Summary
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen vor. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.
Abstract
Das Mikrotubuli-Netzwerk ist ein wesentlicher Bestandteil des Nervensystems. Mutationen in vielen Mikrotubuli-regulatorischen Proteinen werden mit neurologischen Entwicklungsstörungen und neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, wie z. B. das Mikrotubuli-assoziierte Protein Tau zu neurodegenerativen Erkrankungen, Mikrotubuli-durchtrennende Proteine Spastin und Katanin 60 verursachen erbliche spastische Querschnittslähmung bzw. neurologische Entwicklungsstörungen. Der Nachweis von Mikrotubuli-Netzwerken in Neuronen ist vorteilhaft für die Aufklärung der Pathogenese neurologischer Erkrankungen. Die geringe Größe der Neuronen und die dichte Anordnung der axonalen Mikrotubuli-Bündel machen die Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke jedoch schwierig. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Dissektion der neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen der Larve sowie zur Immunfärbung von α-Tubulin und dem Mikrotubuli-assoziierten Protein Futsch zur Visualisierung von Mikrotubuli-Netzwerken in Drosophila melanogaster. Die neuromuskuläre Verbindung ermöglicht es uns, sowohl prä- als auch postsynaptische Mikrotubuli zu beobachten, und die Größe der Muskelzellen in der Drosophila-Larve ermöglicht eine klare Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks. Durch die Mutation und Überexpression von Katanin 60 in Drosophila melanogaster und die anschließende Untersuchung der Mikrotubuli-Netzwerke in der neuromuskulären Verbindung und den Muskelzellen zeigen wir die regulatorische Rolle von Katanin 60 in der Neuroentwicklung genau auf. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll daher das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.
Introduction
Mikrotubuli (MTs) spielen als einer der strukturellen Bestandteile des Zytoskeletts eine wichtige Rolle bei verschiedenen biologischen Prozessen, darunter Zellteilung, Zellwachstum und -motilität, intrazellulärer Transport und die Aufrechterhaltung der Zellform. Die Dynamik und Funktion der Mikrotubuli wird durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen wie MAP1, MAP2, Tau, Katanin und Kinesin 1,2,3,4,5 moduliert.
In Neuronen sind Mikrotubuli essentiell für die Entwicklung und Aufrechterhaltung von Axonen und Dendriten. Anomalien in den Mikrotubuli führen zu Funktionsstörungen und sogar zum Absterben von Neuronen. Im Gehirn von Alzheimer-Patienten verringert beispielsweise die Hyperphosphorylierung des Tau-Proteins die Stabilität des Mikrotubuli-Netzwerks, was zu neurologischen Unregelmäßigkeiten führt6. Die Untersuchung von Mikrotubuli-Netzwerken wird somit zum Verständnis der neuronalen Entwicklung und der Pathogenese neurologischer Erkrankungen beitragen.
Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die periphere Synapse, die zwischen einem Axonterminal des Motoneurons und einer Muskelfaser gebildet wird, was ein hervorragendes und leistungsfähiges Modellsystem für die Untersuchung der synaptischen Struktur und Funktionen darstellt7. Futsch ist ein Protein in Drosophila, das homolog zum Mikrotubuli-bindenden Protein MAP1B ist, das in Säugetieren vorkommt8. Es wird nur in Neuronen exprimiert und spielt eine Rolle bei der Entwicklung der synaptischen Knöpfe des NMJ 8,9. Im Wildtyp werden filamentöse Bündel, die entlang des Zentrums von NMJ-Prozessen verlaufen, durch Immunfärbung mit Anti-Futsch sichtbar gemacht. Wenn dieses Bündel das Ende von NMJ erreicht, hat es die Fähigkeit, entweder eine Schleife aus Mikrotubuli zu bilden oder seine filamentöse Struktur zu verlieren, was zu einem diffusen und punktförmigen Erscheinungsbild führt10. Mikrotubuli-Schleifen sind mit pausierten Wachstumskegeln assoziiert, was darauf hindeutet, dass das Mikrotubuli-Array stabil ist11. Daher können wir indirekt die stabile Mikrotubuli-Entwicklung im NMJ durch Futsch-Färbung bestimmen. Die Größe der Muskelzellen in der Drosophila-Larve ermöglicht eine klare Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks. Die Faktoren, die die Stabilität des Mikrotubuli-Netzwerks beeinflussen, können durch die Analyse der Dichte und Form der Mikrotubuli ermittelt werden. Gleichzeitig kann der Status des Mikrotubuli-Netzwerks von Muskelzellen mit dem Ergebnis der NMJ abgeglichen werden, um umfassendere Schlussfolgerungen zu erhalten.
