Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتصور شبكات الأنابيب الدقيقة في الوصلات العصبية العضلية وخلايا العضلات. إلى جانب الأدوات الوراثية القوية لذبابة الفاكهة ، يسهل هذا البروتوكول إلى حد كبير الفحص الجيني وتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي.
Abstract
شبكة الأنابيب الدقيقة هي عنصر أساسي في الجهاز العصبي. ترتبط الطفرات في العديد من البروتينات التنظيمية للأنابيب الدقيقة باضطرابات النمو العصبي والأمراض العصبية ، مثل بروتين تاو المرتبط بالأنابيب الدقيقة للأمراض التنكسية العصبية ، وبروتين قطع الأنابيب الدقيقة Spastin و Katanin 60 يسبب الشلل النصفي التشنجي الوراثي وتشوهات النمو العصبي ، على التوالي. يعد الكشف عن شبكات الأنابيب الدقيقة في الخلايا العصبية مفيدا لتوضيح التسبب في الاضطرابات العصبية. ومع ذلك ، فإن صغر حجم الخلايا العصبية والترتيب الكثيف لحزم الأنابيب الدقيقة المحورية يجعل تصور شبكات الأنابيب الدقيقة أمرا صعبا. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة لتشريح الوصلة العصبية العضلية اليرقية وخلايا العضلات ، وكذلك التلوين المناعي لبروتين α-tubulin والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة Futsch لتصور شبكات الأنابيب الدقيقة في ذبابة الفاكهة الميلانية. يسمح لنا التقاطع العصبي العضلي بمراقبة كل من الأنابيب الدقيقة قبل وبعد المشبكي ، ويسمح الحجم الكبير لخلايا العضلات في يرقة ذبابة الفاكهة بتصور واضح لشبكة الأنابيب الدقيقة. هنا ، من خلال تحور والإفراط في التعبير عن Katanin 60 في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، ثم فحص شبكات الأنابيب الدقيقة في الوصلة العصبية العضلية وخلايا العضلات ، نكشف بدقة عن الدور التنظيمي ل Katanin 60 في النمو العصبي. لذلك ، جنبا إلى جنب مع الأدوات الوراثية القوية لذبابة الفاكهة ، يسهل هذا البروتوكول إلى حد كبير الفحص الجيني وتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي.
Introduction
تلعب الأنابيب الدقيقة (MTs) ، باعتبارها أحد المكونات الهيكلية للهيكل الخلوي ، دورا مهما في العمليات البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك انقسام الخلايا ، ونمو الخلايا وحركتها ، والنقل داخل الخلايا ، والحفاظ على شكل الخلية. يتم تعديل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة ووظيفتها من خلال التفاعلات مع البروتينات الأخرى ، مثل MAP1 و MAP2 و Tau و Katanin و Kinesin1،2،3،4،5.
في الخلايا العصبية ، الأنابيب الدقيقة ضرورية لتطوير وصيانة المحاور العصبية والتغصنات. تشوهات في الأنابيب الدقيقة تؤدي إلى خلل وظيفي وحتى موت الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، في دماغ مرضى الزهايمر ، يقلل فرط فسفرة بروتين تاو من استقرار شبكة الأنابيب الدقيقة ، مما يسبب مخالفات عصبية6. وبالتالي ، فإن فحص شبكات الأنابيب الدقيقة سيساهم في فهم النمو العصبي والتسبب في الأمراض العصبية.
