rørene mot hverandre. Spinn prøvene på 110 000 x g i 90 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Resuspender pelleten i et passende volum på 1x PBS for vask og sentrifuge ved 110 000 x g i 90 min 4 °C.
MERK: EV-pelleten ble resuspendert i 60 ml 1x PBS basert på det maksimale volumet som er tillatt for rotorrørene med fast vinkel som ble brukt i denne studien. - Aspirer PBS og suspender EV-pelleten i et passende volum (50-100 μL) fersk 1x PBS og vortex. Oppbevar elbiler ved -80 °C for senere bruk.
5. Flowcytometrianalyse av celle-miRNA og EV-miRNA-signal i EV
- For å forberede EV-suspensjon for flowcytometrianalyse, fortynn EV i et passende volum ultrafiltrert 1x PBS.
MERK: Lastevolumet for flowcytometrianalysen av elbiler bør bestemmes basert på antall elbiler i prøver. Grovt, hvis det er ~ 30.000 partikler i EV-suspensjonen, bør det endelige volumet være ~ 500-600 μL i 1x PBS. En ren prøve har rundt 35-50 partikler/μL. - Bruk nano-flow cytometer eller et alternativt utstyr kraftig nok til å analysere nano-størrelse partikler.
MERK: Her ble Attune NxT nano-flow cytometer brukt. - Åpne programvaren og still inn instrumentet i henhold til de anbefalte kalibreringsinstruksjonene. Utfør ytelsestesten ved hjelp av nano-perler med høy ytelse. Hvis nano-perlene oppdages i standard størrelsesområde, er ytelsen optimal. Bestem riktig strømningshastighet for påvisning av EV-partikler.
- Kjør kvalitetskontroll ved hjelp av ultrarent filtrert vann for å bekrefte instrumentfluidikk og ytelsen til detektor og lasere.
- Bruk kalibreringsperler som er egnet for eksperimentet, og still inn strømningscytometeret til nøyaktig å oppdage perler i forskjellige størrelser og måle fluorescenssignaler.
MERK: For oppsett av EV-analyse ved flowcytometri ble ApogeeMix-perler brukt. Disse perlene inneholder en blanding av ikke-fluorescerende silikaperler og fluorescerende polystyrenperler som varierer i størrelser fra 80 nm til 1300 nm.- Sett opp parametrene for å vurdere følsomheten og oppløsningen til forskjellige populasjoner i dråpeblandingen i henhold til produsentens protokoll. Bruk riktig gating for å løse perlepopulasjonen fra instrumentstøyen.
- Virvle prøvene grundig for jevnt fordelt elbiler før du laster til analyse.
- Åpne programvaren for analyse av flowcytometridata og introduser ultrafiltrert PBS. Sett gatingen opp for EV-partikler ved hjelp av ultrafiltrert PBS mens du sørger for at gatingen tilsvarer riktig størrelse på partikler basert på perlene i trinn 5.5.
- Legg inn den negative kontrollprøven for å analysere elbiler når de passerer gjennom strømningscytometeret. Ta opp EV-signaler mens du plotter FSC på X-aksen og SSC på Y-aksen.
MERK: SSC-terskelen for å fange elbiler ble satt til 300. Innsamlingsvolumet ble satt til 95 μL fra totalt 145 μL trukket volum. Strømningshastigheten ble satt til 12,5 μL/min. Analysen ble utført med 1 x 106 EV-partikler. Elbilbestanden er heterogen og vil resultere i noe rusk isolert sammen med elbiler. Samlet partikkeldeteksjon i FSC vs. SSC-plottet fremhever partikler i et variert område, noe som forventes ved bruk av rå EV-preparater. - Opprett en ny tomt ved hjelp av den inngjerdede populasjonen.
- Denne gangen velger du fluorescenssignal 1 (FS1) for celle-miRNA-deteksjon på X-aksen og fluorescenssignal 2 (FS2) for EV-miRNA-deteksjon på Y-aksen.
- Sett opp kompensasjonsparametere for fluoroforene ved hjelp av EV-prøvene isolert fra celler transfektet med et enkelt miRNA. I den nye tomten, gate på EV befolkningen av interesse.
- For ekspresjonsanalyse av fluoroforkonjugerte miRNA i EV isolert fra de transfekterte cellene, analyser EV-prøvene ved hjelp av FSC-, SSC-, BL1- og YL1-kanalene satt til henholdsvis 370, 370, 400 og 400 spenningsenheter (figur 2A, B).
