Summary
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per visualizzare le reti di microtubuli nelle giunzioni neuromuscolari e nelle cellule muscolari. In combinazione con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l'analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.
Abstract
La rete di microtubuli è una componente essenziale del sistema nervoso. Le mutazioni in molte proteine regolatorie dei microtubuli sono associate a disturbi dello sviluppo neurologico e malattie neurologiche, come la proteina Tau associata ai microtubuli per le malattie neurodegenerative, la proteina di recisione dei microtubuli Spastin e Katanin 60 causano rispettivamente paraplegia spastica ereditaria e anomalie dello sviluppo neurologico. Il rilevamento di reti di microtubuli nei neuroni è vantaggioso per chiarire la patogenesi dei disturbi neurologici. Tuttavia, le piccole dimensioni dei neuroni e la disposizione densa dei fasci di microtubuli assonali rendono difficile la visualizzazione delle reti di microtubuli. In questo studio, descriviamo un metodo per la dissezione della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari, nonché l'immunocolorazione della α-tubulina e della proteina Futsch associata ai microtubuli per visualizzare le reti di microtubuli in Drosophila melanogaster. La giunzione neuromuscolare ci permette di osservare sia i microtubuli pre che post-sinaptici, e le grandi dimensioni delle cellule muscolari nella larva di Drosophila consentono una chiara visualizzazione della rete di microtubuli. Qui, mutando e sovraesprimendo la Katanina 60 in Drosophila melanogaster, e quindi esaminando le reti di microtubuli nella giunzione neuromuscolare e nelle cellule muscolari, riveliamo accuratamente il ruolo regolatore della Katanina 60 nel neurosviluppo. Pertanto, combinato con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l'analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.
Introduction
I microtubuli (MT), come uno dei componenti strutturali del citoscheletro, svolgono un ruolo importante in diversi processi biologici, tra cui la divisione cellulare, la crescita e la motilità cellulare, il trasporto intracellulare e il mantenimento della forma cellulare. La dinamica e la funzione dei microtubuli sono modulate dalle interazioni con altre proteine, come MAP1, MAP2, Tau, Katanina e Kinesina 1,2,3,4,5.
Nei neuroni, i microtubuli sono essenziali per lo sviluppo e il mantenimento di assoni e dendriti. Le anomalie nei microtubuli portano a disfunzioni e persino alla morte dei neuroni. Ad esempio, nel cervello dei malati di Alzheimer, l'iperfosforilazione della proteina Tau riduce la stabilità della rete di microtubuli, causando irregolarità neurologiche6. Pertanto, l'esame delle reti di microtubuli contribuirà alla comprensione del neurosviluppo e della patogenesi delle malattie neurologiche.
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi periferica formata tra un terminale dell'assone del motoneurone e una fibra muscolare, che è un eccellente e potente sistema modello per lo studio della struttura e delle funzioni sinaptiche7. Futsch è una proteina della Drosophila omologa alla proteina legante i microtubuli MAP1B presente nei mammiferi8. È espresso solo nei neuroni e svolge un ruolo nello sviluppo dei pulsanti sinaptici del NMJ 8,9. Nel wild-type, i fasci filamentosi che corrono lungo il centro dei processi NMJ sono visualizzati mediante immunocolorazione con anti-Futsch. Quando raggiunge l'estremità di NMJ, questo fascio ha la capacità di formare un anello costituito da microtubuli o di perdere la sua struttura filamentosa, risultando in un aspetto diffuso e punteggiato10. Le anse dei microtubuli sono associate a coni di crescita in pausa, il che suggerisce che l'array di microtubuli è stabile11. Pertanto, possiamo determinare indirettamente lo sviluppo stabile dei microtubuli nella NMJ mediante colorazione Futsch. Le grandi dimensioni delle cellule muscolari nella larva di Drosophila consentono una chiara visualizzazione della rete di microtubuli. I fattori che influenzano la stabilità della rete di microtubuli possono essere trovati analizzando la densità e la forma dei microtubuli. Allo stesso tempo, lo stato della rete di microtubuli delle cellule muscolari può essere verificato in modo incrociato con il risultato della NMJ per ottenere conclusioni più complete.