الوصلة العصبية العضلية (NMJ) هي المشبك المحيطي المتشكل بين طرف محور عصبي للخلايا العصبية الحركية والألياف العضلية ، وهو نظام نموذجي ممتاز وقوي لدراسة البنية والوظائف المشبكية7. Futsch هو بروتين في ذبابة الفاكهة متماثل مع البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة MAP1B الموجود في الثدييات8. يتم التعبير عنه فقط في الخلايا العصبية ويلعب دورا في تطوير الأزرار المشبكية ل NMJ 8,9. في النوع البري ، يتم تصور الحزم الخيطية التي تعمل على طول مركز عمليات NMJ عن طريق تلطيخ المناعة باستخدام مضاد Futsch. عند الوصول إلى نهاية NMJ ، تتمتع هذه الحزمة إما بالقدرة على تكوين حلقة تتكون من الأنابيب الدقيقة أو فقدان هيكلها الخيطي ، مما يؤدي إلى ظهور منتشر ومنقط10. ترتبط حلقات الأنابيب الدقيقة بمخاريط النمو المتوقفة مؤقتا ، مما يشير إلى أن مجموعة الأنابيب الدقيقة مستقرة11. لذلك ، يمكننا بشكل غير مباشر تحديد تطور الأنابيب الدقيقة المستقرة في NMJ عن طريق تلطيخ Futsch. يسمح الحجم الكبير لخلايا العضلات في يرقة ذبابة الفاكهة بتصور واضح لشبكة الأنابيب الدقيقة. يمكن العثور على العوامل التي تؤثر على استقرار شبكة الأنابيب الدقيقة من خلال تحليل كثافة وشكل الأنابيب الدقيقة. في الوقت نفسه ، يمكن التحقق من حالة شبكة الأنابيب الدقيقة لخلايا العضلات بنتيجة NMJ للحصول على استنتاجات أكثر شمولا.
تم استخدام العديد من البروتوكولات للتحقيق في شبكة وديناميكيات الأنابيب الدقيقة. ومع ذلك ، فقد ركزت هذه الأبحاث في كثير من الأحيان على الدراسات في المختبر 12،13،14،15،16. بدلا من ذلك ، استخدمت بعض التجارب في الجسم الحي المجهر الإلكتروني للكشف عن الهيكل الخلوي17. وفقا للارتباط المحدد للأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية أو الأصباغ الكيميائية بالبروتينات أو الحمض النووي ، تسمح الطرق المعروضة هنا باكتشاف شبكات الأنابيب الدقيقة في NMJ على مستوى الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي ، مع النتائج التي تؤكدها الملاحظات في خلايا العضلات. هذا البروتوكول بسيط ومستقر وقابل للتكرار عند دمجه مع الأدوات الجينية القوية المتوفرة في ذبابة الفاكهة الميلانية ، مما يتيح مجموعة متنوعة من فحوصات النمط الظاهري والفحوصات الجينية لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تشريح اليرقات
ملاحظة: يتم استخدام محلول تشريح محلول ملحي يشبه الدملمف (HL3.1) 18 ومحلول التثبيت 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) 19،20في درجة حرارة الغرفة لأن الأنابيب الدقيقة تتبلمر عندما تكون درجة الحرارة منخفضة جدا.
- اختر يرقة 3 متجولة مع ملقط طويل حاد. اغسله باستخدام HL3.1 وضعه على طبق التشريح تحت المجهر المجسم.
ملاحظة: يتم التعرف على اليرقة المتجولة 3الثالثة من خلال spiracle الأمامي المتفرع وتزحف حول الأنبوب عند حوالي 96 ساعة (25 درجة مئوية) 21. - ضع اليرقة مع الجانب الظهري أو البطني لأعلى. حدد الجانب الظهري من القصبة الهوائية الطويلة والبطني بواسطة أحزمة الأسنان البطنية.
- اعتمادا على الأنسجة التي يجب مراقبتها ، اختر التشريح الظهري أو البطني. سيسمح ذلك بعرض أكثر دقة وتفصيلا لمجال الاهتمام المحدد. لمراقبة NMJ والخلايا العضلية ، قم بقطع المناطق الظهرية والبطنية اليرقية ، على التوالي.
- دبوس السنانير الفم والذيل. اضبط المسامير للحفاظ على اليرقة في حالة ممتدة. أضف قطرة من HL3.1 إلى اليرقة لمنعها من الجفاف.
ملاحظة: يمكن استخدام HL 3.1 الخالي من الكالسيوم2+ لتقليل تقلص العضلات أثناء التشريح. - استخدم مقص التشريح لعمل قطع عرضي صغير بالقرب من الطرف الخلفي ، لكن لا تقطع الطرف الخلفي. ثم قطع على طول خط الوسط البطني نحو الطرف الأمامي.
- أدخل أربعة دبابيس حشرة على الزوايا الأربع لليرقة. إعادة ضبط دبابيس الحشرات بحيث يتم تمديد اليرقة إلى أقصى حد في جميع الاتجاهات.
- استخدم الملقط لإزالة الأعضاء الداخلية مع عدم إتلاف العضلات.
