Summary
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol dat in vitro beoordeling van de overvloed aan fluorescerend gelabelde microRNA's mogelijk maakt om de dynamiek van microRNA-verpakking en export naar extracellulaire vesikels (EV's) te bestuderen.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn belangrijke mediatoren van cellulaire communicatie die worden uitgescheiden door een verscheidenheid aan verschillende cellen. Deze EV's transporteren bioactieve moleculen, waaronder eiwitten, lipiden en nucleïnezuren (DNA, mRNA's, microRNA's en andere niet-coderende RNA's), van de ene cel naar de andere, wat leidt tot fenotypische gevolgen in de ontvangende cellen. Van alle verschillende EV-ladingen hebben microRNA's (miRNA's) veel aandacht gekregen voor hun rol bij het vormgeven van de micro-omgeving en bij het opleiden van ontvangende cellen vanwege hun duidelijke ontregeling en overvloed aan EV's. Aanvullende gegevens geven aan dat veel miRNA's actief in EV's worden geladen. Ondanks dit duidelijke bewijs is het onderzoek naar de dynamiek van export en mechanismen van miRNA-sortering beperkt. Hier bieden we een protocol met behulp van flowcytometrie-analyse van EV-miRNA dat kan worden gebruikt om de dynamiek van EV-miRNA-belasting te begrijpen en de mechanismen te identificeren die betrokken zijn bij miRNA-export. In dit protocol worden miRNA's waarvan vooraf is bepaald dat ze worden verrijkt in EV's en uitgeput uit donorcellen, geconjugeerd tot een fluorofoor en getransfecteerd in de donorcellen. De fluorescerend gelabelde miRNA's worden vervolgens geverifieerd voor het laden in EV's en uitputting van cellen met behulp van qRT-PCR. Als zowel een transfectiecontrole als een hulpmiddel voor het afschermen van de getransfecteerde populatie van cellen, is een fluorescerend gelabeld cellulair RNA (celbehouden en EV-verarmd) opgenomen. Cellen die zijn getransfecteerd met zowel het EV-miRNA als het celvastgehouden miRNA worden in de loop van 72 uur geëvalueerd op fluorescerende signalen. De intensiteit van het fluorescentiesignaal die specifiek is voor de EV-miRNA's neemt snel af in vergelijking met het door de cel behouden miRNA. Met behulp van dit eenvoudige protocol kan men nu de dynamiek van het laden van miRNA beoordelen en verschillende factoren identificeren die verantwoordelijk zijn voor het laden van miRNA's in EV's.
Introduction
MicroRNA's (miRNA's) zijn een van de best gekarakteriseerde subsets van kleine niet-coderende RNA's, die bekend staan om hun cruciale rol in posttranscriptionele genregulatie. De expressie en biogenese van de meeste miRNA's volgen een gecoördineerde reeks gebeurtenissen die begint met transcriptie van de primaire miRNA's (pri-miRNA's) in de kern. Na nucleaire verwerking door het microprocessorcomplex tot precursor-miRNA's (pre-miRNA's), worden de pre-miRNA's geëxporteerd naar het cytoplasma, waar ze verdere verwerking ondergaan door het RNase III-endonuclease, dat wordt omgesneden tot 21-23 nucleotiderijpe miRNA-duplexen1. Een van de strengen van het verwerkte rijpe miRNA bindt zich aan doelboodschapper-RNA's (mRNA's), wat leidt tot degradatie of translationele onderdrukking van de doelwitten2. Op basis van de pleiotrope rol van miRNA's bij het gelijktijdig reguleren van meerdere diverse doel-mRNA's, is het niet verwonderlijk dat de expressie van miRNA strak wordt gereguleerd3. Ongepaste expressie draagt inderdaad bij aan verschillende ziektetoestanden, vooral bij kanker. De afwijkende expressie van miRNA's vertegenwoordigt niet alleen een ziektespecifieke signatuur, maar is ook naar voren gekomen als een doelwit voor prognostisch en therapeutisch potentieel 4,5,6. Naast hun intracellulaire rollen hebben miRNA's ook niet-autonome rollen. MiRNA's kunnen bijvoorbeeld selectief door donorcellen in EV's worden verpakt en worden geëxporteerd naar ontvangende locaties waar ze verschillende fenotypische reacties opwekken in de normale en ziektefysiologie 7,8,9.
