Akış Sitometrisi Kullanarak Hücre Dışı Veziküllere miRNA Salınımının İzlenmesi
Summary
Burada, mikroRNA paketlemesinin dinamiklerini incelemek ve hücre dışı veziküllere (EV’ler) aktarmak için floresan etiketli mikroRNA’ların bolluğunun in vitro değerlendirmesini sağlayan basit bir protokolü açıklıyoruz.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EV’ler), çeşitli farklı hücreler tarafından salgılanan hücresel iletişimin önemli aracılarıdır. Bu EV’ler, proteinler, lipitler ve nükleik asitler (DNA, mRNA’lar, mikroRNA’lar ve diğer kodlamayan RNA’lar) dahil olmak üzere biyoaktif molekülleri bir hücreden diğerine taşıyarak alıcı hücrelerde fenotipik sonuçlara yol açar. Tüm çeşitli EV kargoları arasında, mikroRNA’lar (miRNA’lar), EV’lerdeki açık düzensizlikleri ve bollukları nedeniyle mikro çevreyi şekillendirmedeki ve alıcı hücreleri eğitmedeki rolleri nedeniyle büyük ilgi görmüştür. Ek veriler, birçok miRNA’nın aktif olarak EV’lere yüklendiğini göstermektedir. Bu açık kanıtlara rağmen, ihracatın dinamikleri ve miRNA sıralama mekanizmaları üzerine araştırmalar sınırlıdır. Burada, EV-miRNA yüklemesinin dinamiklerini anlamak ve miRNA dışa aktarımında yer alan makineleri tanımlamak için kullanılabilecek EV-miRNA’nın akış sitometrisi analizini kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu protokolde, EV’lerde zenginleştirildiği ve donör hücrelerden tükendiği önceden belirlenmiş miRNA’lar bir florofora konjuge edilir ve donör hücrelere transfekte edilir. Floresan etiketli miRNA’lar daha sonra EV’lere yüklenmek ve qRT-PCR kullanılarak hücrelerden tükenmek üzere doğrulanır. Hem bir transfeksiyon kontrolü hem de transfekte edilmiş hücre popülasyonunu geçit yapmak için bir araç olarak, floresan etiketli bir hücresel RNA (hücre tutulan ve EV tükenmiş) dahil edilmiştir. Hem EV-miRNA hem de hücre tutulan miRNA ile transfekte edilen hücreler, 72 saat boyunca floresan sinyaller açısından değerlendirilir. EV-miRNA’lara özgü floresan sinyal yoğunluğu, hücrede tutulan miRNA’ya kıyasla hızla azalır. Bu basit protokolü kullanarak, artık miRNA yüklemesinin dinamikleri değerlendirilebilir ve miRNA’ların EV’lere yüklenmesinden sorumlu çeşitli faktörler belirlenebilir.
Introduction
MikroRNA’lar (miRNA’lar), transkripsiyon sonrası gen regülasyonundaki kritik rolleriyle bilinen, kodlamayan küçük RNA’ların en iyi karakterize edilen alt kümelerinden biridir. Çoğu miRNA’nın ekspresyonu ve biyogenezi, çekirdekteki birincil miRNA’ların (pri-miRNA’lar) transkripsiyonu ile başlayan koordineli bir dizi olayı takip eder. Mikroişlemci kompleksi tarafından öncül-miRNA’lara (pre-miRNA’lar) nükleer işlemeyi takiben, pre-miRNA’lar sitoplazmaya aktarılır ve burada RNase III endonükleaz tarafından daha fazla işleme tabi tutulurlar, 21-23 nükleotid olgun miRNA duplekslerinedönüşür 1. İşlenmiş olgun miRNA’nın ipliklerinden biri, hedef haberci RNA’lara (mRNA’lar) bağlanarak hedeflerinbozulmasına veya translasyonel baskılanmasına yol açar 2. MiRNA’ların aynı anda birden fazla farklı hedef mRNA’yı düzenlemedeki pleiotropik rolüne dayanarak, miRNA ekspresyonunun sıkı bir şekilde düzenlenmesi şaşırtıcı değildir3. Gerçekten de, uygunsuz ifade, özellikle kanserde çeşitli hastalık durumlarına katkıda bulunur. MiRNA’ların anormal ekspresyonu sadece hastalığa özgü bir imzayı temsil etmekle kalmaz, aynı zamanda prognostik ve terapötik potansiyel için bir hedef olarak ortaya çıkmıştır 4,5,6. Hücre içi rollerine ek olarak, miRNA’ların özerk olmayan rolleri de vardır. Örneğin, miRNA’lar donör hücreler tarafından seçici olarak EV’lere paketlenebilir ve normal ve hastalık fizyolojisindeçeşitli fenotipik tepkiler ortaya çıkardıkları alıcı bölgelere aktarılabilir 7,8,9.