Molti protocolli sono stati impiegati per studiare la rete e la dinamica dei microtubuli. Tuttavia, queste ricerche si sono spesso concentrate su studi in vitro 12,13,14,15,16. In alternativa, alcuni esperimenti in vivo hanno impiegato la microscopia elettronica per rilevare il citoscheletro17. In base al legame specifico di anticorpi marcati con fluorescenza o coloranti chimici a proteine o DNA, i metodi qui presentati consentono di rilevare reti di microtubuli nella NMJ a livello di singoli neuroni in vivo, con risultati corroborati da osservazioni in cellule muscolari. Questo protocollo è semplice, stabile e ripetibile se combinato con i potenti strumenti genetici disponibili in Drosophila melanogaster, consentendo una vasta gamma di esami fenotipici e screening genetici per il ruolo delle proteine regolatorie della rete di microtubuli nel sistema nervoso in vivo.
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Protocol
1. Dissezione delle larve
NOTA: La soluzione salina emolinfa-simile (HL3.1)18 e la soluzione fissante paraformaldeide al 4% (PFA)19,20 vengono utilizzate a temperatura ambiente perché i microtubuli depolimerizzano quando la temperatura è troppo bassa.
- Scegli una larva vagante di 3° stadio con una lunga pinza smussata. Lavarlo con HL3.1 e posizionarlo sul piatto di dissezione sotto lo stereomicroscopio.
NOTA: La larva errante di 3° stadio è identificata dallo spiracolo anteriore ramificato e striscia intorno al tubo a circa 96 h (25 °C)21. - Posizionare la larva con il lato dorsale o ventrale rivolto verso l'alto. Identificare il lato dorsale dalle due lunghe trachee e il ventrale dalle cinture dentellari addominali.
- A seconda del tessuto da osservare, optare per la dissezione dorsale o ventrale. Ciò consentirà una visione più precisa e dettagliata della specifica area di interesse. Per l'osservazione della NMJ e delle cellule muscolari, tagliare rispettivamente le regioni larvali, dorsale e ventrale.
- Appunta gli uncini per la bocca e la coda. Regolare i perni per mantenere la larva in uno stato esteso. Aggiungere una goccia di HL3.1 alla larva per evitare che si secchi.
NOTA: L'HL 3.1 senza Ca2+ può essere utilizzato per ridurre al minimo la contrazione dei muscoli durante la dissezione. - Usa le forbici da dissezione per fare un piccolo taglio trasversale vicino all'estremità posteriore, ma non tagliare l'estremità posteriore. Quindi tagliare lungo la linea mediana ventrale verso l'estremità anteriore.
- Inserire quattro spille per insetti sui quattro angoli della larva. Regolare nuovamente gli spilli degli insetti in modo che la larva sia allungata al massimo in tutte le direzioni.
- Usa le pinze per rimuovere gli organi interni senza danneggiare i muscoli.
2. Fissazione
- Aggiungere 100 μL di PFA (4%) per immergere le carcasse per 40 minuti mentre le carcasse sono ancora appuntate sul piatto di dissezione.
ATTENZIONE: Vengono adottate misure di protezione efficaci per evitare il contatto diretto con la pelle o l'inalazione, poiché il PFA è un pericolo. - Smontare i perni e trasferire il campione in una provetta per microcentrifuga da 2 mL. Risciacquare il PFA con 1 soluzione salina tamponata con fosfato contenente lo 0,2% di Triton X-100 (0,2% PBST) per riempire una provetta da microcentrifuga da 2 ml per 10 minuti sullo shaker di decolorazione a 15 giri/min. Ripetere il processo di lavaggio 5 volte.
3. Immunocitochimica
- Immergere le carcasse in un agente bloccante (5% di siero di capra in 0,2% PBST) e bloccare per 40 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere l'agente bloccante e sostituirlo con 200 μL dell'anticorpo primario (ad es. anti-α-tubulina, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) diluito con PBST allo 0,2% a 4 °C per una notte. Visualizza i microtubuli muscolari mediante immunocolorazione con anti-tubulina monoclonale α. L'anti-Futsch può riflettere indirettamente la morfologia dei microtubuli nella NMJ.
- Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, lavare le larve con PBST allo 0,2% per 10 min.
- Incubare le larve con 200 μL di anticorpo secondario (ad es. capra anti-Mouse-488, 1:1000) diluito con PBST allo 0,2% a temperatura ambiente per 1,5 ore al buio.
- Successivamente, aggiungere un colorante nucleare come lo ioduro TO-PRO(R) 3 (T3605) a una concentrazione di 1:1000 nel tubo di incubazione per 30 minuti durante la colorazione dei microtubuli al buio20,22.