Ondanks duidelijk bewijs dat EV-geassocieerde miRNA's functionele biomoleculen zijn, is het niet volledig duidelijk hoe specifieke subsets van miRNA's worden ontregeld in ziektetoestanden zoals kanker en hoe cellulaire machinerie miRNA's selecteert en sorteert in Evs10,11. Gezien de potentiële rol van EV-miRNA's bij het moduleren van de micro-omgeving, is het van cruciaal belang om de mechanismen te identificeren die betrokken zijn bij de export van geselecteerde miRNA's om de rol van EV's in intercellulaire communicatie en ziektepathogenese volledig op te helderen. Inzicht in het proces van miRNA-afgifte in EV's zal niet alleen belangrijke mediatoren van miRNA-export aan het licht brengen, maar kan ook inzicht geven in potentiële therapieën. Om dit kennisniveau te bereiken, moeten instrumenten worden aangepast om deze nieuwe experimentele vragen getrouw te beantwoorden. Studies die EV's evalueren, groeien exponentieel als gevolg van de introductie van nieuwe technieken en controles 12,13. Met betrekking tot het evalueren van de overvloed aan geëxporteerde miRNA's in EV's, zijn sequencing van de volgende generatie en kwantitatieve reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) de huidige standaardinstrumenten. Hoewel deze instrumenten nuttig zijn voor het evalueren van de overvloed aan miRNA's in EV's, zijn er beperkingen aan hun gevoeligheid en specificiteit, en het gebruik van deze statische benaderingen voor het evalueren van dynamiek is onvoldoende. Het definiëren van de dynamiek van miRNA-export naar EV's vereist een combinatie van gespecialiseerde tools. Hier presenteren we een uitgebreid protocol met behulp van fluorescerend geconjugeerde miRNA's, om de dynamiek van de afgifte van miRNA uit donorcellen en de opname in EV's te analyseren. Ook bespreken we de voordelen en beperkingen van de methode en geven we aanbevelingen voor optimaal gebruik. De veelzijdige methode die in dit artikel wordt gepresenteerd, zal nuttig zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van miRNA-afgifte in EV's en hun mogelijke rol in cellulaire communicatie en ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Als voorwaarde voor het gebruik van deze techniek is identificatie en validatie van selectief geëxporteerde miRNA's vereist. Aangezien verschillende cellijnen variëren op basis van de miRNA-lading die in hun EV's is gesorteerd, wordt aanbevolen om de cellijn van belang en de bijbehorende EV's vóór gebruik te evalueren op miRNA's. Bovendien is transfectie op basis van lipofectamine een van de cruciale stappen in het protocol; Het wordt aanbevolen om de transfectie-efficiëntie vooraf te bepalen voordat het experiment wordt opgezet.
1. Cellen kweken in kweek en transfecteren van cellen met fluorofoor-geconjugeerd EV-miRNA
- Plaat 200.000 tot 400.000 cellen in drievoud in een plaat met 6 putjes in een geschikt kweekmedium. Draai de plaat voorzichtig rond om een gelijkmatige celverdeling te garanderen. Incubeer de cellen totdat ze 70%-80% confluentie bereiken, ongeveer 24-48 uur.
- Voor elk te transfecteren putje verdunt u het transfectiereagens in 100 μL serumvrij medium in een microcentrifugebuis volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: De optimale concentratie lipide moet voorafgaand aan deze opstelling worden bepaald voor de cellijn van interesse. - Voor elk te transfecteren putje verdunt u het met fluorofoor geconjugeerde EV-miRNA (2nM) en cel-miRNA (2nM) afzonderlijk in een microcentrifugebuisje in 100 μL serumvrije media.
OPMERKING: Het totale volume moet worden berekend voor het totale aantal getransfecteerde putjes. In dit protocol werd de fluorescentie geëvalueerd op 7 tijdstippen; daarom was het totale volume 700 μL voor stap 1.2 en 700 μL voor stap 1.3. Om met vertrouwen de positief fluorescerende populatie van cellen vast te leggen, moet de gebruiker bovendien cellen transfecteren met een niet-fluorescerend gecodeerd miRNA en een poort opzetten die deze cellen uitsluit. - Voeg het verdunde RNA-mengsel (uit stap 1.3) toe aan het verdunde transfectiereagens (uit stap 1.2) en meng voorzichtig door het buisje 3-4 keer om te keren. Laat het gecombineerde lipide-RNA-mengsel 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder de gewone kweekmedia uit de cellen en voeg 800 μL serumvrije media toe aan elk putje. Voeg voorzichtig 200 μL van de lipide-RNA-mix (uit stap 1.4) druppelsgewijs toe aan de cellen.
OPMERKING: Opti-MEM-media werden gebruikt voor het transfecteren van de cellijn van belang (Calu6-cellen). Probeer het lipide-RNA-mengsel rechtstreeks aan de kweekmedia toe te voegen en vermijd het toevoegen van het mengsel aan de zijkanten van de plaat.