- Registrer statistikken for den inngjerdede populasjonen og visualiser dem ved hjelp av histogrammer og punktdiagrammer.
- Gjenta trinnene ovenfor for eventuelle andre eksempler eller kontroller i eksperimentet.
6. Validere utgivelsen av miRNA i elbiler gjennom qRT-PCR
- Trekk ut RNA fra elbiler og foreldreceller ved hjelp av miRVana RNA-isolasjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Kvantifisering av RNA isolert fra EV er ikke mulig fordi den totale mengden RNA isolert fra EV vanligvis ikke krysser den minimale mengdeterskelen til et standard Nano-fall. Dette skyldes uttømming av ribosomalt RNA fra EV-prøver, som kan valideres ved hjelp av Agilent Bioanalyzer. Dermed er integritetspoengene for EV-RNA-kvantifisering vanligvis ikke pålitelige og er ikke den sanne representasjonen av EV-RNA-mengde. Derfor, for qRT-PCR-kvantifisering av EV-RNA og celle-RNA, ble like volumer RNA-isolater etter isolasjon fra et likt antall celler brukt. For normalisering av qRT-PCR ble miRNA allestedsnærværende tilstede over flere prøver som bestemt fra tidligere ervervede RNA-sekvenseringsdata brukt. - Konverter det ekstraherte RNA til cDNA ved hjelp av et revers transkriptasesett spesifikt for små RNA.
- Sett opp qRT-PCR-reaksjonen ved hjelp av en cDNA-mal og miRNA-spesifikke primere i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: For valideringseksperimenter ble miRCURY LNA qRT PCR-sett og tilsvarende primere fra produsenten brukt til å evaluere uttrykket av celle-miRNA og EV-miRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her bruker vi flowcytometri som et kraftig verktøy for å undersøke frigjøring av miRNA fra cellene til elbiler. Ved hjelp av denne protokollen viste flowcytometrianalyse av celler transfeksjonert med celle-miRNA og EV-miRNA en sekvensiell reduksjon av fluorescenssignal tilsvarende EV-miRNA, mens signalet tilsvarende celle-miRNA ble beholdt i cellene. For å sikre at fluoroforkonjugering ikke forstyrrer miRNA-frigjøring i EV, ble miR-451a konjugert til to separate fluoroforer (dvs. Alexa fluor 488 og Alexa fluor 750), og cellerensjon ble evaluert. Resultatene indikerer minimal variabilitet mellom deteksjon av de separate fluoroforsignalene etter transfeksjon, og validerer påliteligheten av denne tilnærmingen (figur 3A, B).
Fordi ulike årsaker kunne forklare tapet av fluorescerende merket miR-451a fra cellene, inkludert RNA-nedbrytning, var det avgjørende å verifisere at cellulært tap sammenfalt med EV-overflod. Ved bruk av flowcytometri ble akkumulering av miR-451a konjugert til Alexa fluor-488 i EV observert på en tidsavhengig måte, noe som ga bevis på effektiv emballasje og eventuell frigjøring av miRNA i EV. Fluorescenssignalet tilsvarende cellens miRNA, cel-miR-67, ble derimot ikke detektert i elbilene (figur 4). Disse funnene ved hjelp av denne nye tilnærmingen ble validert ved hjelp av qRT-PCR, som viste et signifikant høyere EV / celleekspresjonsforhold for miR-150, et ekstra EV-miRNA, sammenlignet med celle-miRNA, cel-miR-67 (figur 5).
