Summary
Burada, mikroRNA paketlemesinin dinamiklerini incelemek ve hücre dışı veziküllere (EV'ler) aktarmak için floresan etiketli mikroRNA'ların bolluğunun in vitro değerlendirmesini sağlayan basit bir protokolü açıklıyoruz.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EV'ler), çeşitli farklı hücreler tarafından salgılanan hücresel iletişimin önemli aracılarıdır. Bu EV'ler, proteinler, lipitler ve nükleik asitler (DNA, mRNA'lar, mikroRNA'lar ve diğer kodlamayan RNA'lar) dahil olmak üzere biyoaktif molekülleri bir hücreden diğerine taşıyarak alıcı hücrelerde fenotipik sonuçlara yol açar. Tüm çeşitli EV kargoları arasında, mikroRNA'lar (miRNA'lar), EV'lerdeki açık düzensizlikleri ve bollukları nedeniyle mikro çevreyi şekillendirmedeki ve alıcı hücreleri eğitmedeki rolleri nedeniyle büyük ilgi görmüştür. Ek veriler, birçok miRNA'nın aktif olarak EV'lere yüklendiğini göstermektedir. Bu açık kanıtlara rağmen, ihracatın dinamikleri ve miRNA sıralama mekanizmaları üzerine araştırmalar sınırlıdır. Burada, EV-miRNA yüklemesinin dinamiklerini anlamak ve miRNA dışa aktarımında yer alan makineleri tanımlamak için kullanılabilecek EV-miRNA'nın akış sitometrisi analizini kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu protokolde, EV'lerde zenginleştirildiği ve donör hücrelerden tükendiği önceden belirlenmiş miRNA'lar bir florofora konjuge edilir ve donör hücrelere transfekte edilir. Floresan etiketli miRNA'lar daha sonra EV'lere yüklenmek ve qRT-PCR kullanılarak hücrelerden tükenmek üzere doğrulanır. Hem bir transfeksiyon kontrolü hem de transfekte edilmiş hücre popülasyonunu geçit yapmak için bir araç olarak, floresan etiketli bir hücresel RNA (hücre tutulan ve EV tükenmiş) dahil edilmiştir. Hem EV-miRNA hem de hücre tutulan miRNA ile transfekte edilen hücreler, 72 saat boyunca floresan sinyaller açısından değerlendirilir. EV-miRNA'lara özgü floresan sinyal yoğunluğu, hücrede tutulan miRNA'ya kıyasla hızla azalır. Bu basit protokolü kullanarak, artık miRNA yüklemesinin dinamikleri değerlendirilebilir ve miRNA'ların EV'lere yüklenmesinden sorumlu çeşitli faktörler belirlenebilir.
Introduction
MikroRNA'lar (miRNA'lar), transkripsiyon sonrası gen regülasyonundaki kritik rolleriyle bilinen, kodlamayan küçük RNA'ların en iyi karakterize edilen alt kümelerinden biridir. Çoğu miRNA'nın ekspresyonu ve biyogenezi, çekirdekteki birincil miRNA'ların (pri-miRNA'lar) transkripsiyonu ile başlayan koordineli bir dizi olayı takip eder. Mikroişlemci kompleksi tarafından öncül-miRNA'lara (pre-miRNA'lar) nükleer işlemeyi takiben, pre-miRNA'lar sitoplazmaya aktarılır ve burada RNase III endonükleaz tarafından daha fazla işleme tabi tutulurlar, 21-23 nükleotid olgun miRNA duplekslerinedönüşür 1. İşlenmiş olgun miRNA'nın ipliklerinden biri, hedef haberci RNA'lara (mRNA'lar) bağlanarak hedeflerinbozulmasına veya translasyonel baskılanmasına yol açar 2. MiRNA'ların aynı anda birden fazla farklı hedef mRNA'yı düzenlemedeki pleiotropik rolüne dayanarak, miRNA ekspresyonunun sıkı bir şekilde düzenlenmesi şaşırtıcı değildir3. Gerçekten de, uygunsuz ifade, özellikle kanserde çeşitli hastalık durumlarına katkıda bulunur. MiRNA'ların anormal ekspresyonu sadece hastalığa özgü bir imzayı temsil etmekle kalmaz, aynı zamanda prognostik ve terapötik potansiyel için bir hedef olarak ortaya çıkmıştır 4,5,6. Hücre içi rollerine ek olarak, miRNA'ların özerk olmayan rolleri de vardır. Örneğin, miRNA'lar donör hücreler tarafından seçici olarak EV'lere paketlenebilir ve normal ve hastalık fizyolojisindeçeşitli fenotipik tepkiler ortaya çıkardıkları alıcı bölgelere aktarılabilir 7,8,9.