Viele Protokolle wurden verwendet, um das Netzwerk und die Dynamik von Mikrotubuli zu untersuchen. Diese Forschungen konzentrierten sich jedoch häufig auf In-vitro-Studien 12,13,14,15,16. Alternativ wurden in einigen In-vivo-Experimenten Elektronenmikroskopie eingesetzt, um das Zytoskelett zu detektieren17. Entsprechend der spezifischen Bindung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder chemischen Farbstoffen an Proteine oder DNA erlauben die hier vorgestellten Methoden den Nachweis von Mikrotubuli-Netzwerken im NMJ auf der Ebene einzelner Neuronen in vivo, wobei die Ergebnisse durch Beobachtungen in Muskelzellen bestätigt werden. Dieses Protokoll ist einfach, stabil und wiederholbar, wenn es mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen kombiniert wird, die in Drosophila melanogaster verfügbar sind, und ermöglicht eine Vielzahl von phänotypischen Untersuchungen und genetischen Screenings für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem in vivo.
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Protocol
1. Sektion der Larven
HINWEIS: Die Präparierlösung Hämolymph-ähnliche Kochsalzlösung (HL3.1)18 und die Fixierlösung 4% Paraformaldehyd (PFA)19,20 werden bei Raumtemperatur verwendet, da die Mikrotubuli bei zu niedriger Temperatur depolymerisieren.
- Suchen Sie sich eine wandernde Larve des 3. Instars mit einer langen, stumpfen Zange aus. Waschen Sie es mit HL3.1 und legen Sie es auf die Sezierschale unter dem Stereomikroskop.
HINWEIS: Die wandernde Larve des 3. Instars wird durch eine verzweigte vordere Spirakel identifiziert und krabbelt bei ca. 96 h (25 °C) um die Röhre herum21. - Positionieren Sie die Larve mit der dorsalen oder ventralen Seite nach oben. Identifizieren Sie die dorsale Seite durch die beiden langen Luftröhren und die ventrale durch die abdominalen Dentikelgürtel.
- Je nachdem, welches Gewebe beobachtet werden soll, entscheiden Sie sich für eine dorsale oder ventrale Dissektion. Dies ermöglicht eine genauere und detailliertere Sicht auf den spezifischen Interessenbereich. Für die NMJ- und Muskelzellbeobachtung werden die dorsalen bzw. ventralen Regionen der Larven aufgeschnitten.
- Stecken Sie die Maulhaken und den Schwanz fest. Passen Sie die Stifte an, um die Larve in einem verlängerten Zustand zu halten. Geben Sie einen Tropfen HL3.1 in die Larve, um sie vor dem Austrocknen zu bewahren.
HINWEIS: Ca2+ -freies HL 3.1 kann verwendet werden, um die Kontraktion der Muskeln während der Dissektion zu minimieren. - Mit der Präparierschere einen kleinen Querschnitt in der Nähe des hinteren Endes machen, aber nicht das hintere Ende. Schneiden Sie dann entlang der ventralen Mittellinie in Richtung des vorderen Endes.
- Setze vier Insektennadeln an den vier Ecken der Larve ein. Stellen Sie die Insektennadeln so ein, dass die Larve maximal in alle Richtungen gestreckt wird.
- Verwenden Sie die Pinzette, um innere Organe zu entfernen, ohne die Muskeln zu beschädigen.
2. Fixierung
- Fügen Sie 100 μl PFA (4 %) hinzu, um die Schlachtkörper 40 Minuten lang einzutauchen, während die Schlachtkörper noch auf der Präparierschale stecken.
VORSICHT: Es werden wirksame Schutzmaßnahmen ergriffen, um den direkten Kontakt mit der Haut oder das Einatmen zu vermeiden, da PFA eine Gefahr darstellt. - Demontieren Sie die Stifte und geben Sie die Probe in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Spülen Sie PFA mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung ab, die 0,2 % Triton X-100 (0,2 % PBST) enthält, um das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen 10 Minuten lang auf dem Entfärbungsschüttler bei 15 U/min zu füllen. Wiederholen Sie den Waschvorgang 5x.
3. Immunzytochemie
- Die Schlachtkörper in Blockmittel (5 % Ziegenserum in 0,2 % PBST) tauchen und 40 Minuten bei Raumtemperatur blocken.