2. التثبيت
- أضف 100 ميكرولتر من PFA (4٪) لغمر الذبائح لمدة 40 دقيقة بينما لا تزال الذبائح مثبتة على طبق التشريح.
تنبيه: يتم اتخاذ تدابير حماية فعالة لتجنب الاتصال المباشر بالجلد أو الاستنشاق ، لأن PFA يشكل خطرا. - قم بفك المسامير ونقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2 مل. اشطف PFA بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x يحتوي على 0.2٪ Triton X-100 (0.2٪ PBST) لملء أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل لمدة 10 دقائق على شاكر إزالة اللون عند 15 دورة في الدقيقة. كرر عملية الغسيل 5x.
3. الكيمياء المناعية
- اغمر الذبائح في عامل مانع (5٪ مصل الماعز في 0.2٪ PBST) ومنعها لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة عامل الحجب واستبدله ب 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي (على سبيل المثال ، مضاد α توبولين ، 1: 1000 ؛ مضاد فويتش ، 1:50) مخفف ب 0.2٪ PBST عند 4 درجات مئوية طوال الليل. تصور الأنابيب الدقيقة العضلية عن طريق تلطيخ المناعة باستخدام مضاد α توبولين أحادي النسيلة. يمكن أن يعكس Anti-Futsch بشكل غير مباشر مورفولوجيا الأنابيب الدقيقة في NMJ.
- بعد حضانة الجسم المضاد الأساسي ، اغسل اليرقات بنسبة 0.2٪ PBST لمدة 10 دقائق. كرر 5x.
- احتضان اليرقات ب 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال ، الماعز المضاد للفأر 488 ، 1: 1000) المخفف بنسبة 0.2٪ PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة في الظلام.
- بعد ذلك ، أضف صبغة نووية مثل TO-PRO (R) 3 يوديد (T3605) بتركيز 1: 1000 في أنبوب الحضانة لمدة 30 دقيقة عند تلطيخ الأنابيب الدقيقة في الظلام20,22.
- اشطف الجسم المضاد الثانوي والصبغة النووية بنسبة 0.2٪ PBST لمدة 10 دقائق. كرر 5x في الظلام.
4. تصاعد
- ضع جثة اليرقات في 0.2٪ PBST على شريحة زجاجية واضبطها تحت المجهر المجسم. تأكد من أن السطح الداخلي لجثة اليرقات متجها لأعلى وأن جميع جثث اليرقات مرتبة حسب الرغبة.
- قم بامتصاص محلول PBST الزائد بمنديل وأضف برفق قطرة من وسيط التثبيت المضاد للتلاشي.
- ضع غطاء على الشريحة لتغطية اليرقات المشرحة ببطء ورفق لتجنب الفقاعات.
- ضعي طلاء الأظافر حول غطاء الغطاء. ضع الشريحة في المساحة المظلمة لتقليل التوهين الفلوري.
5. الحصول على الصور
- للحصول على الصور ، استخدم مجهر المسح بالليزر متحد البؤر ، وحدد هدف غمر الزيت 60x (الفتحة العددية 1.42) أو ما شابه ذلك ، واضبط طاقة الليزر والطول الموجي بناء على التجربة.
- لتحديد NMJ ، التقط صورا في العضلات 4 في الجزء A3 (كما هو موضح في الموقع في الشكل 1F). حدد ليزر 488 نانومتر لتنشيط α-tubulin أو Futsch و 543 نانومتر لتنشيط مسار التصوير HRP. اضبط المعلمات على حجم إطار 800 بكسل × 800 بكسل ، وتكبير رقمي 2.0 ، وفاصل تصوير يبلغ 0.8 ميكرومتر في NMJs (الشكل 2).
- لتحديد الأنابيب الدقيقة في العضلات ، التقط صورا للعضلة 2 في الجزء A3-A5 (كما هو موضح في الموقع في الشكل 1G) لأنها تحتوي على عدد أقل من فروع القصبة الهوائية. اختر ليزر 488 نانومتر لتنشيط α توبولين وليزر 635 نانومتر لتنشيط مسار التصوير T3605. اضبط المعلمات على حجم إطار يبلغ 1024 بكسل × 1024 بكسل ، وتكبير رقمي 3.0 ، وفاصل تصوير يبلغ 0.4 ميكرومتر في خلايا العضلات (الشكل 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد أظهرنا إجراء خطوة بخطوة لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة في كل من الوصلات العصبية العضلية (NMJs) وخلايا العضلات. بعد التشريح وفقا للرسم التخطيطي (الشكل 1A-E) ، يتم إجراء تلطيخ مناعي ، ويتم بعد ذلك ملاحظة الصور وتجميعها تحت مجهر ليزر متحد البؤر أو مجهر مضان مجسم (الشكل 1F ، G).