EV ile ilişkili miRNA'ların fonksiyonel biyomoleküller olduğuna dair açık kanıtlara rağmen, kanser gibi hastalık durumlarında miRNA'ların spesifik alt kümelerinin nasıl düzensiz olduğu ve hücresel makinelerin miRNA'ları nasıl seçip Ev'lere ayırdığı tam olarak anlaşılmamıştır10,11. EV-miRNA'ların mikroçevreyi modüle etmedeki potansiyel rolü göz önüne alındığında, EV'lerin hücreler arası iletişim ve hastalık patogenezindeki rolünü tam olarak aydınlatmak için seçilmiş miRNA'ların ihracatında yer alan mekanizmaları belirlemek çok önemlidir. EV'lere miRNA salınım sürecini anlamak, yalnızca miRNA ihracatının önemli aracılarını vurgulamakla kalmayacak, aynı zamanda potansiyel terapötikler hakkında da fikir verebilir. Bu bilgi düzeyine ulaşmak için, araçların bu yeni deneysel soruları aslına uygun olarak ele alacak şekilde uyarlanması gerekir. Gerçekten de, EV'leri değerlendiren çalışmalar, yeni tekniklerin ve kontrollerin tanıtılması nedeniyle katlanarak artmaktadır 12,13. EV'lere ihraç edilen miRNA'ların bolluğunun değerlendirilmesi ile ilgili olarak, yeni nesil dizileme ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) mevcut standart araçlar olmuştur. Bu araçlar, EV'lerdeki miRNA'ların bolluğunu değerlendirmek için yararlı olsa da, duyarlılıkları ve özgüllükleri konusunda sınırlamalar vardır ve dinamikleri değerlendirmek için bu statik yaklaşımları kullanmak yetersizdir. EV'lere miRNA ihracatının dinamiklerini tanımlamak, özel araçların bir kombinasyonunu gerektirir. Burada, donör hücrelerden miRNA salınımının ve EV'lere dahil edilmesinin dinamiklerini analiz etmek için floresan konjuge miRNA'ları kullanan kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Ayrıca yöntemin avantajlarını ve sınırlamalarını tartışıyoruz ve optimum kullanım için önerilerde bulunuyoruz. Bu yazıda sunulan çok yönlü yöntem, EV'lere miRNA salınımını ve bunların hücresel iletişim ve hastalıktaki potansiyel rollerini incelemekle ilgilenen araştırmacılar için faydalı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu tekniği kullanmanın bir ön koşulu olarak, seçici olarak ihraç edilen miRNA'ların tanımlanması ve doğrulanması gereklidir. Farklı hücre hatları, EV'lerine göre sıralanan miRNA kargosuna göre değiştiğinden, ilgilenilen hücre hattının ve ilişkili EV'lerin kullanımdan önce miRNA'lar için değerlendirilmesi önerilir. Ek olarak, lipofektamin bazlı transfeksiyon, protokoldeki kritik adımlardan biridir; Deneyi kurmadan önce transfeksiyon verimliliğinin önceden belirlenmesi önerilir.
1. Kültürde büyüyen hücreler ve floroforla konjuge EV-miRNA ile hücrelerin transfekte edilmesi
- 200.000 ila 400.000 hücreyi, uygun bir kültür ortamında 6 oyuklu bir plakada üçlü oyuklarda plakalayın. Düzgün hücre dağılımı sağlamak için plakayı hafifçe döndürün. Hücreleri% 70-80 birleşme noktasına ulaşana kadar, yaklaşık 24-48 saat inkübe edin.
- Transfekte edilecek her kuyucuk için, transfeksiyon reaktifini üreticinin talimatlarına göre bir mikrosantrifüj tüpünde 100μL serumsuz ortamda seyreltin.
NOT: Bu kurulumdan önce ilgilenilen hücre hattı için optimal lipid konsantrasyonu belirlenmelidir. - Transfekte edilecek her kuyucuk için, florofor konjuge EV-miRNA'yı (2nM) ve hücre-miRNA'yı (2nM) 100 μL serumsuz ortamda bir mikrosantrifüj tüpünde ayrı ayrı seyreltin.
NOT: Toplam hacim, aktarılan toplam kuyu sayısı için hesaplanmalıdır. Bu protokolde floresan 7 zaman noktasında değerlendirildi; bu nedenle, toplam hacim adım 1.2 için 700 μL ve adım 1.3 için 700 μL idi. Ek olarak, hücrelerin pozitif floresan popülasyonunu güvenle yakalamak için, kullanıcı hücreleri floresan olmayan şifreli bir miRNA ile transfekte etmeli ve bu hücreleri hariç tutan bir kapı oluşturmalıdır. - Seyreltilmiş RNA karışımını (adım 1.3'ten) seyreltilmiş transfeksiyon reaktifine (adım 1.2'den itibaren) ekleyin ve tüpü 3-4 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın. Kombine lipit-RNA karışımının oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe etmesine izin verin.
- Normal kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve her oyuğa 800 μL serumsuz ortam ekleyin. Hücrelere damla damla 200 μL lipit-RNA karışımı (adım 1.4'ten itibaren) yavaşça ekleyin.