- Risciacquare l'anticorpo secondario e il colorante nucleare con PBST allo 0,2% per 10 minuti. Ripeti 5 volte al buio.
4. Montaggio
- Posizionare la carcassa larvale allo 0,2% di PBST su un vetrino e regolarla al microscopio stereoscopico. Assicurarsi che la superficie interna della carcassa larvale sia rivolta verso l'alto e che tutte le carcasse larvali siano disposte come desiderato.
- Assorbire la soluzione PBST in eccesso con una salvietta e aggiungere delicatamente una goccia di mezzo di montaggio antisbiadimento.
- Posizionare un vetrino coprioggetti sul vetrino per coprire le larve sezionate lentamente e delicatamente per evitare la formazione di bolle.
- Applicare lo smalto per unghie intorno al vetrino coprioggetti. Posizionare il vetrino nello spazio buio per ridurre l'attenuazione della fluorescenza.
5. Acquisizione delle immagini
- Per acquisire le immagini, utilizzare un microscopio confocale a scansione laser, selezionare l'obiettivo a immersione in olio 60x (apertura numerica 1,42) o simile e regolare la potenza e la lunghezza d'onda del laser in base all'esperimento.
- Per identificare l'NMJ, acquisire immagini nel muscolo 4 nel segmento A3 (come mostrato nella posizione nella Figura 1F). Selezionare un laser a 488 nm per attivare la α-tubulina o Futsch e 543 nm per attivare la traccia di imaging HRP. Regolare i parametri su una dimensione del fotogramma di 800 pixel x 800 pixel, uno zoom digitale di 2,0 e un intervallo di imaging di 0,8 μm in NMJ (Figura 2).
- Per identificare i microtubuli nel muscolo, acquisire immagini del muscolo 2 nel segmento A3-A5 (come mostrato nella posizione nella Figura 1G) poiché ha meno rami tracheali. Scegli un laser da 488 nm per attivare la α-tubulina e un laser da 635 nm per attivare la traccia di imaging T3605. Regolare i parametri su una dimensione del fotogramma di 1024 pixel x 1024 pixel, uno zoom digitale di 3,0 e un intervallo di imaging di 0,4 μm nelle cellule muscolari (Figura 3).
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Representative Results
Abbiamo dimostrato una procedura passo-passo per visualizzare la rete di microtubuli sia nelle giunzioni neuromuscolari (NMJ) che nelle cellule muscolari. Dopo la dissezione secondo il diagramma schematico (Figura 1A-E), viene eseguita l'immunocolorazione e le immagini vengono successivamente osservate e raccolte con un microscopio confocale laser o un microscopio stereoscopico a fluorescenza (Figura 1F,G).
Sia l'organizzazione dei microtubuli pre che post-sinaptica della NMJ potrebbe essere marcata con anti-α-tubulina e, selezionando lo spessore dello strato del microscopio confocale a scansione laser, verrebbe visualizzata la morfologia dei microtubuli di diverse fette (Figura 2A-C). Futsch è stato utilizzato anche per il tracciamento neurale rivelando l'organizzazione dei microtubuli negli assoni dei neuroni. L'anti-HRP viene utilizzato per marcare la membrana neuronale 10,23,24. La co-colorazione con anticorpi anti-Futsch e anti-HRP viene eseguita per rilevare lo stato dei microtubuli negli assoni dei neuroni. La colorazione Futsch può riflettere l'abbondanza di microtubuli stabili nei neuroni presinaptici di NMJ9. Lo chaperone E specifico per la tubulina (TBCE) svolge un ruolo cruciale nello sviluppo del citoscheletro MT. Quando il TBCE viene abbattuto nei neuroni presinaptici, il segnale di anti-Futsch diventa più debole e più sottile, e la colorazione nei bottoni terminali non è evidente o assente23. La tau è una proteina associata ai microtubuli che ha un ruolo importante nell'assemblaggio e nella stabilizzazione dei microtubuli25,26. In Drosophila con espressione ectopica della proteina Tau umana wild-type e umana mutante, è stata rivelata una diminuzione dell'intensità del segnale Futsch ai terminali NMJ20. Secondo i risultati della colorazione Futsch, l'intensità della colorazione del tronco assonale era più forte di quella dei rami (Figura 2D-F). I microtubuli all'estremità dei rami sono meno stabili e più inclini a cambiamenti morfologici, quindi la dinamica dei microtubuli può essere riflessa colorando i microtubuli terminali.
