Summary
ここでは、神経筋接合部と筋細胞の微小管ネットワークを可視化するための詳細なプロトコルを紹介します。ショウ ジョウバエのmelanogasterの強力な遺伝用具と結合されて、このプロトコルは神経系のmicrotubuleネットワークの規定蛋白質の役割のための遺伝のスクリーニングそしてmicrotubule原動力の分析を非常に促進する。
Abstract
微小管ネットワークは、神経系の不可欠な構成要素です。多くの微小管調節タンパク質の変異は、神経発達障害や神経疾患に関連しており、微小管関連タンパク質タウから神経変性疾患、微小管切断タンパク質スパスチンおよびカタニン60は、それぞれ遺伝性痙性対麻痺および神経発達異常を引き起こします。神経細胞内の微小管ネットワークの検出は、神経疾患の病態解明に有利である。しかし、ニューロンのサイズが小さく、軸索微小管束が密集しているため、微小管ネットワークの可視化は困難です。本研究では、ショウジョウバエの微小管ネットワークを可視化するために、幼虫の神経筋接合部と筋細胞を解剖し、α-チューブリンと微小管関連タンパク質Futschの免疫染色を行う方法について述べる。神経筋接合部はシナプス前部とシナプス後部の両方の微小管を観察することを可能にし、ショウジョウバエ幼虫の筋肉細胞のサイズは微小管ネットワークの明瞭な可視化を可能にします。本研究では、ショウジョウバエのカタニン60を変異させて過剰発現させ、神経筋接合部や筋細胞の微小管ネットワークを調べることで、神経発達におけるカタニン60の制御的役割を正確に明らかにしました。従って、ショウジョウバエのmelanogasterの強力な遺伝用具と結合されて、このプロトコルは神経系のmicrotubuleネットワークの規定する蛋白質の役割のための遺伝のスクリーニングそしてmicrotubuleの原動力の分析を非常に促進する。
Introduction
微小管(MT)は、細胞骨格を構成する構成要素の1つとして、細胞分裂、細胞増殖と運動性、細胞内輸送、細胞形状の維持など、さまざまな生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。微小管の動態と機能は、MAP1、MAP2、タウ、カタニン、キネシンなどの他のタンパク質との相互作用によって調節されます1,2,3,4,5。
ニューロンでは、微小管は軸索と樹状突起の発達と維持に不可欠です。微小管の異常は、機能不全やニューロンの死さえも引き起こします。例えば、アルツハイマー病患者の脳では、タウタンパク質の過剰リン酸化により微小管ネットワークの安定性が低下し、神経学的不規則性が引き起こされます6。したがって、微小管ネットワークを調べることは、神経発達と神経疾患の病因の理解に貢献します。
神経筋接合部(NMJ)は、運動ニューロンの軸索末端と筋線維の間に形成される末梢シナプスであり、シナプスの構造と機能を研究するための優れた強力なモデルシステムです7。フッチはショウジョウバエのタンパク質で、哺乳類に見られる微小管結合タンパク質MAP1Bと相同である8。ニューロンにのみ発現し、NMJのシナプスボタンの発達に関与している8,9。野生型では、NMJ突起の中心に沿って走る糸状束を抗Futschで免疫染色することで可視化します。NMJの末端に達すると、この束は微小管からなるループを形成するか、またはその糸状構造を失い、びまん性および点状の外観をもたらす能力を有する10。微小管ループは一時停止した成長円錐と関連しており、微小管アレイが安定していることを示唆している11。そのため、フッチ染色によりNMJにおける微小管の安定な発生を間接的に決定することができます。ショウジョウバエの幼虫の筋肉細胞のサイズが大きいため、微小管ネットワークを明確に視覚化できます。微小管ネットワークの安定性に影響を与える要因は、微小管の密度と形状を分析することで見つけることができます。同時に、筋肉細胞の微小管ネットワークの状態をNMJの結果と交差検証して、より包括的な結論を得ることができます。
微小管のネットワークとダイナミクスを調べるために、多くのプロトコルが採用されています。しかし、これらの研究はしばしばin vitro研究に焦点を当てている12,13,14,15,16。或いは、いくつかのin vivo実験では、細胞骨格を検出するために電子顕微鏡法が用いられている17。蛍光標識抗体または化学色素のタンパク質またはDNAへの特異的結合によると、ここで紹介する方法により、NMJの微小管ネットワークをin vivoの個々のニューロンレベルで検出することができ、その結果は筋肉細胞での観察によって裏付けられています。このプロトコルは、ショウジョウバエのメラノガスターで利用可能な強力な遺伝ツールと組み合わせると、シンプルで安定しており、反復性があり、生体内の神経系における微小管ネットワーク調節タンパク質の役割について、多様な表現型検査および遺伝子スクリーニングを可能にします。