NOT: İlgilenilen hücre hattını (Calu6 hücreleri) transfekte etmek için Opti-MEM ortamı kullanılmıştır. Lipit-RNA karışımını doğrudan kültür ortamına eklemeye çalışın, karışımı plakanın kenarlarına eklemekten kaçının.
2. Floresan analizi için çeşitli zaman noktalarında transfekte edilmiş hücrelerin toplanması
- Transfekte edilen hücreleri 37 ° C'de 7 saat inkübe edin.
NOT: Her iki miRNA'nın (EV-miRNA ve hücre-miRNA) tutarlı transfeksiyonunu doğrulamak için, akış sitometresi kullanılarak floresansı analiz etmek için transfeksiyondan 3 saat sonra bir kuyudan hücreler toplanır. - 7 saatlik inkübasyon süresinden sonra, transfeksiyon kompleksini kuyucuklardan çıkarın ve komple ortamla değiştirin.
- 7 saatlik zaman noktasını değerlendirmek için hücreleri toplayın ve hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın.
- Yapışık hücrelerle çalışıyorsanız, bir kuyucuğa 200 μL tripsin ekleyin ve hücrelerin plakadan ayrılmasını bekleyin. Ayrılan hücreleri bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika boyunca 200xg'de santrifüjleme yoluyla peletleyin.
- Hücre peletini bozmamak için süpernatanı dikkatlice atın. İlk PBS yıkaması için, peleti ~500 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve yukarıdaki santrifüjleme adımlarını kullanarak peletlemeyi tekrarlayın. PBS yıkamasını iki kez daha tekrarlayın.
- Hücre peletini 200 μL% 2 paraformaldehit (PFA) çözeltisi içinde yeniden süspanse edin ve floresansı değerlendirin.
NOT: %2 PFA eklendikten sonra, hücre peleti 4 °C'de 3-4 gün saklanabilir.
- Bölüm 2.3'teki adımları izleyerek kalan zaman noktalarını toplayın. Depolanan tüm hücre peletlerini toplayın ve bölüm 3'teki adımlara devam edin.
3. Hücrelerde hücre-miRNA ve EV-miRNA sinyalinin akış sitometrisi analizi
- Hücreleri akış sitometrisi analizi için hazırlayın. Florofor analizine müdahale edebilecek kalıntıların ve hücre agregalarının uzaklaştırılmasını sağlamak için yuvarlak tabanlı polistiren FACS tüplerinin bir parçası olan bölüm 2'den 35 μm'ye kadar süzgeç kapaklarından hücre süspansiyonunu filtreleyin.
- Kalibrasyon talimatlarını izleyerek cihazı kurun. Akış sitometresini açın ve kullanmadan önce en az 30 dakika ısınmasını bekleyin. Akışkan sistemini kılıf sıvısı ile doldurun ve lazer hizalamasını kontrol edin ve ayarlayın.
- Cihaz akışkanlarını doğrulamak için kalite kontrolünü çalıştırın. Ultra saf filtrelenmiş suyu akış sitometresine yükleyin ve yeterli alım süresi için uygun bir akış hızında çalıştırın.
NOT: Uygun akış hızı ve alım süresi, ilgilenilen hücre tipine, numune karmaşıklığına ve istenen veri kalitesine bağlı olacaktır. - Akış sitometrisi veri analiz yazılımını açın ve dedektörün ve lazerlerin performansını onaylayın. İlgilenilen hücre hattına ve tercih edilen floroforlara göre algılama için eşik ve voltaj parametrelerini ayarlayın.
NOT: Tüm aşağı akış deneyleri için Calu6 hücreleri kullanıldı.- FSC 5000'de Calu6 hücreleri için sinyal yakalama eşiğini ayarlayın. Her deneysel tekrar için 1 x 104 hücre için analiz gerçekleştirin.
- Farklı floroforlar arasındaki spektral örtüşmeyi hesaba katmak için, kompanzasyon kontrollerini ayarlamak için transfekte edilmemiş hücreleri ve floroforlardan yalnızca biriyle bağımsız olarak transfekte edilmiş hücreleri kullanın.
- MiRNA dışa aktarımının tespiti için, Alexa-fluor 488'e konjuge edilmiş aday EV-miRNA'ları (miR-451a ve miR-150) ve Cy3'e konjuge bir kontrol hücresi-miRNA (cel-miR-67) kullanın.
- Her EV-miRNA için, floroforu 5p ipliğinin 5' ucuna eşlenikleyin. Transfeksiyondan önce, florofor konjuge ipliği %100 tamamlayıcı 3p ipliğine tavlayın.
- Kesilen hücrelerde ekspresyon analizi için, sırasıyla 258, 192, 269 ve 423 voltaj birimlerine ayarlanmış FSC, SSC, FITC ve PE kanallarını kullanarak numuneleri analiz edin (Şekil 1A, B).