2. Het oogsten van getransfecteerde cellen op verschillende tijdstippen voor analyse van fluorescentie
- Incubeer de getransfecteerde cellen gedurende 7 uur bij 37 °C.
OPMERKING: Om consistente transfectie van beide miRNA's (EV-miRNA en cel-miRNA) te valideren, worden cellen 3 uur na transfectie verzameld uit één put om de fluorescentie te analyseren met behulp van de flowcytometer. - Verwijder na de incubatietijd van 7 uur het transfectiecomplex uit de putten en vervang het door volledige media.
- Om het tijdspunt van 7 uur te evalueren, oogst je de cellen en was je de cellen drie keer met 1x PBS.
- Als u met aanhangende cellen werkt, voeg dan 200 μL trypsine toe aan een putje en wacht tot de cellen loskomen van de plaat. Breng de losgemaakte cellen over in een microcentrifugebuis en pellet door centrifugatie bij 200xg gedurende 5 minuten.
- Gooi het supernatans voorzichtig weg om te voorkomen dat de celpellet wordt verstoord. Voor de eerste PBS-wasbeurt resuspendeert u de pellet in ~500 μL of 1x PBS en herhaalt u het pelleteren met behulp van de bovenstaande centrifugatiestappen. Herhaal de PBS-wasbeurt nog twee keer.
- Resuspendeer de celpellet in 200 μL 2% paraformaldehyde (PFA)-oplossing en evalueer de fluorescentie.
OPMERKING: Na toevoeging van 2% PFA kan de celpellet 3-4 dagen bij 4 °C worden bewaard.
- Verzamel de resterende tijdstippen volgens de stappen in paragraaf 2.3. Verzamel alle opgeslagen celpellets en ga verder met de stappen in sectie 3.
3. Flowcytometrie-analyse van cel-miRNA- en EV-miRNA-signaal in cellen
- Bereid cellen voor op flowcytometrie-analyse. Filtreer de celsuspensie van sectie 2 tot en met 35 μm zeefkappen die deel uitmaken van de FACS-buizen van polystyreen met ronde bodem om de verwijdering van vuil en celaggregaten mogelijk te maken die de fluorofooranalyse kunnen verstoren.
- Stel het instrument in volgens de kalibratie-instructies. Zet de flowcytometer aan en laat deze voor gebruik minimaal 30 minuten opwarmen. Vul het fluidics-systeem met omhulselvloeistof en controleer en pas de laseruitlijning aan.
- Voer een kwaliteitscontrole uit om de fluïditeit van het instrument te bevestigen. Laad ultrapuur gefilterd water in de flowcytometer en laat het draaien met een geschikt debiet voor voldoende acquisitietijd.
OPMERKING: Het juiste debiet en de juiste acquisitietijd zijn afhankelijk van het celtype dat van belang is, de complexiteit van het monster en de gewenste gegevenskwaliteit. - Open de data-analysesoftware voor flowcytometrie en bevestig de prestaties van de detector en lasers. Stel drempel- en spanningsparameters in voor detectie op basis van de gewenste cellijn en fluoroforen naar keuze.
OPMERKING: Voor alle stroomafwaartse experimenten werden Calu6-cellen gebruikt.- Stel de drempel voor het vastleggen van het signaal voor Calu6-cellen in op FSC 5000. Voer de analyse uit voor 1 x 104 cellen voor elke experimentele herhaling.
- Om rekening te houden met de spectrale overlap tussen verschillende fluoroforen, gebruikt u niet-getransfecteerde cellen en cellen die onafhankelijk zijn getransfecteerd met slechts één van de fluoroforen om compensatiecontroles in te stellen.
- Gebruik voor de detectie van miRNA-export kandidaat-EV-miRNA's (miR-451a en miR-150) geconjugeerd aan Alexa-fluor 488 en een controlecel-miRNA (cel-miR-67) geconjugeerd aan Cy3.
- Voor elk EV-miRNA conjugeert u de fluorofoor aan het 5′-uiteinde van de 5p-streng. Vóór transfectie gloeit u de met fluorofoor geconjugeerde streng tot zijn 100% complementaire 3p-streng.
- Voor de expressieanalyse in getransfecteerde cellen analyseert u de monsters met behulp van de FSC-, SSC-, FITC- en PE-kanalen die zijn ingesteld op respectievelijk 258, 192, 269 en 423 spanningseenheden (Figuur 1A, B).