يمكن تمييز كل من تنظيم الأنابيب الدقيقة قبل وبعد المشبكي ل NMJ بمضاد α توبولين ، ومن خلال اختيار سمك طبقة المجهر متحد البؤر للمسح بالليزر ، سيتم عرض مورفولوجيا الأنابيب الدقيقة لشرائح مختلفة (الشكل 2A-C). كما تم استخدام Futsch للتتبع العصبي من خلال الكشف عن تنظيم الأنابيب الدقيقة في محاور الخلايا العصبية. يستخدم Anti-HRP لتسمية الغشاء العصبي10،23،24. يتم إجراء تلطيخ مشترك مع الأجسام المضادة المضادة ل Futsch و Anti-HRP للكشف عن حالة الأنابيب الدقيقة في محاور الخلايا العصبية. يمكن أن يعكس تلطيخ Futsch وفرة الأنابيب الدقيقة المستقرة في الخلايا العصبية قبل المشبكية ل NMJ9. يلعب المرافق E (TBCE) الخاص بتوبولين دورا حاسما في تطوير الهيكل الخلوي MT. عندما يتم هدم TBCE في الخلايا العصبية قبل المشبكية ، تصبح إشارة مكافحة Futsch أضعف وأرق ، ويكون التلوين في العروة الطرفية إما غير واضح أو غائب23. تاو هو بروتين مرتبط بالأنابيب الدقيقة له دور مهم في تجميع الأنابيب الدقيقة وتثبيتها25,26. في ذبابة الفاكهة مع التعبير خارج الرحم لبروتين تاو البشري من النوع البري والطافر ، تم الكشف عن انخفاض في شدة إشارة Futsch في محطات NMJ20. وفقا لنتائج تلطيخ Futsch ، كانت شدة تلطيخ جذع المحور أقوى من تلك الموجودة في الفروع (الشكل 2D-F). الأنابيب الدقيقة في نهاية الفروع أقل استقرارا وأكثر عرضة للتغيرات المورفولوجية ، لذلك يمكن أن تنعكس ديناميكيات الأنابيب الدقيقة عن طريق تلطيخ الأنابيب الدقيقة الطرفية.
يمكن أيضا تصور التغيرات المورفولوجية للأنابيب الدقيقة بسهولة22. يمكن تلطيخ حلقات الأنابيب الدقيقة بمضاد Futsch ومضاد α-tubulin. علاوة على ذلك ، يمكن عرض شكل حلقة واحدة بوضوح ، مما يسهل التحليل الكمي. على سبيل المثال ، Katanin هو بروتين يقطع الأنابيب الدقيقة ويلعب دورا مهما في تنظيم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة. تم الإبلاغ عن أن الوحدة الفرعية التحفيزية Katanin 60 لها تأثير على مورفولوجيا الأنابيب الدقيقة22. قام ماو ببناء متحولة Katanin 60 عن طريق الاستئصال بوساطة العنصر P و uas-Katanin 60 عن طريق إدخال pUAST-attB-Katanin 60 في الكروموسوم الثاني عند 51D. تم توضيح الزيادة في حلقات الأنابيب الدقيقة الناتجة عن طفرات Katanin 6017A بوضوح (الشكل 2A ، B ، D ، E). بالإضافة إلى ذلك ، في التعبير المفرط عن Katanin 60 ، يمكن أيضا ملاحظة شظايا MT القصيرة بشكل كبير داخل العروات الطرفية (الشكل 2C).