- Negatif kontrol örneğini akış sitometresine sokun. Özel bir çalışma sayfasında ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) yoğunluklarını tanımladıktan sonra hücre sinyallerini yakalayın.
- Çizimde, X ekseni için FSC'yi, Y ekseni için SSC'yi ve etrafına bir çokgen çizerek ilgilenilen popülasyon için kapıyı seçin (bkz. Şekil 1B, alt panel).
- Kapılı popülasyonu kullanarak yeni bir arsa oluşturun.
- Hücre-miRNA tespiti için X eksenini floresan sinyali 1'e (FS1) ve EV-miRNA tespiti için Y eksenini floresan sinyali 2'ye (FS2) ayarlayın. Floresan etiketli miRNA'ların her biri ile bağımsız olarak transfekte edilen hücreleri kullanarak tek tek floroforlar için kompanzasyon parametreleri ayarlayın. Yeni arsada, ilgilenilen nüfusa kapı.
- EV-miRNA'nın tespiti için FITC kanalını kullanın. Hücre-miRNA sinyalinin değerlendirilmesi için PE kanalını kullanın. Yazılımda, X ekseni için FITC ve Y ekseni için PE seçildiğinde çift floresan popülasyonunun etrafına bir çokgen çizerek hem FITC hem de PE için pozitif olan hücrelerin etrafında bir kapı oluşturun.
- Kapılı nüfus için istatistikleri kaydedin.
- Kapılı popülasyonda hem FITC hem de PE için pozitif olan hücrelerin yanı sıra FITC veya PE için pozitif olan hücrelerin yüzdesini kaydedin.
- Denemedeki ek örnekler veya kontroller için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
4. EV'lerin transfekte edilmiş hücrelerden izole edilmesi
- Serum içeren ortamda kültürlenen hücreler için, çapraz kontaminasyonu önlemek için serumdaki EV'leri tüketin.
- EV tükenmiş serum oluşturmak için, viskoziteyi azaltmak için serumu hücre kültürü ortamında% 50'ye seyreltin ve elde edilen% 50 serumu 18 saat boyunca 110.000 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı (EV içermeyen serum) dikkatlice toplayın ve 0,2 μm'lik bir filtre tertibatı kullanarak filtreleyin. Tam ortam oluşturmak için elde edilen %50 EV içermeyen serumu, bu durumda RPMI artı %10 serumu kullanın.
- EV'leri toplamak için, EV tükenmiş tam ortamı hücrelere ekleyin ve EV'leri inkübasyondan 48 saat sonra toplayın.
NOT: Aşağıda özetlenen protokol Kowal ve ark.14'ten değiştirilmiştir.
- Hücreleri 15 cm'lik doku kültürü kaplarında %80 birleşime kadar büyütün. Protokolün 1. bölümündeki transfeksiyon protokolünü takiben hücreleri 10 mL Opti-MEM içinde hücre-miRNA ve EV-miRNA ile ayrı ayrı transfekte edin.
NOT: Tüm transfeksiyon protokolleri doğrusal olarak ölçeklendirilmez. Öncelikle 15 cm'lik plakalarda transfeksiyon koşullarının uyarlanması ve değerlendirilmesi gerekli olabilir. - 7 saat sonra, transfeksiyon ortamını aspire edin ve EV tükenmiş ortamla (15 mL) değiştirin. EV tükenmiş ortamdaki hücreleri 48 saat boyunca büyütün.
- Şartlandırılmış ortamı hücrelerden çıkarın ve biyogüvenlik kabini içindeki 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne dağıtın. Ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını gidermek için şartlandırılmış ortamı 2000 x g'de 10 °C'de 4 dakika santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
- Süpernatanı 10.000 x g'da 4 °C'de 40 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 0,2 μm'lik bir filtre tertibatı kullanarak filtreleyin.
- Filtrelenmiş hücre kültürü ortamını biyogüvenlik kabini içindeki steril bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Tüpleri birbirine karşı tartın ve dengeleyin. Numuneleri 110.000 x g'da 4 °C'de 90 dakika döndürün. Süpernatanı atın.
- Peleti yıkamak için uygun bir hacimde 1x PBS içinde yeniden süspanse edin ve 90 dakika 4 °C boyunca 110.000 x g'da santrifüjleyin.
NOT: EV peleti, bu çalışmada kullanılan sabit açılı rotor tüpleri için izin verilen maksimum hacme bağlı olarak 60 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edildi. - PBS'yi aspire edin ve EV peletini uygun hacimde (50-100 μL) taze 1x PBS ve girdapta askıya alın. EV'leri daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.
5. EV'lerde hücre-miRNA ve EV-miRNA sinyalinin akış sitometrisi analizi
- Akış sitometrisi analizi için EV süspansiyonu hazırlamak için, EV'leri uygun bir hacimde ultra filtrelenmiş 1x PBS ile seyreltin.