EV ile ilişkili miRNA’ların fonksiyonel biyomoleküller olduğuna dair açık kanıtlara rağmen, kanser gibi hastalık durumlarında miRNA’ların spesifik alt kümelerinin nasıl düzensiz olduğu ve hücresel makinelerin miRNA’ları nasıl seçip Ev’lere ayırdığı tam olarak anlaşılmamıştır10,11. EV-miRNA’ların mikroçevreyi modüle etmedeki potansiyel rolü göz önüne alındığında, EV’lerin hücreler arası iletişim ve hastalık patogenezindeki rolünü tam olarak aydınlatmak için seçilmiş miRNA’ların ihracatında yer alan mekanizmaları belirlemek çok önemlidir. EV’lere miRNA salınım sürecini anlamak, yalnızca miRNA ihracatının önemli aracılarını vurgulamakla kalmayacak, aynı zamanda potansiyel terapötikler hakkında da fikir verebilir. Bu bilgi düzeyine ulaşmak için, araçların bu yeni deneysel soruları aslına uygun olarak ele alacak şekilde uyarlanması gerekir. Gerçekten de, EV’leri değerlendiren çalışmalar, yeni tekniklerin ve kontrollerin tanıtılması nedeniyle katlanarak artmaktadır 12,13. EV’lere ihraç edilen miRNA’ların bolluğunun değerlendirilmesi ile ilgili olarak, yeni nesil dizileme ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) mevcut standart araçlar olmuştur. Bu araçlar, EV’lerdeki miRNA’ların bolluğunu değerlendirmek için yararlı olsa da, duyarlılıkları ve özgüllükleri konusunda sınırlamalar vardır ve dinamikleri değerlendirmek için bu statik yaklaşımları kullanmak yetersizdir. EV’lere miRNA ihracatının dinamiklerini tanımlamak, özel araçların bir kombinasyonunu gerektirir. Burada, donör hücrelerden miRNA salınımının ve EV’lere dahil edilmesinin dinamiklerini analiz etmek için floresan konjuge miRNA’ları kullanan kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Ayrıca yöntemin avantajlarını ve sınırlamalarını tartışıyoruz ve optimum kullanım için önerilerde bulunuyoruz. Bu yazıda sunulan çok yönlü yöntem, EV’lere miRNA salınımını ve bunların hücresel iletişim ve hastalıktaki potansiyel rollerini incelemekle ilgilenen araştırmacılar için faydalı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yeni kurulan protokol, EV-miRNA’ların transfeksiyonundan sonra EV’lere miRNA salınımının kinetiğinin yakalanmasını sağlar. Yaklaşım, sitometrenin yeteneklerine bağlı olarak birden fazla EV-miRNA’nın ve hücre-miRNA’nın eşzamanlı analizine izin verir. Ayrıca, akış sitometrisi analizi, EV miRNA biyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlayabilirken, sınırsız değildir. Bununla birlikte, daha kapsamlı bir anlayış için diğer tekniklerle birlikte kullanıldığında bazı sınırlamaların üstesi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Purdue Üniversitesi Akış Sitometrisi Çekirdek Tesisi Direktörü Dr. Jill Hutchcroft’un desteğini ve tavsiyesini kabul ediyoruz. Bu çalışma, A.L.K.’ye R01CA226259 ve R01CA205420, A.L.K.’ye Amerikan Akciğer Derneği İnovasyon Ödülü (ANALA2023) IA-1059916, bir Purdue Paylaşılan kaynak tesisi hibe P30CA023168 ve ABD Dışişleri Bakanlığı tarafından HH’ye verilen amiral gemisi Fulbright Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