يمكن ملاحظة شبكة الأنابيب الدقيقة عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة α-tubulin في خلايا العضلات. كانت شبكة من الأنابيب الدقيقة الممتدة حول النواة مرئية بوضوح (الشكل 3 أ). ينظم بروتين قطع الأنابيب الدقيقة كاتانين توزيع شبكة الأنابيب الدقيقة22. في طافرة Katanin 6017A ، كان لدى خلايا العضلات زيادة كبيرة في شدة MT المحيطة بالنواة وأظهرت حزما أقوى مقارنة بالنوع البري (الشكل 3B). تم تمثيل تجزئة ألياف الأنابيب الدقيقة الناتجة عن الإفراط في التعبير عن الكاتانين 60 (الشكل 3C). وبالتالي ، فإن البروتوكول يتيح تصور شبكة الأنابيب الدقيقة في كل من الخلايا العصبية وخلايا العضلات.
الشكل 1. إجراء تشريح الظهرية ليرقة ذبابة الفاكهة . (أ-ه) إجراء تحضير جثث اليرقات (معدلة من21). (أ) أدخل دبوسين في خطافات الفم وذيل اليرقة. (ب) استخدم مقص التشريح لعمل قطع عرضي صغير بالقرب من الطرف الخلفي. ج: قطع خط الوسط البطني باتجاه الطرف الأمامي. د: أدخل أربعة دبابيس حشرية في الزوايا الأربع لليرقة. (ه) استخدم الملقط لإزالة الأعضاء الداخلية وإعادة ضبط موضع الدبابيس لوضع اليرقة في وضع مناسب للتصوير الفوتوغرافي. (F) يستخدم الفالويدين لتسمية الهيكل الخلوي لتصوير العضلة، ويستخدم HRP لتسمية الغشاء الخلوي للخلايا العصبية. تقتصر المنطقة المرصودة من NMJ على العضلات 4 في الجزء A3 ، ملطخة بشكل مشترك مع مضاد HRP (أخضر) و phalloidin (أرجواني). تظهر اللوحة اليمنى تمثيلا تخطيطيا لبنية العضلات المحلية. حجم الإطار 1024 بكسل × 1024 بكسل ، والتكبير الرقمي 0.6 ، وفاصل تصوير يبلغ حوالي 4 ميكرومتر باستخدام عدسة موضوعية 10x (فتحة رقمية 0.45). (G) تقتصر المنطقة المرصودة من خلايا العضلات على العضلات 2 في الأجزاء من A3 إلى A5 ، ملطخة بالقضيب (أرجواني). يتم التقاط القسم الفردي بواسطة مجهر مضان مجسم. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. صور متحدة البؤر للأنابيب الدقيقة داخل NMJ بواسطة مضاد α توبولين أو مضاد فوتس. يتم عرض محطات NMJ للتحكم في w1118 (A) ، و Katanin 60 17A الطافر (B) والتعبير المفرط للخلايا العصبية ل Katanin 60 (C) ، الملطخة بشكل مشترك مع مضاد HRP (أحمر) ومضاد α-توبولين (أخضر) في العمود الأيسر. الصور عبارة عن إسقاطات من مداخن z كاملة عبر العضلات بأكملها 4 NMJ من الجزء البطني A3. يظهر العمود الأوسط صورة أوضح للأنابيب الدقيقة في محطات NMJ عن طريق إزالة الأنابيب الدقيقة من العضلات. يصور العمود الأيمن مورفولوجيا الأنابيب الدقيقة في العروقات المشبكية باستخدام برنامج التحليل. شريط المقياس: 1 ميكرومتر. أطراف NMJ من أنماط وراثية مختلفة ملطخة بشكل مشترك مع مضاد HRP (أحمر) ومضاد Futsch (أخضر) (D-F). تمت الإشارة إلى حلقات MT بواسطة الأسهم. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. تم تكييف هذا الرقم من22. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تلطيخ شبكة الأنابيب الدقيقة حول النووية في خلايا عضلة يرقات ذبابة الفاكهة . (أ-ج) يتم تلطيخ عضلات اليرقات بشكل مشترك مع مضاد α توبولين (أخضر) لإظهار شبكة الأنابيب الدقيقة و T3605 (أزرق) لإظهار نواة w1118 السيطرة (A) ، Katanin 60 17A متحولة (B) و Katanin 60 مفرط التعبير في نظام العضلات (C). الصور عبارة عن إسقاطات من مداخن z كاملة من ظهور الأنابيب الدقيقة إلى مركز النووي. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يتم وصف بروتوكول للتشريح والمناعة من ذبابة الفاكهة اليرقات الوصلات العصبية العضلية وخلايا العضلات. هناك العديد من النقاط الأساسية التي يجب مراعاتها. أولا ، يعد تجنب إصابة العضلات المرصودة أمرا بالغ الأهمية أثناء عملية التشريح. قد يكون من المفيد إصلاح شرائح اللحم قبل إزالة الأعضاء الداخلية لمنع الاتصال المباشر بين الملقط والعضلات. لتجنب تلف العضلات أو الانفصال عن بشرة اليرقات ، من المهم التأكد من أن سرعة شاكر لا تتجاوز 15 دورة في الدقيقة أثناء الغسيل والحضانة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد التحكم الدقيق في تمديد الجلد ضروريا لضمان التصوير الواضح والكامل لمورفولوجيا NMJ. ينصح بإجراء تجارب أولية لتحسين تركيز الأجسام المضادة والتثبيت والحجب وأوقات الحضانة. المدة المحددة محدودة بحوالي 40 دقيقة. قصيرة جدا أو طويلة جدا لا تفضي إلى تلطيخ المناعة لشبكة الأنابيب الدقيقة.