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Protocol
1.幼虫の解剖
注:解剖液の血リンパ様生理食塩水(HL3.1)18と固定液4%パラホルムアルデヒド(PFA)19,20は、温度が低すぎると微小管が解重合するため、室温で使用します。
- 長い鈍い鉗子を持つ徘徊する3番目の 幼虫を選びます。HL3.1で洗浄し、実体顕微鏡下の解剖皿に置きます。
注:徘徊する第3齢幼虫は、枝分かれした前気孔によって識別され、約96時間(25°C)21で管の周りを這います。 - 背側または腹側を上にして幼虫を配置します。背側は2本の長い気管で、腹側は腹部の歯状突起帯で識別します。
- 観察する組織に応じて、背側または腹側の解剖を選択します。これにより、特定の対象領域をより正確かつ詳細に表示できます。NMJと筋細胞の観察のために、幼虫の背側と腹側をそれぞれ切り開きます。
- 口のフックと尻尾をピンで留めます。ピンを調整して、幼虫を伸ばした状態に保ちます。幼虫が乾燥するのを防ぐために、HL3.1を一滴加えます。
注:Ca2+ -free HL 3.1は、解剖中の筋肉の収縮を最小限に抑えるために使用できます。 - 解剖ハサミを使用して、後端の近くに小さな横方向の切り込みを入れますが、後端を切り落とさないでください。次に、腹側正中線に沿って前端に向かって切断します。
- 幼虫の四隅に4本の昆虫ピンを挿入します。幼虫がすべての方向に最大限に伸びるように昆虫ピンを再調整します。
- 鉗子を使用して、筋肉を傷つけずに内臓を取り除きます。
2.固定
- 100 μL の PFA(4%)を添加し、枝肉を解剖皿に固定したまま 40 分間浸漬します。
注意: PFAは危険であるため、皮膚との直接接触や吸入を避けるために効果的な保護対策が講じられています。 - ピンを取り外し、サンプルを2 mLの微量遠心チューブに移します。0.2% Triton X-100(0.2% PBST)を含む1xリン酸緩衝生理食塩水でPFAを洗い流し、脱色シェーカーで15 rpmで10分間、2 mL微量遠心チューブを満たします。洗浄プロセスを5回繰り返します。
3. 免疫細胞化学
- 枝肉をブロッキング剤(0.2%PBST中の5%ヤギ血清)に浸し、室温で40分間ブロッキングします。
- ブロッキング剤を除去し、0.2% PBSTで希釈した一次抗体200 μL(例:抗α-チューブリン、1:1000、抗フッチュ、1:50)を4°Cで一晩希釈したものと交換します。モノクローナル抗αチューブリンによる免疫染色により、筋肉微小管を可視化します。抗Futschは、NMJの微小管形態を間接的に反映することができます。
- 一次抗体のインキュベート後、幼虫を0.2%PBSTで10分間洗浄します。
- 幼虫を200 μLの二次抗体(例:ヤギ抗マウス-488、1:1000)と0.2%PBSTで希釈し、室温で暗所で1.5時間インキュベートします。
- 次に、TO-PRO(R) 3 ヨウ化物 (T3605) などの核色素を 1:1000 の濃度でインキュベーションチューブに 30 分間添加し、暗所で微小管を染色します20,22。
- 二次抗体と核色素を0.2% PBSTで10分間洗い流します。暗闇の中で5回繰り返します。
4. 取り付け
- 幼虫の死骸を0.2%PBSTに入れたスライドガラスに置き、実体顕微鏡で調整します。幼虫の死骸の内面が上を向いており、すべての幼虫の死骸が希望どおりに配置されていることを確認してください。
- 余分なPBST溶液をワイプで吸収し、褪色防止封入剤を静かに一滴加えます。
- スライドにカバーガラスを置き、解剖した幼虫をゆっくりと優しく覆い、気泡を防ぎます。
- カバーガラスの周りにマニキュアを塗ります。スライドを暗い場所に置いて、蛍光の減衰を減らします。
5. 画像取得
- 画像を取得するには、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用し、60倍の油浸対物レンズ(開口数1.42)などを選択し、実験に基づいてレーザー出力と波長を調整します。
- NMJを同定するには、セグメントA3の筋肉4の画像をキャプチャします( 図1Fの位置に示されているように)。488 nmレーザーを選択してαチューブリンまたはFutschを活性化し、543 nmレーザーを選択してHRPイメージングトラックを活性化します。パラメータを800ピクセル×800ピクセルのフレームサイズ、2.0のデジタルズーム、NMJの0.8μmのイメージング間隔に調整します(図2)。
- 筋肉の微小管を特定するには、気管枝が少ないセグメントA3-A5の筋肉2( 図1Gの位置に示されているように)の画像を撮影します。αチューブリンの活性化には488 nmレーザーを、T3605イメージングトラックの活性化には635 nmレーザーをお選びください。パラメータを1024ピクセル×1024ピクセルのフレームサイズ、3.0のデジタルズーム、および筋肉細胞の0.4μmのイメージング間隔に調整します(図3)。