Figur 1: Oppsett av flowcytometerparametere for deteksjon av signaler i celler. (A) For analyse av cellefluorescens, ved hjelp av programvaren, ble de uthevede spenningene satt opp for de angitte parametrene. Instrumentet ble satt opp til å registrere 10 000 celler per prøve. Inspektørvisningen bekrefter parameterne som er konfigurert for gjenkjenning og analyse. (B) For analyse av cellefluorescens ble terskelen for FSC-parameteren satt til 5000 under cytometerinnstillingsfanen i programvaren. Panelet øverst til høyre viser laserinnstillingene for datafangsten. De nederste panelene viser et aktivt globalt regneark under fremdriften i gjenkjenningen av celler. Prøvene ble kjørt ved en middels strømning og fanget mens de etablerte FSC-A og SSC-A som henholdsvis x-akse og y-akseparametere. Gatingen ble satt ved hjelp av et tegnepolygonverktøy rundt befolkningen av interesse. Gatingen kan være forskjellig for en annen cellelinje av interesse, avhengig av mangfoldet i cellepopulasjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett av flowcytometriparametere for signaldeteksjon i elbiler. (A) For deteksjon og nedstrømsanalyse av elbiler ble innsamlingsvolumet satt til 95 μL med strømningshastigheten satt til 12,5 μL/min. Den valgte terskelen for EV-deteksjon var 0,3 x1000 under instrumentinnstillingsfanen i programvaren basert på kalibreringskulene som ble brukt. Spenninger for FSC, SSC, BL1 og YL1 var henholdsvis 370, 370, 400 og 400. (B) Oppsett av gating for å fange heterogen EV-befolkning og skille elbiler fra bakgrunnsstøyen til instrumentet. En tom PBS-prøve (øverst) ble brukt som en negativ kontroll for å løse bakgrunnsstøy fra EV-populasjonen. EV-prøve (nederst) viser at populasjonen av interesse bare er 1.8% av den totale befolkningen fordi prøven er heterogen med overlappende partikler i størrelsesområdet. Imidlertid ble det valgt streng gating for å sikre deteksjon av EV-populasjonen av interesse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Signaldeteksjon i celler gjennom flowcytometri. (A) Fluorescens tilsvarende EV-miRNA og celle-miRNA ble detektert i celler til tider indikert mellom 7 timer og 72 timer etter transfeksjon. Signalet som tilsvarer EV-miR-451a (Alexa fluor-488) avtok med tiden i forhold til signalet fra cellen-beholdt-miRNA, cel-miR-67. (B) Fluorescens tilsvarende EV-miR-451a merket med Alexa fluor-750 viste samme trend som Alexa Fluro-488 merket miR-451a, noe som indikerer at fluoroforen ikke påvirker oppbevaring av miRNA av cellene. Samlet sett indikerer de representative resultatene at det transfekterte miRNA oppfører seg på samme måte som det endogene miRNA basert på eksport av miRNA til EV. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Signaldeteksjon i elbiler gjennom flowcytometri. Fluorescens tilsvarende EV-miR-451a og celle-cel-miR-67 ble påvist i EV 24 timer og 48 timer etter transfeksjon. Signalet som tilsvarer EV-miR-451a (Alexa fluor-488) ble fanget opp i EV 48 timer etter transfeksjon. Derimot ble signalet for cel-miR-67 ikke oppdaget i elbiler. En tom PBS-prøve ble brukt til å sette opp gating for dette eksperimentet, som vist i figur 2B. EV-prøver isolert fra celler transfektet med ikke-fluorescerende kryptert RNA ble brukt som en negativ kontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kvantifisering av EV-miRNA og celle-miRNA i celler og EV ved bruk av qRT-PCR. Calu6-celler ble transfektert med 2 nM miR-150 og cel-miR-67 hver. Elbiler ble samlet inn 48 timer etter transfeksjon. EV-anrikning ble beregnet som forholdet mellom EV-uttrykk delt på cellulært uttrykk i transfekterte Calu6-celler for miR-150 og cel-miR-67. Basert på RNA-sekvenseringsresultater som sammenlignet uttrykket av miRNA i Calu6-celler og deres tilsvarende EV, ble miR-30c brukt som en endogen kontroll og en normalisator for foldendringsberegning. Dataene som presenteres er fra en biologisk replikat, hvor hvert datapunkt presenterer triplikate qRT-PCR-reaksjoner. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SD, og p-verdier er beregnet med uparet t-test med Welchs korreksjon (**p < 0,01). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Styrker | Svakheter |
| Muliggjør samtidig vurdering av selektiv eksport av flere miRNA i celler og respektive EV-er | Kreve ytterligere prosedyrer for å skille mellom aktivt og passivt eksportfenomen |
| Vurdering av rå heterogen befolkning er mulig og krever ikke forutgående separasjon av EV-populasjoner. Kan brukes til å analysere ulike typer elbiler MERK: Terskelen for deteksjon av ulike typer partikler vil variere |
Lav sensitivitet tillater ikke påvisning av begrensede konsentrasjoner av miRNA i celler eller EV. Dette kan overvinnes ved å inkorporere nedstrøms qRT-PCR-analyse etter RNA-isolering fra elbiler |
| Krever kort tid for oppsett og analyse i forhold til standardmetoder som brukes til miRNA-kvantifisering | Mangel på standardiseringsprotokoller for forskjellige typer utstyr, cellelinjer og forskjellige fluoroforer. |
Tabell 1: Protokollens største styrker og svakheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nyetablerte protokollen gjør det mulig å fange kinetikk av miRNA-frigjøring til EV-er etter transfeksjon av EV-miRNA. Tilnærmingen tillater samtidig analyse av flere EV-miRNA og celle-miRNAer, underlagt cytometerets evner. Dessuten, mens flowcytometrianalyse kan gi verdifull innsikt i EV miRNA-biologi, er det ikke uten begrensninger. Selv om noen av begrensningene kan overvinnes når de brukes sammen med andre teknikker for en mer omfattende forståelse.