NOT: EV'lerin akış sitometrisi analizi için yükleme hacmi, numunelerdeki EV sayısına göre belirlenmelidir. Kabaca, EV süspansiyonunda ~30.000 parçacık varsa, nihai hacim 1x PBS'de ~500-600 μL olmalıdır. Temiz bir numunede yaklaşık 35-50 partikül/μL bulunur. - Nano boyutlu parçacıkları analiz etmek için nano akış sitometresini veya yeterince güçlü alternatif bir ekipman kullanın.
NOT: Burada Attune NxT nano-flow sitometre kullanılmıştır. - Yazılımı açın ve önerilen kalibrasyon talimatlarını izleyerek cihazı kurun. Performans nano boncukları kullanarak Performans Testini gerçekleştirin. Nano boncuklar standart boyut aralığında tespit edilirse, performans optimaldir. EV parçacıklarının tespiti için uygun akış hızını belirleyin.
- Cihaz akışkanlarını ve dedektör ve lazerlerin performansını doğrulamak için ultra saf filtrelenmiş su kullanarak kalite kontrolünü çalıştırın.
- Deney için uygun kalibrasyon boncuklarını kullanarak, akış sitometresini farklı boyuttaki boncukları doğru bir şekilde algılayacak ve floresan sinyallerini ölçecek şekilde ayarlayın.
NOT: Akış sitometrisi ile EV analizinin kurulumu için ApogeeMix boncukları kullanılmıştır. Bu boncuklar, boyutları 80 nm ila 1300 nm arasında değişen floresan olmayan silika boncuklar ve floresan polistiren boncukların bir karışımını içerir.- Üreticinin protokolüne göre boncuk karışımındaki farklı popülasyonların hassasiyetini ve çözünürlüğünü değerlendirmek için parametreleri ayarlayın. Boncuk popülasyonunu cihaz gürültüsünden çözmek için uygun kapıyı kullanın.
- Analiz için yüklemeden önce EV'leri eşit olarak dağıtmak için numuneleri iyice vorteksleyin.
- Akış sitometrisi veri analizi yazılımını açın ve ultra filtreli PBS'yi tanıtın. Geçitlemenin adım 5.5'teki boncuklara göre uygun parçacık boyutuna karşılık geldiğinden emin olurken, ultra filtrelenmiş PBS kullanarak EV parçacıkları için geçitlemeyi ayarlayın.
- EV'leri akış sitometresinden geçerken analiz etmek için negatif kontrol örneğini yükleyin. X ekseninde FSC'yi ve Y ekseninde SSC'yi çizerken EV sinyallerini yakalayın.
NOT: EV'leri yakalamak için SSC eşiği 300 olarak belirlenmiştir. Toplama hacmi, toplam 145 μL çekilen hacimden 95 μL olarak ayarlandı. Akış hızı 12.5 μL/dk olarak ayarlandı. Analiz 1 x 106 EV partikülleri ile gerçekleştirilmiştir. EV popülasyonu heterojendir ve EV'lerle birlikte izole edilen bazı döküntülere neden olacaktır. FSC ve SSC grafiğindeki genel partikül tespiti, ham EV preparatları kullanıldığında beklenen çok çeşitli bir aralıktaki partikülleri vurgular. - Kapılı popülasyonu kullanarak yeni bir arsa oluşturun.
- Bu sefer, X ekseninde hücre-miRNA tespiti için floresan sinyali 1'i (FS1) ve Y ekseninde EV-miRNA tespiti için floresan sinyali 2'yi (FS2) seçin.
- Tek bir miRNA ile transfekte edilen hücrelerden izole edilen EV örneklerini kullanarak floroforlar için kompanzasyon parametrelerini ayarlayın. Yeni arsada, ilgilenilen EV popülasyonuna kapı.
- Transfekte edilmiş hücrelerden izole edilen EV'lerde floroforla konjuge miRNA'ların ekspresyon analizi için, sırasıyla 1, 1, 370 ve 370 voltaj birimlerine ayarlanmış FSC, SSC, BL400 ve YL400 kanallarını kullanarak EV örneklerini analiz edin (Şekil 2A, B).
- Geçitli nüfus için istatistikleri kaydedin ve bunları histogramları ve nokta grafiklerini kullanarak görselleştirin.
- Denemedeki ek örnekler veya kontroller için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
6. EV'lerde miRNA'ların salınımının qRT-PCR aracılığıyla doğrulanması
- Üreticinin talimatlarını izleyerek miRVana RNA izolasyon kitini kullanarak EV'lerden ve ana hücrelerden RNA'yı çıkarın.