- Breng het negatieve controlemonster in de flowcytometer in. Leg celsignalen vast na het definiëren van voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC) intensiteiten in een aangepast werkblad.
- Kies in de grafiek FSC voor de X-as, SSC voor de Y-as en gate voor de populatie van belang door er een polygoon omheen te tekenen (zie figuur 1B, onderste paneel).
- Maak een nieuw perceel met behulp van de gated population.
- Stel de X-as in op fluorescentiesignaal 1 (FS1) voor cel-miRNA-detectie en de Y-as op fluorescentiesignaal 2 (FS2) voor EV-miRNA-detectie. Stel compensatieparameters in voor de individuele fluoroforen met behulp van cellen die onafhankelijk zijn getransfecteerd met elk van de fluorescerend gelabelde miRNA's. In het nieuwe perceel, poort op de bevolking van belang.
- Gebruik voor de detectie van EV-miRNA het FITC-kanaal. Gebruik voor de evaluatie van het cel-miRNA-signaal het PE-kanaal. Maak in de software een poort rond de cellen die positief waren voor zowel FITC als PE door een polygoon rond de dubbele fluorescentiepopulatie te tekenen toen FITC werd geselecteerd voor de X-as en PE werd geselecteerd voor de Y-as.
- Noteer de statistieken voor de gated population.
- Noteer het percentage cellen in de gated populatie dat positief is voor zowel FITC als PE, evenals voor cellen die positief zijn voor FITC of PE.
- Herhaal de bovenstaande stappen voor eventuele extra monsters of controles in het experiment.
4. Isoleren van EV's uit getransfecteerde cellen
- Voor cellen die in serumbevattende media worden gekweekt, moet EV's uit het serum worden verwijderd om kruisbesmetting te voorkomen.
- Om EV-verarmd serum te genereren, verdunt u het serum tot 50% in celkweekmedia om de viscositeit te verminderen en centrifugeert u het resulterende 50% serum bij 110.000 x g gedurende 18 uur.
- Vang het supernatans (EV-vrij serum) zorgvuldig op en filtreer het met een filtereenheid van 0,2 μm. Gebruik het resulterende 50% EV-vrije serum om complete media te genereren, in dit geval RPMI plus 10% serum.
- Om EV's te verzamelen, voegt u de EV-verarmde volledige media toe aan de cellen en verzamelt u de EV's 48 uur na incubatie.
OPMERKING: Het hieronder beschreven protocol is aangepast ten opzichte van Kowal et al.14.
- Kweek cellen in weefselkweekschaaltjes van 15 cm tot 80% confluentie. Transfecteer de cellen afzonderlijk met cel-miRNA en EV-miRNA in 10 ml Opti-MEM volgens het transfectieprotocol in sectie 1 van het protocol.
OPMERKING: Niet alle transfectieprotocollen schalen lineair op. Het kan essentieel zijn om eerst de transfectieomstandigheden in platen van 15 cm aan te passen en te evalueren. - Zuig na 7 uur het transfectiemedium op en vervang het door het EV-verarmde medium (15 ml). Kweekcellen gedurende 48 uur in de EV-arme media.
- Verwijder de geconditioneerde media uit de cellen en doseer deze in een centrifugebuis van 50 ml in de bioveiligheidskast. Centrifugeer de geconditioneerde media bij 2000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om dode cellen en celresten te verwijderen. Breng het resulterende supernatans over in een nieuwe buis.
- Centrifugeer het supernatans bij 10.000 x g gedurende 40 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatans en filtreer het met een filtereenheid van 0,2 μm.
- Breng de gefilterde celkweekmedia over naar een steriele ultracentrifugebuis in de bioveiligheidskast. Weeg en balanceer de buizen tegen elkaar. Centrifugeer de monsters gedurende 90 minuten bij 4 °C op 110.000 x g . Gooi de supernatant weg.
- Resuspendeer de pellet in een geschikte hoeveelheid van 1x PBS om te wassen en centrifugeer bij 110.000 x g gedurende 90 min 4 °C.
OPMERKING: De EV-pellet werd geresuspendeerd in 60 ml 1x PBS op basis van het maximaal toegestane volume voor de rotorbuizen met vaste hoek die in dit onderzoek zijn gebruikt. - Zuig PBS op en suspendeer de EV-pellet in een geschikt volume (50-100 μL) verse 1x PBS en vortex. Bewaar EV's bij -80 °C voor later gebruik.
5. Flowcytometrie-analyse van cel-miRNA- en EV-miRNA-signaal in EV's
- Om EV-suspensie voor te bereiden voor flowcytometrieanalyse, verdunt u EV's in een geschikt volume ultragefilterde 1x PBS.