الأنابيب الدقيقة في الخلايا العصبية مكتظة بكثافة ويصعب تصورها بوضوح باستخدام الفحص المجهري التقليدي. بالمقارنة مع الخلايا العصبية ، فإن الخلايا العضلية لذبابة الفاكهة كبيرة بشكل ملحوظ ، حيث يصل قياس العضلات 2 من الجزء A3 إلى 40 ميكرومتر × 150 ميكرومتر ، مما يجعلها قابلة للتصوير عالي الدقة. لذلك ، فإن استخدام خلايا عضلات ذبابة الفاكهة للتحقيق في تنظيم البروتينات المرتبطة بشبكة الأنابيب الدقيقة هو نهج بديهي وواضح يحمل قيمة كبيرة في التحقق من صحة الأنماط الظاهرية NMJ20،22،23. مقارنة بالطريقة السابقة27 ، قمنا بتغيير اتجاه التشريح من الظهر إلى البطن من أجل الحصول على جسم دون عائق. العازلة للشطف من العضلات مع 0.2 ٪ PBST لطيف نسبيا ويساعد على الحفاظ على سلامة العضلات.
لا تزال هناك بعض القيود على هذا النهج. كبروتين ملزم للأنابيب الدقيقة ، يتم التعبير عن Futsch حصريا في الخلايا العصبية ويمكن أن يمثل الأنابيب الدقيقة المبلمرة بشكل غير مباشر. ومع ذلك ، إذا تم استخدام Futsch فقط لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة أثناء فحص التفاعل ، فقد يتم تفويت بعض البروتينات المرشحة. يمكن أن يمثل α-tubulin أو β-tubulin شبكة الأنابيب الدقيقة مباشرة ، ومع ذلك ، فإن هذين البروتينين يقدمان كلا من ما قبل المشبكي وما بعد المشبكي ، ويصعب التمييز بينهما في بعض الأحيان. علاوة على ذلك ، يتم توزيع عدد كبير من متغاير α / β-tubulin في السيتوبلازم ، مما يعني أن وضع العلامات إما على α-tubulin أو β-tubulin قد لا يكون مناسبا للتصوير الحي ، حيث يمكن ملاحظة كل من التوبولين المبلمر وغير المبلمر في نفس الوقت.
يمكن أن توفر مراقبة الأنابيب الدقيقة من الخلايا العصبية الحركية إلى خلايا العضلات فهما شاملا لآليات الحركة من منظور الدوائر العصبية ، مما يسهل دراسة عمليات النمو العصبي والتسبب في الأمراض العصبية. يعد تصور شبكة الأنابيب الدقيقة في أنظمة نموذجية مختلفة مفيدا للتحقق من وظيفة الجينات من وجهات نظر متعددة باستخدام هذا البروتوكول. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لمراقبة مستقبلات NMJ بعد المشبكي ، وهو أمر مفيد لدراسة التواصل بين نقاط الاشتباك العصبي واللدونة المشبكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتور يينغ شيونغ على المناقشات والتعليقات على المخطوطة. يتم دعم هذا العمل بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (NSFC) إلى C. M. (31500839).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
References
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J.
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R.
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
