Summary
Nous présentons ici un protocole détaillé pour visualiser les réseaux de microtubules dans les jonctions neuromusculaires et les cellules musculaires. Combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.
Abstract
Le réseau de microtubules est une composante essentielle du système nerveux. Des mutations dans de nombreuses protéines régulatrices des microtubules sont associées à des troubles neurodéveloppementaux et à des maladies neurologiques, telles que la protéine Tau associée aux microtubules aux maladies neurodégénératives, la protéine sectionnante des microtubules Spastin et Katanin 60 provoquent respectivement une paraplégie spastique héréditaire et des anomalies neurodéveloppementales. La détection de réseaux de microtubules dans les neurones est avantageuse pour élucider la pathogenèse des troubles neurologiques. Cependant, la petite taille des neurones et la disposition dense des faisceaux de microtubules axonaux rendent difficile la visualisation des réseaux de microtubules. Dans cette étude, nous décrivons une méthode de dissection de la jonction neuromusculaire larvaire et des cellules musculaires, ainsi que l’immunomarquage de la α-tubuline et de la protéine de Futsch associée aux microtubules pour visualiser les réseaux de microtubules chez Drosophila melanogaster. La jonction neuromusculaire nous permet d’observer à la fois les microtubules pré et post-synaptiques, et la grande taille des cellules musculaires de la larve de drosophile permet une visualisation claire du réseau de microtubules. Ici, en mutant et en surexprimant Katanin 60 chez Drosophila melanogaster, puis en examinant les réseaux de microtubules dans la jonction neuromusculaire et les cellules musculaires, nous révélons avec précision le rôle régulateur de Katanin 60 dans le neurodéveloppement. Par conséquent, combiné aux puissants outils génétiques de Drosophila melanogaster, ce protocole facilite grandement le criblage génétique et l’analyse de la dynamique des microtubules pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux.
Introduction
Les microtubules (MT), en tant que l’un des composants structurels du cytosquelette, jouent un rôle important dans divers processus biologiques, notamment la division cellulaire, la croissance et la motilité cellulaires, le transport intracellulaire et le maintien de la forme cellulaire. La dynamique et la fonction des microtubules sont modulées par des interactions avec d’autres protéines, telles que MAP1, MAP2, Tau, Katanine et Kinésine 1,2,3,4,5.
Dans les neurones, les microtubules sont essentiels au développement et au maintien des axones et des dendrites. Des anomalies dans les microtubules entraînent un dysfonctionnement et même la mort des neurones. Par exemple, dans le cerveau des patients atteints de la maladie d’Alzheimer, l’hyperphosphorylation de la protéine Tau réduit la stabilité du réseau de microtubules, provoquant des irrégularités neurologiques6. Ainsi, l’examen des réseaux de microtubules contribuera à une compréhension du neurodéveloppement et de la pathogenèse des maladies neurologiques.
La jonction neuromusculaire (NMJ) est la synapse périphérique formée entre une terminaison axonale de motoneurone et une fibre musculaire, qui est un système modèle excellent et puissant pour l’étude de la structure et des fonctions synaptiques7. Futsch est une protéine de la drosophile qui est homologue à la protéine de liaison aux microtubules MAP1B que l’on trouve chez les mammifères8. Il ne s’exprime que dans les neurones et joue un rôle dans le développement des boutons synaptiques de la JNM 8,9. Dans le type sauvage, les faisceaux filamenteux qui longent le centre des processus NMJ sont visualisés par immunomarquage avec un anti-Futsch. Lorsqu’il atteint l’extrémité de la JNM, ce faisceau a la capacité soit de former une boucle constituée de microtubules, soit de perdre sa structure filamenteuse, ce qui donne un aspect diffus et ponctué10. Les boucles de microtubules sont associées à des cônes de croissance en pause, ce qui suggère que le réseau de microtubules est stable11. Par conséquent, nous pouvons déterminer indirectement le développement de microtubules stables dans la JNM par coloration de Futsch. La grande taille des cellules musculaires de la larve de drosophile permet une visualisation claire du réseau de microtubules. Les facteurs affectant la stabilité du réseau de microtubules peuvent être trouvés en analysant la densité et la forme des microtubules. Simultanément, l’état du réseau de microtubules des cellules musculaires peut être vérifié de manière croisée avec le résultat de la JNM pour obtenir des conclusions plus complètes.