OPMERKING: Het laadvolume voor de flowcytometrie-analyse van EV's moet worden bepaald op basis van het aantal EV's in monsters. Grofweg, als er ~30.000 deeltjes in de EV-suspensie zitten, zou het uiteindelijke volume ~500-600 μL in 1x PBS moeten zijn. Een schoon monster bevat ongeveer 35-50 deeltjes/μL. - Gebruik de nano-flowcytometer of een alternatieve apparatuur die krachtig genoeg is om deeltjes van nanoformaat te analyseren.
OPMERKING: Hier werd Attune NxT nano-flow cytometer gebruikt. - Open de software en stel het instrument in volgens de aanbevolen kalibratie-instructies. Voer de prestatietest uit met behulp van prestatienanokorrels. Als de nanokorrels worden gedetecteerd in het standaardmaatbereik, zijn de prestaties optimaal. Bepaal het juiste debiet voor de detectie van EV-deeltjes.
- Voer een kwaliteitscontrole uit met behulp van ultrapuur gefilterd water om de fluïditeit van het instrument en de prestaties van de detector en lasers te bevestigen.
- Gebruik kalibratieparels die geschikt zijn voor het experiment en stel de flowcytometer in om nauwkeurig kralen van verschillende grootte te detecteren en fluorescentiesignalen te meten.
OPMERKING: Voor het opzetten van EV-analyse door middel van flowcytometrie werden ApogeeMix-korrels gebruikt. Deze korrels bevatten een mengsel van niet-fluorescerende silicakorrels en fluorescerende polystyreenkorrels, variërend in grootte van 80 nm tot 1300 nm.- Stel de parameters in om de gevoeligheid en resolutie van verschillende populaties in de kralenmix te beoordelen volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik de juiste gating om de kraalpopulatie van het instrumentgeluid op te lossen.
- Draai de monsters grondig om EV's gelijkmatig te verdelen voordat ze voor analyse worden geladen.
- Open de data-analysesoftware voor flowcytometrie en introduceer ultragefilterde PBS. Stel de gating in voor EV-deeltjes met behulp van ultragefilterd PBS en zorg ervoor dat de gating overeenkomt met de juiste grootte van de deeltjes op basis van de korrels in stap 5.5.
- Laad het negatieve controlemonster om EV's te analyseren terwijl ze door de flowcytometer gaan. Leg EV-signalen vast terwijl u FSC op de X-as en SSC op de Y-as uitzet.
OPMERKING: De SSC-drempel voor het vastleggen van EV's is vastgesteld op 300. Het acquisitievolume werd vastgesteld op 95 μL van een totaal van 145 μL getrokken volume. Het debiet werd vastgesteld op 12,5 μL/min. De analyse werd uitgevoerd met 1 x 106 EV-deeltjes. De EV-populatie is heterogeen en zal resulteren in wat puin dat samen met EV's wordt geïsoleerd. De algemene deeltjesdetectie in de FSC vs. SSC-plot markeert deeltjes in een divers bereik, wat te verwachten is bij het gebruik van ruwe EV-preparaten. - Maak een nieuw perceel met behulp van de gated population.
- Kies deze keer fluorescentiesignaal 1 (FS1) voor cel-miRNA-detectie op de X-as en fluorescentiesignaal 2 (FS2) voor EV-miRNA-detectie op de Y-as.
- Stel compensatieparameters in voor de fluoroforen met behulp van de EV-monsters die zijn geïsoleerd uit cellen die zijn getransfecteerd met een enkel miRNA. In het nieuwe perceel gaat de poort naar de EV-populatie van belang.
- Voor de expressieanalyse van fluorofoor-geconjugeerde miRNA's in EV's geïsoleerd uit de getransfecteerde cellen, analyseert u de EV-monsters met behulp van de FSC-, SSC-, BL1- en YL1-kanalen die zijn ingesteld op respectievelijk 370, 370, 400 en 400 spanningseenheden (Figuur 2A, B).
- Leg de statistieken voor de gated populatie vast en visualiseer ze met behulp van histogrammen en dot plots.
- Herhaal de bovenstaande stappen voor eventuele extra monsters of controles in het experiment.