Anche i cambiamenti morfologici dei microtubuli possono essere facilmente visualizzati22. Le anse dei microtubuli possono essere colorate con anti-Futsch e anti-α-tubulina. Inoltre, la forma di un singolo anello può essere visualizzata chiaramente, il che facilita l'analisi quantitativa. Ad esempio, la katanina è una proteina che recide i microtubuli e svolge un ruolo importante nella regolazione della dinamica dei microtubuli. È stato riportato che la subunità catalitica Katanin 60 ha un effetto sulla morfologia dei microtubuli22. Mao ha costruito il mutante Katanina 60 mediante escissione mediata dall'elemento P e uas-Katanina 60 inserendo pUAST-attB-Katanin 60 nel secondo cromosoma a 51D. L'aumento delle anse dei microtubuli causato dalle mutazioni della Katanina 6017A è stato chiaramente dimostrato (Figura 2A,B,D,E). Inoltre, nella sovraespressione della Katanina 60, è stato possibile osservare in modo significativo anche brevi frammenti di MT all'interno dei bottoni terminali (Figura 2C).
La rete di microtubuli può essere osservata colorando con anticorpi α-tubulina nelle cellule muscolari. Una rete di microtubuli che si estendeva intorno al nucleo era chiaramente visibile (Figura 3A). La proteina di recisione dei microtubuli, la Katanina, regola la distribuzione della rete di microtubuli22. Nel mutante Katanin 6017A , le cellule muscolari avevano un'intensità di MT perinucleare significativamente aumentata e mostravano fasci più forti rispetto al tipo selvatico (Figura 3B). È stata rappresentata la frammentazione delle fibre dei microtubuli causata dalla sovraespressione di Katanina 60 (Figura 3C). Pertanto, il protocollo consente la visualizzazione della rete di microtubuli sia nei neuroni che nelle cellule muscolari.
Figura 1. Procedura di dissezione dorsale della larva di Drosophila . (A-E) Procedura per la preparazione delle carcasse larvali (modificata dal21). (A) Inserire due spilli ciascuno nei ganci della bocca e nella coda di una larva. (B) Utilizzare le forbici da dissezione per eseguire un piccolo taglio trasversale vicino all'estremità posteriore. (C) Tagliare lungo la linea mediana ventrale verso l'estremità anteriore. (D) Inserire quattro spille per insetti ai quattro angoli della larva. (E) Usa le pinze per rimuovere gli organi interni e regola la posizione dei perni per posizionare la larva in una posizione appropriata per la fotografia. (F) La falloidina viene utilizzata per marcare il citoscheletro per visualizzare il muscolo e l'HRP viene utilizzata per etichettare la membrana cellulare dei neuroni. La regione osservata del NMJ è limitata al muscolo 4 nel segmento A3, co-colorato con anti-HRP (verde) e falloidina (magenta). Il pannello di destra mostra una rappresentazione schematica della struttura muscolare locale. La dimensione del fotogramma di 1024 pixel x 1024 pixel, lo zoom digitale di 0,6 e un intervallo di imaging di circa 4 μm utilizzando un obiettivo 10x (apertura numerica 0,45). (G) La regione osservata delle cellule muscolari è limitata al muscolo 2 nei segmenti da A3 a A5, colorati con falloidina (magenta). La singola sezione viene catturata da un microscopio stereoscopico a fluorescenza. Barra della scala: 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Immagini confocali di microtubuli all'interno di NMJ mediante anti-α-tubulina o anti-Futsch. I terminali NMJ del controllo w1118 (A), del mutante Katanin 60 17A (B) e della sovraespressione neuronale di Katanin 60 (C), co-colorati con anti-HRP (rosso) e anti-α-tubulina (verde) sono mostrati nella colonna di sinistra. Le immagini sono proiezioni da z-stack completi attraverso l'intero muscolo 4 NMJ del segmento addominale A3. La colonna centrale mostra un'immagine più chiara dei microtubuli nei terminali NMJ rimuovendo i microtubuli dal muscolo. La colonna di destra illustra la morfologia dei microtubuli nei bouton sinaptici utilizzando il software di analisi. Barra della scala: 1 μm. Terminali NMJ di diversi genotipi co-colorati con anti-HRP (rosso) e anti-Futsch (verde) (D-F). I loop MT erano indicati da frecce. Barra graduata: 5 μm. Questa cifra è stata adattata da22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Colorazione della rete di microtubuli perinucleari nelle