De nombreux protocoles ont été utilisés pour étudier le réseau et la dynamique des microtubules. Cependant, ces recherches se sont souvent concentrées sur des études in vitro 12,13,14,15,16. Alternativement, certaines expériences in vivo ont utilisé la microscopie électronique pour détecter le cytosquelette17. Du fait de la liaison spécifique d’anticorps marqués par fluorescence ou de colorants chimiques à des protéines ou à de l’ADN, les méthodes présentées ici permettent la détection de réseaux de microtubules dans les JNM au niveau des neurones individuels in vivo, avec des résultats corroborés par des observations dans les cellules musculaires. Ce protocole est simple, stable et reproductible lorsqu’il est combiné avec les puissants outils génétiques disponibles chez Drosophila melanogaster, permettant une gamme variée d’examens phénotypiques et de criblages génétiques pour le rôle des protéines régulatrices du réseau de microtubules dans le système nerveux in vivo.
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Protocol
1. Dissection des larves
REMARQUE : La solution de dissection solution saline de type hémolymphatique (HL3.1)18 et la solution de fixation à 4% de paraformaldéhyde (PFA)19,20 sont utilisées à température ambiante car les microtubules se dépolymérisent lorsque la température est trop basse.
- Repérez une larve errante du 3e stade à l’aide d’une longue pince émoussée. Lavez-le avec HL3.1 et placez-le sur la boîte de dissection sous le stéréomicroscope.
NOTA : La larve errante du 3e stade larvaire est identifiée par le spiracle antérieur ramifié et rampe autour du tube à environ 96 h (25 °C)21. - Positionnez la larve avec le côté dorsal ou ventral vers le haut. Identifiez la face dorsale par les deux longues trachées et la face ventrale par les ceintures denticules abdominales.
- Selon le tissu à observer, optez pour une dissection dorsale ou ventrale. Cela permettra d’avoir une vue plus précise et détaillée de la zone d’intérêt spécifique. Pour l’observation de la JNM et des cellules musculaires, ouvrez les régions dorsale et ventrale des larves, respectivement.
- Épinglez les crochets buccaux et la queue. Ajustez les broches pour maintenir la larve dans un état étendu. Ajoutez une goutte de HL3.1 à la larve pour éviter qu’elle ne se dessèche.
REMARQUE : Le HL 3.1 sans Ca2+ peut être utilisé pour minimiser la contraction des muscles pendant la dissection. - Utilisez les ciseaux à dissection pour faire une petite coupe transversale près de l’extrémité postérieure, mais ne coupez pas l’extrémité postérieure. Coupez ensuite le long de la ligne médiane ventrale vers l’extrémité antérieure.
- Insérez quatre épingles à insectes aux quatre coins de la larve. Réajustez les épingles à insectes de manière à ce que la larve soit étirée au maximum dans toutes les directions.
- Utilisez la pince pour retirer les organes internes sans endommager les muscles.
2. Fixation
- Ajouter 100 μL de PFA (4 %) pour immerger les carcasses pendant 40 min pendant qu’elles sont encore épinglées sur la boîte de dissection.
ATTENTION : Des mesures de protection efficaces sont prises pour éviter tout contact direct avec la peau ou l’inhalation, car le PFA est un danger. - Démontez les broches et transférez l’échantillon dans un tube de microcentrifugation de 2 ml. Rincer le PFA avec 1x solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,2 % de Triton X-100 (0,2 % PBST) pour remplir un tube de microcentrifugation de 2 mL pendant 10 min sur l’agitateur décolorant à 15 tr/min. Répétez le processus de lavage 5 fois.
3. Immunocytochimie
- Immergez les carcasses dans un agent bloquant (5 % de sérum de chèvre dans 0,2 % de PBST) et bloquez pendant 40 min à température ambiante.
- Retirez l’agent bloquant et remplacez-le par 200 μL de l’anticorps primaire (p. ex., anti-α-tubuline, 1 :1000 ; anti-Futsch, 1 :50) dilué avec 0,2 % de PBST à 4 °C pendant la nuit. Visualisez les microtubules musculaires par immunomarquage avec un anti-α-tubuline monoclonal. L’anti-Futsch peut refléter indirectement la morphologie des microtubules dans la JNM.
- Après l’incubation de l’anticorps primaire, laver les larves avec du PBST à 0,2 % pendant 10 min. Répéter 5 fois.