6. Validatie van de afgifte van miRNA's in EV's door middel van qRT-PCR
- Extraheer RNA uit EV's en oudercellen met behulp van de miRVana RNA-isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Kwantificering van RNA geïsoleerd uit EV's is niet mogelijk omdat de totale hoeveelheid RNA geïsoleerd uit EV's doorgaans niet de minimale hoeveelheidsdrempel van een standaard nanodruppel overschrijdt. Dit is te wijten aan de uitputting van ribosomaal RNA uit EV-monsters, die kunnen worden gevalideerd met behulp van de Agilent Bioanalyzer. De integriteitsscore voor EV-RNA-kwantificering is dus meestal niet betrouwbaar en is niet de ware weergave van de hoeveelheid EV-RNA. Daarom werden voor qRT-PCR-kwantificering van het EV-RNA en cel-RNA gelijke volumes RNA-isolaten gebruikt na isolatie uit een gelijk aantal cellen. Voor normalisatie van qRT-PCR werden miRNA's gebruikt die alomtegenwoordig aanwezig zijn in meerdere monsters, zoals bepaald op basis van eerder verkregen RNA-sequencinggegevens. - Zet het geëxtraheerde RNA om in cDNA met behulp van een reverse transcriptase-kit die specifiek is voor kleine RNA's.
- Stel de qRT-PCR-reactie in met behulp van een cDNA-sjabloon en miRNA-specifieke primers volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Voor validatie-experimenten werden miRCURY LNA qRT PCR-kit en bijbehorende primers van de fabrikant gebruikt om de expressie van cel-miRNA en EV-miRNA te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier gebruiken we flowcytometrie als een krachtig hulpmiddel om de afgifte van miRNA van de cellen in EV's te onderzoeken. Met behulp van dit protocol onthulde flowcytometrie-analyse van cellen getransfecteerd met cel-miRNA en EV-miRNA een sequentiële afname van het fluorescentiesignaal dat overeenkomt met EV-miRNA, terwijl het signaal dat overeenkomt met het cel-miRNA in de cellen werd vastgehouden. Om ervoor te zorgen dat fluorofoorconjugatie de afgifte van miRNA in EV's niet verstoort, werd miR-451a geconjugeerd aan twee afzonderlijke fluoroforen (d.w.z. Alexa fluor 488 en Alexa fluor 750), en werd celretentie geëvalueerd. De resultaten wijzen op een minimale variabiliteit tussen de detectie van de afzonderlijke fluorofoorsignalen na transfectie, wat de betrouwbaarheid van deze benadering bevestigt (Figuur 3A,B).
Omdat verschillende redenen het verlies van fluorescerend gelabeld miR-451a uit de cellen zouden kunnen verklaren, inclusief RNA-afbraak, was het van cruciaal belang om te verifiëren dat cellulair verlies samenviel met EV-overvloed. Met behulp van flowcytometrie werd accumulatie van miR-451a geconjugeerd aan Alexa fluor-488 in EV's op een tijdsafhankelijke manier waargenomen, wat bewijs leverde van efficiënte verpakking en uiteindelijke afgifte van het miRNA in EV's. Daarentegen werd het fluorescentiesignaal dat overeenkomt met het door de cel behouden miRNA, cel-miR-67, niet gedetecteerd in de EV's (Figuur 4). Deze bevindingen met behulp van deze nieuwe benadering werden gevalideerd met behulp van qRT-PCR, die een significant hogere EV/celexpressieverhouding onthulde voor miR-150, een extra EV-miRNA, in vergelijking met het cel-miRNA, cel-miR-67 (Figuur 5).