cellule muscolari larvali di Drosophila . (A-C) I muscoli larvali sono co-colorati con anti-α-tubulina (verde) per mostrare la rete dei microtubuli e T3605 (blu) per mostrare il nucleo per il controllo w1118 (A), Katanina 60 17A mutante (B) e Katanina 60 sovraespressione nel sistema muscolare (C). Le immagini sono proiezioni di z-stack completi dall'aspetto dei microtubuli al centro del nucleare. Barra graduata: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui viene descritto un protocollo per la dissezione e l'immunocolorazione delle giunzioni neuromuscolari larvali e delle cellule muscolari della Drosophila . Ci sono diversi punti essenziali da considerare. In primo luogo, evitare lesioni ai muscoli osservati è fondamentale durante il processo di dissezione. Potrebbe valere la pena fissare il filetto prima di rimuovere gli organi interni per evitare il contatto diretto tra le pinze e i muscoli. Per evitare danni muscolari o la separazione dall'epidermide larvale, è importante assicurarsi che la velocità dello scuotitore non superi i 15 giri/min durante il lavaggio e l'incubazione. Inoltre, è necessario un controllo preciso sull'estensione della pelle per garantire una fotografia chiara e completa della morfologia NMJ. Si consiglia di condurre esperimenti preliminari per ottimizzare la concentrazione anticorpale, la fissazione, il blocco e i tempi di incubazione. La durata fissa è limitata a circa 40 min. Troppo corto o troppo lungo non favorisce l'immunocolorazione della rete di microtubuli.
I microtubuli nei neuroni sono densamente impacchettati e difficili da visualizzare chiaramente utilizzando la microscopia convenzionale. Rispetto ai neuroni, le cellule muscolari della Drosophila sono notevolmente grandi, con il muscolo 2 del segmento A3 che misura fino a 40 μm x 150 μm, rendendolo suscettibile di imaging ad alta risoluzione. Pertanto, l'utilizzo di cellule muscolari di Drosophila per studiare la regolazione delle proteine associate alla rete di microtubuli è un approccio intuitivo e lucido che ha un valore significativo nella convalida dei fenotipiNMJ 20,22,23. Rispetto al precedente metodo27, abbiamo cambiato la direzione di dissezione dalla dorsale all'addome per ottenere un oggetto non ostruito. Il tampone di eluizione del muscolo con PBST allo 0,2% è relativamente delicato e aiuta a preservare l'integrità muscolare.
Ci sono ancora alcune limitazioni a questo approccio. Come proteina legante i microtubuli, Futsch è espressa esclusivamente nei neuroni e può rappresentare indirettamente i microtubuli polimerizzati. Tuttavia, se solo Futsch viene utilizzato per visualizzare la rete di microtubuli durante lo screening dell'interazione, alcune proteine candidate potrebbero non essere rilevate. α-tubulina o β-tubulina possono rappresentare direttamente la rete di microtubuli, tuttavia, queste due proteine presentano sia pre-sinaptico che postsinaptico e talvolta è difficile distinguere. Inoltre, un gran numero di eterodimeri di α/β-tubulina sono distribuiti nel citoplasma, il che significa che la marcatura della α-tubulina o della β-tubulina potrebbe non essere adatta per l'imaging dal vivo, poiché è possibile osservare contemporaneamente sia la tubulina polimerizzata che quella non polimerizzata.
L'osservazione dei microtubuli, dai motoneuroni alle cellule muscolari, può fornire una comprensione completa dei meccanismi di movimento dal punto di vista dei circuiti neurali, facilitando lo studio dei processi di sviluppo neurologico e della patogenesi delle malattie neurologiche. La visualizzazione della rete di microtubuli in diversi sistemi modello è utile per verificare la funzione genica da più prospettive utilizzando questo protocollo. Questo metodo può essere utilizzato anche per osservare i recettori postsinaptici della NMJ, il che è utile per lo studio della comunicazione tra le sinapsi e della plasticità sinaptica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Ying Xiong per le discussioni e i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è sostenuto da una sovvenzione della National Science Foundation of China (NSFC) a C. M. (31500839).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
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