- Incuber les larves avec 200 μL d’anticorps secondaires (p. ex., anticorps de chèvre anti-Mouse-488, 1 :1000) dilués avec 0,2 % de PBST à température ambiante pendant 1,5 h dans l’obscurité.
- Ensuite, ajoutez un colorant nucléaire tel que l’iodure TO-PRO(R) 3 (T3605) à une concentration de 1 :1000 dans le tube d’incubation pendant 30 min lors de la coloration des microtubules dans l’obscurité20,22.
- Rincez l’anticorps secondaire et le colorant nucléaire avec 0,2 % de PBST pendant 10 minutes. Répétez 5 fois dans l’obscurité.
4. Montage
- Placer la carcasse de la larve dans du PBST à 0,2 % sur une lame de verre et l’ajuster au stéréomicroscope. Assurez-vous que la surface intérieure de la carcasse larvaire est orientée vers le haut et que toutes les carcasses larvaires sont disposées comme vous le souhaitez.
- Absorbez l’excès de solution PBST à l’aide d’une lingette et ajoutez délicatement une goutte de produit de montage anti-décoloration.
- Placez une lamelle sur la lame pour couvrir les larves disséquées lentement et doucement afin d’éviter les bulles.
- Appliquez du vernis à ongles autour de la lamelle. Placez la diapositive dans l’espace sombre pour réduire l’atténuation des fluorescents.
5. Acquisition d’images
- Pour acquérir les images, utilisez un microscope confocal à balayage laser, sélectionnez l’objectif à immersion dans l’huile 60x (ouverture numérique 1,42) ou similaire, et ajustez la puissance et la longueur d’onde du laser en fonction de l’expérience.
- Pour identifier la JNM, capturez des images dans le muscle 4 du segment A3 (comme indiqué dans l’emplacement de la figure 1F). Sélectionnez un laser de 488 nm pour activer la α-tubuline ou le Futsch et un laser de 543 nm pour activer la piste d’imagerie HRP. Ajustez les paramètres à une taille d’image de 800 pixels x 800 pixels, à un zoom numérique de 2,0 et à un intervalle d’imagerie de 0,8 μm dans les JNM (Figure 2).
- Pour identifier les microtubules dans le muscle, capturez des images du muscle 2 dans le segment A3-A5 (comme indiqué à l’emplacement de la figure 1G) car il a moins de branches trachéales. Choisissez un laser de 488 nm pour activer la α-tubuline et un laser de 635 nm pour activer la piste d’imagerie T3605. Ajustez les paramètres à une taille d’image de 1024 pixels x 1024 pixels, à un zoom numérique de 3,0 et à un intervalle d’imagerie de 0,4 μm dans les cellules musculaires (Figure 3).
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Representative Results
Nous avons démontré une procédure étape par étape pour visualiser le réseau de microtubules dans les jonctions neuromusculaires (JNM) et les cellules musculaires. Après la dissection selon le schéma de principe (Figure 1A-E), l’immunomarquage est effectué, puis les images sont observées et recueillies sous un microscope confocal laser ou un microscope à fluorescence stéréoscopique (Figure 1F,G).
L’organisation pré et post-synaptique des microtubules de la NMJ a pu être marquée avec de l’anti-α-tubuline, et en sélectionnant l’épaisseur de la couche du microscope confocal à balayage laser, la morphologie des microtubules des différentes coupes serait affichée (Figure 2A-C). Futsch a également été utilisé pour le traçage neuronal en révélant l’organisation des microtubules dans les axones des neurones. L’anti-HRP est utilisé pour marquer la membrane neuronale 10,23,24. La co-coloration avec des anticorps anti-Futsch et anti-HRP est réalisée pour détecter l’état des microtubules dans les axones des neurones. La coloration de Futsch peut refléter l’abondance de microtubules stables dans les neurones présynaptiques de NMJ9. Le chaperon E spécifique de la tubuline (TBCE) joue un rôle crucial dans le développement du cytosquelette MT. Lorsque le TBCE est éliminé dans les neurones présynaptiques, le signal de l’anti-Futsch devient plus faible et plus fin, et la coloration dans les boutons terminaux n’est pas évidente ou absente23. La protéine Tau est une protéine associée aux microtubules qui joue un rôle important dans l’assemblage et la stabilisation des microtubules25,26. Chez la drosophile avec expression ectopique de la protéine Tau humaine de type sauvage et mutante, une diminution de l’intensité du signal de Futsch aux terminaisons NMJ est mise en évidence20. D’après les résultats de la coloration de Futsch, l’intensité de coloration du tronc axonale était plus forte que celle des branches (Figure 2D-F). Les microtubules à l’extrémité des branches sont moins stables et plus sujets aux changements morphologiques, de sorte que la dynamique des microtubules peut être reflétée en colorant les microtubules terminaux.