NOT: EV'lerden izole edilen RNA'nın miktar tayini mümkün değildir, çünkü EV'lerden izole edilen toplam RNA miktarı tipik olarak standart bir Nano-damlanın minimum miktar eşiğini geçmez. Bunun nedeni, Agilent Bioanalyzer kullanılarak doğrulanabilen EV örneklerinden ribozomal RNA'nın tükenmesidir. Bu nedenle, EV-RNA nicelemesi için bütünlük puanı genellikle güvenilir değildir ve EV-RNA miktarının gerçek temsili değildir. Bu nedenle, EV-RNA ve hücre-RNA'nın qRT-PCR miktar tayini için, eşit sayıda hücreden izolasyonu takiben eşit hacimlerde RNA izolatları kullanıldı. qRT-PCR'nin normalizasyonu için, daha önce elde edilen RNA dizileme verilerinden belirlendiği gibi, birden fazla örnekte her yerde bulunan miRNA'lar kullanıldı. - Küçük RNA'lara özgü bir ters transkriptaz kiti kullanarak ekstrakte edilen RNA'yı cDNA'ya dönüştürün.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek bir cDNA şablonu ve miRNA'ya özgü primerler kullanarak qRT-PCR reaksiyonunu ayarlayın.
NOT: Doğrulama deneyleri için, hücre-miRNA ve EV-miRNA'nın ekspresyonunu değerlendirmek için miRCURY LNA qRT PCR kiti ve üreticiden gelen ilgili primerler kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, miRNA'nın hücrelerden EV'lere salınımını araştırmak için güçlü bir araç olarak akış sitometrisini kullanıyoruz. Bu protokolü kullanarak, hücre-miRNA ve EV-miRNA ile transfekte edilen hücrelerin akış sitometrisi analizi, hücre-miRNA'ya karşılık gelen sinyal hücrelerde tutulurken, EV-miRNA'ya karşılık gelen floresan sinyalinde sıralı bir azalma ortaya çıkardı. Florofor konjugasyonunun EV'lere miRNA salınımına müdahale etmemesini sağlamak için, miR-451a iki ayrı florofora (yani, Alexa flor 488 ve Alexa flor 750) konjuge edildi ve hücre retansiyonu değerlendirildi. Sonuçlar, transfeksiyon sonrası ayrı florofor sinyallerinin tespiti arasındaki minimum değişkenliği göstermekte ve bu yaklaşımın güvenilirliğini doğrulamaktadır (Şekil 3A,B).
RNA bozunması da dahil olmak üzere hücrelerden floresan etiketli miR-451a'nın kaybını çeşitli nedenler açıklayabileceğinden, hücresel kaybın EV bolluğu ile çakıştığını doğrulamak kritikti. Akış sitometrisi kullanılarak, EV'lerde Alexa fluor-488'e konjuge miR-451a birikimi zamana bağlı bir şekilde gözlemlendi ve miRNA'nın EV'lere verimli bir şekilde paketlendiğine ve nihai olarak salındığına dair kanıt sağladı. Buna karşılık, hücrenin tuttuğu miRNA'ya karşılık gelen floresan sinyali, cel-miR-67 EV'lerde tespit edilmedi (Şekil 4). Bu yeni yaklaşımı kullanan bu bulgular, hücre-miRNA, cel-miR-67 ile karşılaştırıldığında, ek bir EV-miRNA olan miR-150 için önemli ölçüde daha yüksek bir EV/hücre ekspresyon oranı ortaya çıkaran qRT-PCR kullanılarak doğrulandı (Şekil 5).
Şekil 1: Hücrelerdeki sinyallerin tespiti için akış sitometresi parametrelerinin ayarlanması. (A) Hücre floresansının analizi için, yazılım kullanılarak, belirtilen parametreler için vurgulanan voltajlar ayarlandı. Cihaz, numune başına 10.000 hücre kaydedecek şekilde ayarlandı. Denetçi Görünümü , algılama ve analiz için ayarlanan parametreleri onaylar. (B) Hücre floresansının analizi için, FSC parametresi için Eşik , yazılımın sitometre ayarları sekmesi altında 5.000 olarak ayarlanmıştır. Sağ üst panel, veri yakalama için lazer ayarlarını gösterir. Alt paneller, hücrelerin algılanması sırasında etkin bir genel çalışma sayfası gösterir. Numuneler orta akışta çalıştırıldı ve sırasıyla x ekseni ve y ekseni parametreleri olarak FSC-A ve SSC-A oluşturulurken yakalandı. Geçit, ilgilenilen popülasyonun etrafında bir çizim poligonu aracı kullanılarak ayarlandı. Geçit, hücre popülasyonunun çeşitliliğine bağlı olarak ilgilenilen başka bir hücre hattı için farklı olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: EV'lerde sinyal tespiti için akış sitometrisi parametrelerinin ayarlanması. (A) EV'lerin tespiti ve aşağı akış analizi için, akış hızı 12,5 μL/dak olarak ayarlanan toplama hacmi 95 μL olarak ayarlanmıştır. EV algılama için seçilen eşik, kullanılan kalibrasyon boncuklarına bağlı olarak yazılımın cihaz ayarları sekmesi altında 0,3 x1000 idi. FSC, SSC, BL1 ve YL1 için voltajlar sırasıyla 370, 370, 400 ve 400 idi. (B) Heterojen EV popülasyonunu yakalamak ve EV'leri cihazın arka plan gürültüsünden ayırt etmek için geçit kurulumu. EV