Figuur 1: Opstelling van flowcytometerparameters voor de detectie van signalen in cellen. (A) Voor de analyse van de celfluorescentie werden met behulp van de software de gemarkeerde spanningen ingesteld voor de aangegeven parameters. Het instrument is ingesteld om 10.000 cellen per monster op te nemen. De Inspector View bevestigt de parameters die zijn ingesteld voor detectie en analyse. (B) Voor de analyse van celfluorescentie werd de drempel voor de FSC-parameter ingesteld op 5.000 onder het tabblad cytometerinstellingen van de software. Het paneel rechtsboven toont de laserinstellingen voor het vastleggen van gegevens. De onderste panelen tonen een actief globaal werkblad tijdens de voortgang van de detectie van cellen. De monsters werden uitgevoerd met een gemiddelde stroom en gevangen terwijl FSC-A en SSC-A werden vastgesteld als respectievelijk x-as en y-as parameters. De omheining werd geplaatst met behulp van een tekenpolygoongereedschap rond de populatie van belang. De gating kan anders zijn voor een andere cellijn van belang, afhankelijk van de diversiteit van de celpopulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Opstelling van flowcytometrieparameters voor signaaldetectie in EV's. (A) Voor de detectie en stroomafwaartse analyse van EV's werd het acquisitievolume ingesteld op 95 μL en de stroomsnelheid op 12,5 μL/min. De gekozen drempel voor EV-detectie was 0,3 x1000 onder het tabblad instrumentinstellingen van de software op basis van de gebruikte kalibratieparels. Spanningen voor FSC, SSC, BL1 en YL1 waren respectievelijk 370, 370, 400 en 400. (B) Opzetten van gating voor het vastleggen van heterogene EV-populatie en het onderscheiden van EV's van de achtergrondruis van het instrument. Een blanco PBS-monster (boven) werd gebruikt als negatieve controle om achtergrondruis van de EV-populatie op te lossen. EV-steekproef (onder) laat zien dat de populatie van belang slechts 1,8% van de totale populatie is, omdat de steekproef heterogeen is met overlappende deeltjes in het groottebereik. Er werd echter gekozen voor strenge gating om de detectie van de EV-populatie van belang te garanderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Signaaldetectie in cellen door middel van flowcytometrie. (A) Fluorescentie die overeenkomt met EV-miRNA en cel-miRNA werd gedetecteerd in cellen op tijdstippen die werden aangegeven tussen 7 uur en 72 uur na transfectie. Het signaal dat overeenkomt met EV-miR-451a (Alexa fluor-488) nam in de loop van de tijd af in vergelijking met het signaal van het cel-behouden-miRNA, cel-miR-67. (B) Fluorescentie die overeenkomt met EV-miR-451a gelabeld met Alexa fluor-750 vertoonde dezelfde trend als de Alexa Fluro-488 gelabeld miR-451a, wat aangeeft dat de fluorofoor geen invloed heeft op de retentie van miRNA's door de cellen. Over het algemeen geven de representatieve resultaten aan dat het getransfecteerde miRNA zich op dezelfde manier gedraagt als het endogene miRNA op basis van de export van het miRNA naar EV's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Signaaldetectie in EV's door middel van flowcytometrie. Fluorescentie die overeenkomt met EV-miR-451a en cell-cel-miR-67 werd gedetecteerd in EV's 24 uur en 48 uur na transfectie. Het signaal dat overeenkomt met EV-miR-451a (Alexa fluor-488) werd 48 uur na transfectie opgevangen in EV's. Daarentegen werd het signaal voor cel-miR-67 niet gedetecteerd in EV's. Een blanco PBS-monster werd gebruikt om de gating voor dit experiment op te zetten, zoals weergegeven in figuur 2B. EV-monsters geïsoleerd uit cellen die waren getransfecteerd met niet-fluorescerend gecodeerd RNA werden gebruikt als negatieve controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kwantificering van EV-miRNA en cel-miRNA in cellen en EV's met behulp van qRT-PCR. Calu6-cellen werden getransfecteerd met elk 2 nM miR-150 en cel-miR-67. EV's werden 48 uur na transfectie verzameld. EV-verrijking werd berekend als de verhouding van EV-expressie gedeeld door cellulaire expressie in getransfecteerde Calu6-cellen voor miR-150 en cel-miR-67. Op basis van RNA-sequencingresultaten waarin de expressie van miRNA's in Calu6-cellen en hun overeenkomstige EV's werd vergeleken, werd miR-30c gebruikt als een endogene controle en een normalisator voor de berekening van vouwveranderingen. De gepresenteerde gegevens zijn afkomstig van één biologische replicatie, waarbij elk datapunt drievoudige qRT-PCR-reacties vertoont. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD en p-waarden werden berekend met behulp van een ongepaarde t-toets met Welch-correctie (**p < 0,01). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Sterktes | Zwakke punten |
| Maakt gelijktijdige beoordeling mogelijk van selectieve export van meerdere miRNA's in cellen en respectievelijke EV's | Aanvullende procedures vereisen om onderscheid te maken tussen actieve en passieve exportverschijnselen |
| Beoordeling van ruwe heterogene populaties is mogelijk en vereist geen voorafgaande scheiding van EV-populaties. Kan worden gebruikt om verschillende soorten EV's te analyseren OPMERKING: De drempel voor detectie van verschillende soorten deeltjes varieert |
Lage gevoeligheid maakt het niet mogelijk om beperkte concentraties miRNA's in cellen of EV's te detecteren. Dit kan worden ondervangen door stroomafwaartse qRT-PCR-analyse op te nemen na RNA-isolatie uit EV's |
| Vereist een korte tijd voor het opzetten en analyseren in vergelijking met standaardmethoden die worden gebruikt voor miRNA-kwantificering | Gebrek aan standaardisatieprotocollen voor verschillende soorten apparatuur, cellijnen en verschillende fluoroforen. |
Tabel 1: De belangrijkste sterke en zwakke punten van het protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het nieuw opgestelde protocol maakt het mogelijk om de kinetiek van miRNA-afgifte in EV's vast te leggen na transfectie van EV-miRNA's. De aanpak maakt gelijktijdige analyse van meerdere EV-miRNA's en cel-miRNA's mogelijk, afhankelijk van de mogelijkheden van de cytometer. Bovendien, hoewel flowcytometrie-analyse waardevolle inzichten kan opleveren in de biologie van EV-miRNA, is het niet zonder beperkingen. Hoewel sommige van de beperkingen kunnen worden overwonnen wanneer ze worden gebruikt in combinatie met andere technieken voor een meer omvattend begrip.