Les changements morphologiques des microtubules peuvent également être facilement visualisés22. Les anses de microtubules peuvent être colorées avec de l’anti-Futsch et de l’anti-α-tubuline. De plus, la forme d’une seule boucle peut être clairement affichée, ce qui facilite l’analyse quantitative. Par exemple, la katanine est une protéine sectionnante des microtubules qui joue un rôle important dans la régulation de la dynamique des microtubules. La sous-unité catalytique Katanin 60 a été signalée comme ayant un effet sur la morphologie des microtubules22. Mao a construit le mutant Katanin 60 par excision médiée par l’élément P et uas-Katanin 60 en insérant pUAST-attB-Katanin 60 dans le deuxième chromosome à 51D. L’augmentation des boucles de microtubules provoquée par les mutations de la katanine 6017A a été clairement démontrée (Figure 2A, B, D, E). De plus, dans la surexpression de Katanin 60, de courts fragments de MT ont également pu être observés de manière significative dans les boutons terminaux (Figure 2C).
Le réseau de microtubules peut être observé par coloration avec des anticorps α-tubuline dans les cellules musculaires. Un réseau de microtubules s’étendant autour du noyau était clairement visible (Figure 3A). La protéine de sectionnement des microtubules Katanin régule la distribution du réseau de microtubules22. Chez le mutant Katanin 6017A , les cellules musculaires présentaient une augmentation significative de l’intensité de la MT périnucléaire et présentaient des faisceaux plus forts par rapport au type sauvage (Figure 3B). La fragmentation des fibres des microtubules causée par la surexpression de Katanin 60 a été représentée (Figure 3C). Ainsi, le protocole permet la visualisation du réseau de microtubules dans les neurones et les cellules musculaires.
Graphique 1. Procédure de dissection dorsale de la larve de drosophile . (A-E) La procédure de préparation des carcasses larvaires (modifiée de21). (A) Insérez deux épingles chacune dans les crochets buccaux et la queue d’une larve. (B) Utilisez les ciseaux à dissection pour faire une petite incision transversale près de l’extrémité postérieure. (C) Couper le long de la ligne médiane ventrale vers l’extrémité antérieure. (D) Insérez quatre épingles à insectes aux quatre coins de la larve. (E) Utilisez des pinces pour retirer les organes internes et réajustez la position des broches pour placer la larve dans une position appropriée pour la photographie. (F) La phalloïdine est utilisée pour marquer le cytosquelette afin de visualiser le muscle, et la HRP est utilisée pour marquer la membrane cellulaire des neurones. La région observée de la JNM est limitée au muscle 4 du segment A3, co-coloré avec l’anti-HRP (vert) et la phalloïdine (magenta). Le panneau de droite montre une représentation schématique de la structure musculaire locale. La taille de l’image de 1024 pixels x 1024 pixels, le zoom numérique de 0,6 et un intervalle d’imagerie d’environ 4 μm à l’aide d’un objectif 10x (ouverture numérique de 0,45). (G) La région observée des cellules musculaires est limitée au muscle 2 dans les segments A3 à A5, coloré à la phalloïdine (magenta). La coupe unique est capturée par un microscope à fluorescence stéréoscopique. Barre d’échelle : 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 2. Images confocaux de microtubules dans la JNM par anti-α-tubuline ou anti-Futsch. Les terminaisons NMJ du contrôle w1118 (A), du mutant Katanin 60 17A (B) et de la surexpression neuronale de Katanin 60 (C), co-colorées avec l’anti-HRP (rouge) et l’anti-α-tubuline (vert) sont représentées dans la colonne de gauche. Les images sont des projections à partir d’empilements z complets à travers l’ensemble du muscle 4 NMJ du segment abdominal A3. La colonne du milieu montre une image plus claire des microtubules dans les terminaisons NMJ en enlevant les microtubules du muscle. La colonne de droite représente la morphologie des microtubules dans les boutons synaptiques à l’aide du logiciel d’analyse. Barre d’échelle : 1 μm. Terminaisons NMJ de génotypes différents co-colorées avec anti-HRP (rouge) et anti-Futsch (vert) (D-F). Les boucles de traduction automatique étaient indiquées par des flèches. Barre d’échelle : 5 μm. Ce chiffre a été adapté de22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Graphique 3. Coloration du réseau de microtubules