popülasyonundan gelen arka plan gürültüsünü çözmek için negatif kontrol olarak boş bir PBS örneği (üstte) kullanıldı. EV örneği (altta), ilgilenilen popülasyonun toplam popülasyonun yalnızca %1,8'i olduğunu göstermektedir, çünkü örneklem, boyut aralığında örtüşen parçacıklarla heterojendir. Bununla birlikte, ilgilenilen EV popülasyonunun tespit edilmesini sağlamak için sıkı geçit seçilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Akış sitometrisi ile hücrelerde sinyal algılama. (A) EV-miRNA ve hücre-miRNA'ya karşılık gelen floresan, transfeksiyondan sonra 7 saat ile 72 saat arasında belirtilen zamanlarda hücrelerde tespit edildi. EV-miR-451a'ya (Alexa fluor-488) karşılık gelen sinyal, hücrede tutulan miRNA, cel-miR-67'den gelen sinyale kıyasla zamanla azaldı. (B) Alexa fluor-750 ile etiketlenmiş EV-miR-451a'ya karşılık gelen floresan, miR-488a etiketli Alexa Fluro-451 ile aynı eğilimi gösterdi, bu da floroforun miRNA'ların hücreler tarafından tutulmasını etkilemediğini gösteriyor. Genel olarak, temsili sonuçlar, transfekte edilmiş miRNA'nın, miRNA'nın EV'lere aktarılmasına bağlı olarak endojen miRNA'ya benzer şekilde davrandığını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Akış sitometrisi ile EV'lerde sinyal algılama. EV-miR-451a ve cell-cel-miR-67'ye karşılık gelen floresan, transfeksiyondan 24 saat ve 48 saat sonra EV'lerde tespit edildi. EV-miR-451a'ya (Alexa fluor-488) karşılık gelen sinyal, transfeksiyondan 48 saat sonra EV'lerde yakalandı. Buna karşılık, cel-miR-67 sinyali EV'lerde tespit edilmedi. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, bu deney için kapıyı kurmak için boş bir PBS örneği kullanıldı. Negatif kontrol olarak floresan olmayan karıştırılmış RNA ile transfekte edilen hücrelerden izole edilen EV örnekleri kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: qRT-PCR kullanılarak hücrelerde ve EV'lerde EV-miRNA ve hücre-miRNA'nın miktar tayini. Calu6 hücreleri, her biri 2 nM miR-150 ve cel-miR-67 ile transfekte edildi. EV'ler transfeksiyondan 48 saat sonra toplandı. EV zenginleştirmesi, miR-150 ve cel-miR-67 için transfekte edilmiş Calu6 hücrelerinde EV ekspresyonunun hücresel ekspresyona bölünmesiyle hesaplandı. Calu6 hücrelerindeki miRNA'ların ekspresyonunu ve bunlara karşılık gelen EV'leri karşılaştıran RNA dizileme sonuçlarına dayanarak, miR-30c, endojen bir kontrol ve kat değişikliği hesaplaması için bir normalleştirici olarak kullanıldı. Sunulan veriler bir biyolojik kopyadan alınmıştır ve her veri noktası üçlü qRT-PCR reaksiyonları sunar. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edildi ve p değerleri Welch düzeltmesi ile eşlenmemiş bir t-testi kullanılarak hesaplandı (**p < 0.01). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Güçlü | Zayıf |
| Hücrelerde ve ilgili EV'lerde birden fazla miRNA'nın seçici ihracatının eşzamanlı olarak değerlendirilmesine izin verir | Aktif ve pasif ihracat olgusu arasında ayrım yapmak için ek prosedürler gerektir |
| Ham heterojen popülasyonun değerlendirilmesi mümkündür ve EV popülasyonlarının önceden ayrılmasını gerektirmez. Farklı EV türlerini analiz etmek için kullanılabilir NOT: Farklı parçacık türlerinin tespiti için eşik değer değişecektir |
Düşük hassasiyet, hücrelerde veya EV'lerde sınırlı miRNA konsantrasyonlarının saptanmasına izin vermez. Bu, EV'lerden RNA izolasyonunu takiben aşağı akış qRT-PCR analizinin dahil edilmesiyle aşılabilir |
| MiRNA miktar tayini için kullanılan standart yöntemlere kıyasla kurulum ve analiz için kısa bir süre gerektirir | Farklı ekipman türleri, hücre hatları ve çeşitli floroforlar için standardizasyon protokollerinin olmaması. |
Tablo 1: Protokolün başlıca güçlü ve zayıf yönleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yeni kurulan protokol, EV-miRNA'ların transfeksiyonundan sonra EV'lere miRNA salınımının kinetiğinin yakalanmasını sağlar. Yaklaşım, sitometrenin yeteneklerine bağlı olarak birden fazla EV-miRNA'nın ve hücre-miRNA'nın eşzamanlı analizine izin verir. Ayrıca, akış sitometrisi analizi, EV miRNA biyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlayabilirken, sınırsız değildir. Bununla birlikte, daha kapsamlı bir anlayış için diğer tekniklerle birlikte kullanıldığında bazı sınırlamaların üstesinden gelinebilir.