Et fremvoksende interesseområde innen EV-biologi er å forstå den selektive eksporten av miRNA til EV15,16. Selv om denne protokollen tilbyr et kraftig verktøy for å tillate å studere selektiv eksport av miRNA, er en av de kritiske utfordringene å skille mellom aktiv og passiv eksport. Forsiktighet må utvises siden overuttrykking av et miRNA ved høy nok konsentrasjon kan endre eksporten av miRNA, noe som potensielt kan resultere i upassende passiv belastning. Derfor er eksperimentering for å bestemme de optimale transfeksjonskonsentrasjonene av miRNA avgjørende når man studerer selektiv eksport.
Videre gjør protokollen, kombinert med komplementære teknikker som nanopartikkelsporingsanalyse (NTA), forskeren å vurdere EV-partikkelantallet samtidig som miRNA-frigivelsen evalueres og har potensial til å skille mellom endringer i EV-biogeneseveier og miRNA-eksportmekanismer. Dette er spesielt viktig på grunn av de overlappende mediatorene av disse prosessene17. Med tanke på at miRNA kan påvirke forskjellige fenotyper, inkludert noen involvert i EV-biogenese, ville det være forsvarlig å evaluere partikkeltallet etter transfeksjon av miRNA18. For å overvinne dette hinderet, ville et annet alternativ være å innlemme et EV-miRNA som forblir uendret under eksperimentelle forhold, og dermed utelukke faktorer involvert i EV-biogenese mens de fremhever veiene som er involvert i EV-miRNA-eksport.
Flere studier har kvantifisert miRNA ved hjelp av qRT-PCR, en standardmetode for endogen miRNA-kvantifisering 10,11,16. Det mangler imidlertid muligheten til dynamisk å fange frigjøringen av miRNA til elbiler. Når man sammenligner flowcytometri med qRT-PCR, varierer de sterkt basert på analysefølsomhet og design. Mens qRT-PCR er en svært sensitiv teknikk og teoretisk i stand til å kvantifisere minimale miRNA-kopiantall, krever skille mellom to prøver minst en 2 ganger (100%) forskjell i kopinummeret av miRNA av interesse. Flowcytometri, derimot, fanger signalbaserte forskjeller basert på overflod av fluorescerende merket miRNA og kan skille små prosentvise endringer i signaler. Ikke desto mindre begrenser den lave følsomheten deteksjonen av miRNA med begrensede kopinumre. De to teknikkene utfyller hverandre synergistisk når de brukes sammen, som angitt i protokollen.
Oppsummert tilbyr denne protokollen et verdifullt verktøy for å undersøke selektiv miRNA-eksportdynamikk. Til tross for de nevnte utfordringene ligger styrken til denne protokollen i dens evne til å analysere flere miRNA samtidig, noe som bidrar til en bedre forståelse av miRNA-biologi, deres eksport og deres rolle i EV-biologi. De største styrkene og svakhetene ved protokollen som må vurderes, er listet opp i tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner støtte og råd fra Dr. Jill Hutchcroft, direktør for Flow Cytometry Core Facility ved Purdue University. Dette arbeidet ble støttet av R01CA226259 og R01CA205420 til ALK, en American Lung Association Innovation Award (ANALA2023) IA-1059916 til ALK, en Purdue Shared ressursfasilitet tilskudd P30CA023168, og et flaggskip Fulbright doktorgradsstipend tildelt av Department of the State, USA til HH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