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Representative Results
私たちは、神経筋接合部(NMJ)と筋肉細胞の両方の微小管ネットワークを可視化するための段階的な手順を示しました。模式図(図1A-E)に従って解剖した後、免疫染色を行い、その後、レーザー共焦点顕微鏡または実体蛍光顕微鏡で画像を観察して収集します(図1F、G)。
NMJのシナプス前部とシナプス後部の両方の微小管構成を抗αチューブリンで標識することができ、レーザー走査型共焦点顕微鏡の層厚を選択することにより、異なるスライスの微小管形態が表示されます(図2A-C)。Futschは、ニューロンの軸索における微小管の組織化を明らかにすることにより、神経追跡にも使用されています。抗HRPは、神経細胞膜10,23,24を標識するために使用されます。抗Futsch抗体および抗HRP抗体との共染色を行い、ニューロンの軸索の微小管の状態を検出します。フッチ染色は、NMJ9のシナプス前ニューロンにおける安定な微小管の存在量を反映している可能性があります。チューブリン特異的シャペロンE(TBCE)は、MT細胞骨格の発生に重要な役割を果たします。TBCEがシナプス前ニューロンでノックダウンされると、抗Futschのシグナルは弱く薄くなり、末端ブートンでの染色は自明でないか、または存在しない23。タウは微小管関連タンパク質であり、微小管の集合と安定化に重要な役割を果たす25,26。ヒト野生型および変異ヒトタウタンパク質の異所性発現を伴うショウジョウバエでは、NMJ末端におけるFutschシグナルの強度の低下が明らかにされている20。フッチ染色の結果によると、軸索幹の染色強度は枝の染色強度よりも強かった(図2D-F)。枝末端の微小管は安定性が低く、形態学的変化を起こしやすいため、末端の微小管を染色することで微小管の動態を反映させることができます。
微小管の形態学的変化も容易に可視化することができる22。微小管ループは、抗Futschおよび抗α-チューブリンで染色できます。さらに、1つのループの形状を明瞭に表示できるため、定量的な分析が容易になります。例えば、カタニンは微小管を切断するタンパク質であり、微小管動態の調節に重要な役割を果たしています。触媒サブユニットであるカタニン60は、微小管22の形態に影響を及ぼすことが報告されている。毛沢東は、P元素を介した切除によりカタニン60変異体を、51Dの2番目の染色体にpUAST-attB-カタニン60を挿入してuas-カタニン60を構築した。カタニン6017A変異によって引き起こされる微小管ループの増加が明確に示されました(図2A、B、D、E)。さらに、カタニン60の過剰発現では、末端ブートン内に短いMT断片も有意に観察されました(図2C)。
微小管ネットワークは、筋細胞内のα-チューブリン抗体で染色することで観察できます。核の周囲に広がる微小管のネットワークがはっきりと見えました(図3A)。微小管切断タンパク質カタニンは、微小管ネットワーク22の分布を調節する。 カタニン6017A 変異体では、筋細胞は野生型と比較して、核周囲MT強度が有意に増加し、より強い束を示しました(図3B)。 カタニン60 の過剰発現によって引き起こされる微小管線維の断片化が示されました(図3C)。従って、プロトコルはニューロンおよび筋肉細胞両方のmicrotubuleネットワーク視覚化を可能にする。
図 1. ショウジョウバエ 幼虫の背側解剖手順。 (A-E)幼虫の死骸を準備する手順(21から変更)。(A)幼虫の口鉤と尾にそれぞれ2本のピンを差し込みます。(B)解剖ハサミを使用して、後端の近くに小さな横切り込みを入れます。(C)腹側正中線に沿って前端に向かって切断する。(D)幼虫の四隅に虫ピンを4本挿入する。(ウ)鉗子を使用して内臓を切除し、ピンの位置を再調整して、幼虫を写真撮影に適した位置に配置します。(F)ファロイジンは細胞骨格を標識して筋肉を可視化するために使用され、HRPはニューロンの細胞膜を標識するために使用されます。NMJの観察領域は、抗HRP(緑色)およびファロイジン(マゼンタ)で共染色されたセグメントA3の筋肉4に限定されています。右のパネルは、局所的な筋肉構造の模式図を示しています。フレームサイズ1024画素×1024画素、デジタルズーム0.6、10倍対物レンズ(開口数0.45)による撮像間隔約4μm。(g)筋細胞の観察領域は、ファロイジン(マゼンタ)で染色されたセグメントA3〜A5の筋肉2に限定されています。単一切片は実体蛍光顕微鏡で捉えられます。スケールバー:500 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図 2.抗αチューブリンまたは抗フッチュによるNMJ内の微小管の共焦点画像。