EV biyolojisinde ortaya çıkan bir ilgi alanı, miRNA'ların EV'lere seçici olarak aktarılmasını anlamaktır15,16. Bu protokol, miRNA'nın seçici dışa aktarımının incelenmesine izin vermek için güçlü bir araç sunarken, kritik zorluklardan biri aktif ve pasif dışa aktarma arasında ayrım yapmaktır. Bir miRNA'nın yeterince yüksek bir konsantrasyonda aşırı eksprese edilmesi, miRNA'nın dışa aktarımını değiştirebileceğinden ve potansiyel olarak uygunsuz pasif yüklemeye neden olabileceğinden dikkatli olunmalıdır. Bu nedenle, seçici ihracatı incelerken miRNA'ların optimal transfeksiyon konsantrasyonlarını belirlemek için deneyler yapmak çok önemlidir.
Ayrıca protokol, nanopartikül izleme analizi (NTA) gibi tamamlayıcı tekniklerle birleştirildiğinde, araştırmacının EV partikül sayısını değerlendirirken aynı zamanda miRNA salınımını da değerlendirmesini sağlar ve EV biyogenez yollarındaki değişiklikler ile miRNA dışa aktarma mekanizmaları arasında ayrım yapma potansiyeline sahiptir. Bu, özellikle bu süreçlerin örtüşen aracıları nedeniyle önemlidir17. MiRNA'ların, EV biyogenezinde yer alanlar da dahil olmak üzere çeşitli fenotipleri etkileyebileceği göz önüne alındığında, miRNA'ların transfeksiyonunu takiben partikül sayısını değerlendirmek ihtiyatlı olacaktır18. Bu engelin üstesinden gelmek için başka bir seçenek, deneysel koşullar altında değişmeden kalan bir EV-miRNA'yı dahil etmek, böylece EV-miRNA ihracatında yer alan yolları vurgularken EV biyogenezinde yer alan faktörleri dışlamak olacaktır.
Birkaç çalışma, endojen miRNA miktar tayini için standart bir yöntem olan qRT-PCR kullanarak miRNA'ları ölçmüştür 10,11,16. Bununla birlikte, miRNA'ların EV'lere salınımını dinamik olarak yakalama yeteneğinden yoksundur. Akış sitometrisini qRT-PCR ile karşılaştırırken, test duyarlılığına ve tasarımına bağlı olarak büyük farklılıklar gösterirler. qRT-PCR oldukça hassas bir teknik olmasına ve teorik olarak minimum miRNA kopya sayılarını ölçme yeteneğine sahip olmasına rağmen, iki numuneyi ayırt etmek, ilgilenilen miRNA'ların kopya sayısında en az 2 kat (%100) fark gerektirir. Öte yandan akış sitometrisi, floresan etiketli miRNA'nın bolluğuna dayalı sinyal tabanlı farklılıkları yakalar ve sinyallerdeki küçük yüzde değişikliklerini ayırt edebilir. Bununla birlikte, düşük duyarlılığı, sınırlı kopya sayılarına sahip miRNA'ların saptanmasını kısıtlar. İki teknik, protokolde belirtildiği gibi birlikte kullanıldığında sinerjik olarak birbirini tamamlar.
Özetle, bu protokol seçici miRNA dışa aktarma dinamiklerini araştırmak için değerli bir araç sunar. Yukarıda belirtilen zorluklara rağmen, bu protokolün gücü, birden fazla miRNA'yı aynı anda analiz etme yeteneğinde yatmaktadır ve miRNA biyolojisinin, bunların ihracatının ve EV biyolojisindeki rollerinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır. Protokolün dikkate alınması gereken başlıca güçlü ve zayıf yönleri Tablo 1'de listelenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Purdue Üniversitesi Akış Sitometrisi Çekirdek Tesisi Direktörü Dr. Jill Hutchcroft'un desteğini ve tavsiyesini kabul ediyoruz. Bu çalışma, A.L.K.'ye R01CA226259 ve R01CA205420, A.L.K.'ye Amerikan Akciğer Derneği İnovasyon Ödülü (ANALA2023) IA-1059916, bir Purdue Paylaşılan kaynak tesisi hibe P30CA023168 ve ABD Dışişleri Bakanlığı tarafından HH'ye verilen amiral gemisi Fulbright Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