périnucléaires dans les cellules musculaires larvaires de la drosophile . (A-C) Les muscles larvaires sont co-colorés avec l’anti-α-tubuline (vert) pour montrer le réseau de microtubules et T3605 (bleu) pour montrer le noyau pour le contrôle w1118 (A), le mutant Katanin 60 17A (B) et la surexpression de Katanin 60 dans le système musculaire (C). Les images sont des projections à partir d’empilements z complets depuis l’apparition de microtubules jusqu’au centre du nucléaire. Barre d’échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Un protocole est décrit ici pour la dissection et l’immunomarquage des jonctions neuromusculaires et des cellules musculaires des larves de drosophile . Il y a plusieurs points essentiels à considérer. Tout d’abord, il est crucial d’éviter de blesser les muscles observés pendant le processus de dissection. Il peut être utile de fixer le filet avant de retirer les organes internes pour éviter tout contact direct entre la pince et les muscles. Pour éviter les lésions musculaires ou la séparation de l’épiderme larvaire, il est important de s’assurer que la vitesse de l’agitateur ne dépasse pas 15 tr/min pendant le lavage et l’incubation. De plus, un contrôle précis de l’extension de la peau est nécessaire pour assurer une photographie claire et complète de la morphologie de la JNM. Il est conseillé de mener des expériences préliminaires pour optimiser la concentration, la fixation, le blocage et les temps d’incubation des anticorps. La durée fixe est limitée à environ 40 min. Trop court ou trop long n’est pas propice à l’immunomarquage du réseau de microtubules.
Les microtubules dans les neurones sont densément emballés et difficiles à visualiser clairement à l’aide de la microscopie conventionnelle. Par rapport aux neurones, les cellules musculaires de la drosophile sont particulièrement grandes, le muscle 2 du segment A3 mesurant jusqu’à 40 μm x 150 μm, ce qui le rend adapté à l’imagerie haute résolution. Par conséquent, l’utilisation des cellules musculaires de la drosophile pour étudier la régulation des protéines associées au réseau de microtubules est une approche intuitive et lucide qui a une valeur significative dans la validation des phénotypes NMJ20,22,23. Par rapport à la méthode précédente27, nous avons changé la direction de dissection de la dorsale vers l’abdomen afin d’obtenir un objet dégagé. Le tampon d’élution du muscle avec 0,2 % de PBST est relativement doux et aide à préserver l’intégrité musculaire.
Il y a encore quelques limites à cette approche. En tant que protéine de liaison aux microtubules, Futsch est exprimée exclusivement dans les neurones et peut représenter indirectement des microtubules polymérisés. Cependant, si seul Futsch est utilisé pour visualiser le réseau de microtubules lors du criblage d’interaction, certaines protéines candidates peuvent être manquées. α-tubuline ou β-tubuline peut représenter directement le réseau de microtubules, cependant, ces deux protéines présentent à la fois pré-synaptique et postsynaptique, et il est parfois difficile de les distinguer. De plus, un grand nombre d’hétérodimères de α/β-tubuline sont distribués dans le cytoplasme, ce qui signifie que le marquage de la α-tubuline ou de la β-tubuline peut ne pas convenir à l’imagerie en direct, car la tubuline polymérisée et non polymérisée peut être observée en même temps.
L’observation des microtubules des motoneurones aux cellules musculaires peut fournir une compréhension complète des mécanismes de mouvement du point de vue des circuits neuronaux, facilitant ainsi l’étude des processus neurodéveloppementaux et de la pathogenèse des maladies neurologiques. La visualisation du réseau de microtubules dans différents systèmes modèles est bénéfique pour vérifier la fonction des gènes sous plusieurs angles à l’aide de ce protocole. Cette méthode peut également être utilisée pour observer les récepteurs postsynaptiques de la JNM, ce qui est bénéfique pour l’étude de la communication entre les synapses et la plasticité synaptique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr Ying Xiong pour les discussions et les commentaires sur le manuscrit. Ces travaux sont soutenus par une subvention de la National Science Foundation of China (NSFC) à C. M. (31500839).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
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