w1118コントロールのNMJ末端(A)、カタニン60 17A変異体(B)、および抗HRP(赤)および抗αチューブリン(緑)で共染色されたカタニン60の神経過剰発現(C)を左列に示します。画像は、腹部セグメントA3の筋肉4NMJ全体を通る完全なzスタックからの投影です。中央の列は、筋肉から微小管を取り除くことにより、NMJ末端の微小管のより鮮明な画像を示しています。右の列は、シナプスブートン中の微小管の形態を解析ソフトで示したものです。スケールバー:1 μm。 抗HRP(赤)および抗フッチ(緑)(D-F)で共染色した異なる遺伝子型のNMJ末端。MTループは矢印で示されました。スケールバー:5 μm。この図は平成22年度から改作したものである。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図 3.ショウジョウバエの幼虫の筋肉細胞のPerinuclear microtubuleネットワークの染色。(A-C)幼虫の筋肉を抗α-チューブリン(緑)で共染色して微小管ネットワークを示し、T3605(青)でw1118コントロールの核(A)、カタニン6017A変異体(B)および筋肉系におけるカタニン60の過剰発現(C)を示します。画像は、微小管の出現から核の中心までの完全なzスタックからの投影です。スケールバー:10 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、 ショウジョウバエ の幼虫の神経筋接合部および筋肉細胞の解剖および免疫染色に関するプロトコルについて説明します。考慮すべき重要なポイントがいくつかあります。まず、解剖プロセスでは、観察された筋肉の損傷を避けることが重要です。鉗子と筋肉の直接接触を防ぐために、内臓を切除する前にフィレットを固定する価値があるかもしれません。筋肉の損傷や幼虫の表皮からの分離を避けるために、洗浄およびインキュベーション中にシェーカーの速度が15rpmを超えないようにすることが重要です。さらに、NMJの形態を鮮明かつ完全に撮影するためには、皮膚の伸展を正確に制御する必要があります。抗体の濃度、固定、ブロッキング、およびインキュベーション時間を最適化するために、予備実験を実施することをお勧めします。固定時間は約40分に制限されています。短すぎたり長すぎたりしても、微小管ネットワークの免疫染色は助長されません。
ニューロンの微小管は密集しており、従来の顕微鏡では鮮明に可視化することが困難です。ショウジョウバエの筋肉細胞は神経細胞に比べて著しく大きく、セグメントA3の筋肉2は最大40μm×150μmで、高解像度のイメージングに適しています。したがって、ショウジョウバエの筋細胞を利用して微小管ネットワーク関連タンパク質の調節を調べることは、NMJ表現型を検証する上で重要な価値を持つ直感的で明快なアプローチです20,22,23。以前の方法27と比較して、遮るもののない対象物を得るために、解剖方向を背側から腹部に変更しました。0.2%PBSTを含む筋肉の溶出バッファーは比較的穏やかで、筋肉の完全性を維持するのに役立ちます。
このアプローチにはまだいくつかの制限があります。微小管結合タンパク質として、Futschはニューロンにのみ発現し、重合した微小管を間接的に表すことができます。しかし、相互作用スクリーニング中に微小管ネットワークを可視化するためにFutschのみを使用すると、一部の候補タンパク質が見落とされる可能性があります。α-チューブリンまたはβ-チューブリンは微小管ネットワークを直接表すことができますが、これら2つのタンパク質はシナプス前部とシナプス後部の両方を示し、区別が困難な場合があります。さらに、細胞質内には多数のα/β-チューブリンヘテロ二量体が分布しているため、重合チューブリンと非重合チューブリンの両方が同時に観察できるため、α-チューブリンまたはβ-チューブリンの標識はライブイメージングに適していない可能性があります。
運動ニューロンから筋細胞までの微小管を観察することで、運動機構を神経回路の視点から包括的に理解することができ、神経発達過程や神経疾患の病態解明に容易になります。異なるモデル系における微小管ネットワークの可視化は、このプロトコールを用いて多角的に遺伝子機能を検証する上で有益です。この方法は、NMJのシナプス後受容体の観察にも使用でき、シナプスとシナプス可塑性の間のコミュニケーションの研究に有益です。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
論文に関する議論とコメントをしてくれたYing Xiong博士に感謝します。この研究は、中国国家科学基金会(NSFC)からC.M.(31500839)への助成金によって支援されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
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