Een opkomend interessegebied in de biologie van EV's is het begrijpen van de selectieve export van miRNA's naar EV's15,16. Hoewel dit protocol een krachtig hulpmiddel biedt om selectieve export van miRNA te bestuderen, is een van de kritieke uitdagingen het onderscheid tussen actieve en passieve export. Voorzichtigheid is geboden, aangezien het tot overexpressie brengen van een miRNA in een voldoende hoge concentratie de export van miRNA kan veranderen, wat mogelijk kan leiden tot ongepaste passieve belasting. Daarom is experimenteren om de optimale transfectieconcentraties van miRNA's te bepalen cruciaal bij het bestuderen van selectieve export.
Bovendien stelt het protocol, in combinatie met complementaire technieken zoals nanodeeltjesvolganalyse (NTA), de onderzoeker in staat om het aantal EV-deeltjes te beoordelen en tegelijkertijd de miRNA-afgifte te evalueren en heeft het de potentie om onderscheid te maken tussen veranderingen in EV-biogeneseroutes en miRNA-exportmechanismen. Dit is vooral belangrijk vanwege de overlappende bemiddelaars van deze processen17. Gezien het feit dat miRNA's verschillende fenotypes kunnen beïnvloeden, waaronder enkele die betrokken zijn bij EV-biogenese, zou het verstandig zijn om het aantal deeltjes na transfectie van miRNA's te evalueren18. Om deze hindernis te overwinnen, zou een andere optie zijn om een EV-miRNA op te nemen dat ongewijzigd blijft onder de experimentele omstandigheden, waardoor factoren die betrokken zijn bij EV-biogenese worden uitgesloten en de routes die betrokken zijn bij EV-miRNA-export worden benadrukt.
Verschillende studies hebben miRNA's gekwantificeerd met behulp van qRT-PCR, een standaardmethode voor endogene miRNA-kwantificering 10,11,16. Het ontbreekt echter aan de mogelijkheid om de afgifte van miRNA's in EV's dynamisch vast te leggen. Bij het vergelijken van flowcytometrie met qRT-PCR verschillen ze sterk op basis van de gevoeligheid en het ontwerp van de test. Hoewel qRT-PCR een zeer gevoelige techniek is en theoretisch in staat is om het minimale aantal miRNA-kopieën te kwantificeren, vereist het onderscheiden van twee monsters ten minste een 2-voudig (100%) verschil in het aantal kopieën van miRNA's van belang. Flowcytometrie daarentegen legt op signalen gebaseerde verschillen vast op basis van de overvloed aan fluorescerend gelabeld miRNA en kan kleine procentuele veranderingen in signalen differentiëren. Desalniettemin beperkt de lage gevoeligheid de detectie van miRNA's met een beperkt aantal kopieën. De twee technieken vullen elkaar synergetisch aan wanneer ze in combinatie worden gebruikt, zoals aangegeven in het protocol.
Samengevat biedt dit protocol een waardevol hulpmiddel om de dynamiek van selectieve miRNA-export te onderzoeken. Ondanks de bovengenoemde uitdagingen ligt de kracht van dit protocol in het vermogen om meerdere miRNA's tegelijk te analyseren, wat bijdraagt aan een beter begrip van de miRNA-biologie, hun export en hun rol in EV-biologie. De belangrijkste sterke en zwakke punten van het protocol waarmee rekening moet worden gehouden, zijn vermeld in tabel 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We erkennen de steun en het advies van Dr. Jill Hutchcroft, directeur van de Flow Cytometry Core Facility aan de Purdue University. Dit werk werd ondersteund door R01CA226259 en R01CA205420 aan A.L.K., een American Lung Association Innovation Award (ANALA2023) IA-1059916 aan A.L.K., een Purdue Shared resource facility grant P30CA023168, en een vlaggenschip Fulbright Doctoral Scholarship toegekend door het Department of the State, VS aan HH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