- Entfernen Sie das Blockierungsmittel und ersetzen Sie es durch 200 μl des Primärantikörpers (z. B. Anti-α-Tubulin, 1:1000; Anti-Futsch, 1:50), verdünnt mit 0,2 % PBST bei 4 °C über Nacht. Visualisieren Sie Muskelmikrotubuli durch Immunfärbung mit monoklonalem Anti-α-Tubulin. Anti-Futsch kann indirekt die Mikrotubuli-Morphologie im NMJ widerspiegeln.
- Nach Inkubation des Primärantikörpers die Larven 10 Minuten lang mit 0,2 % PBST waschen. 5x wiederholen.
- Die Larven werden mit 200 μl Sekundärantikörper (z. B. Ziegen-Anti-Maus-488, 1:1000), verdünnt mit 0,2 % PBST bei Raumtemperatur für 1,5 h im Dunkeln inkubiert.
- Als nächstes wird ein Kernfarbstoff wie TO-PRO(R) 3-Iodid (T3605) in einer Konzentration von 1:1000 für 30 Minuten in das Inkubationsröhrchen gegeben, während die Mikrotubuli im Dunkelngefärbt werden 20,22.
- Spülen Sie den sekundären Antikörper und den Kernfarbstoff mit 0,2 % PBST für 10 Minuten ab. Wiederholen Sie dies 5x im Dunkeln.
4. Montage
- Legen Sie den Larvenkadaver in 0,2 % PBST auf einen Objektträger und justieren Sie ihn unter dem Stereomikroskop. Achten Sie darauf, dass die Innenfläche des Larvenkadavers nach oben zeigt und alle Larvenkadaver wie gewünscht angeordnet sind.
- Nehmen Sie überschüssige PBST-Lösung mit einem Tuch auf und fügen Sie vorsichtig einen Tropfen Anti-Fade-Eindeckmittel hinzu.
- Legen Sie ein Deckglas auf den Objektträger, um die präparierten Larven langsam und vorsichtig abzudecken, um Blasen zu vermeiden.
- Tragen Sie Fingernagellack um das Deckglas herum auf. Platzieren Sie das Objektträger im dunklen Raum, um die Fluoreszenzdämpfung zu reduzieren.
5. Bildaufnahme
- Um die Bilder aufzunehmen, verwenden Sie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop, wählen Sie das 60-fache Ölimmersionsobjektiv (numerische Apertur 1,42) oder ein ähnliches und passen Sie die Laserleistung und Wellenlänge basierend auf dem Experiment an.
- Um das NMJ zu identifizieren, nehmen Sie Bilder in Muskel 4 im Segment A3 auf (wie in Abbildung 1F dargestellt). Wählen Sie einen 488-nm-Laser, um das α-Tubulin oder Futsch zu aktivieren, und 543 nm, um die HRP-Bildgebungsspur zu aktivieren. Stellen Sie die Parameter auf eine Bildgröße von 800 x 800 Pixeln, einen Digitalzoom von 2,0 und ein Abbildungsintervall von 0,8 μm in NMJs ein (Abbildung 2).
- Um die Mikrotubuli im Muskel zu identifizieren, nehmen Sie Bilder von Muskel 2 in den Segmenten A3-A5 auf (wie in Abbildung 1G dargestellt), da er weniger Trachealäste aufweist. Wählen Sie einen 488-nm-Laser zur Aktivierung von α-Tubulin und einen 635-nm-Laser zur Aktivierung der T3605-Bildgebungsspur. Stellen Sie die Parameter auf eine Bildgröße von 1024 x 1024 Pixeln, einen Digitalzoom von 3,0 und ein Abbildungsintervall von 0,4 μm in Muskelzellen ein (Abbildung 3).
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Representative Results
Wir demonstrierten ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks sowohl in neuromuskulären Verbindungen (NMJs) als auch in Muskelzellen. Nach der Dissektion gemäß dem schematischen Diagramm (Abbildung 1A-E) wird eine Immunfärbung durchgeführt, und anschließend werden die Bilder unter einem konfokalen Lasermikroskop oder einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop beobachtet und gesammelt (Abbildung 1F,G).
Sowohl die prä- als auch die postsynaptische Mikrotubuli-Organisation von NMJ konnte mit Anti-α-Tubulin markiert werden, und durch Auswahl der Schichtdicke des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops würde die Mikrotubuli-Morphologie verschiedener Schichten angezeigt werden (Abbildung 2A-C). Futsch wurde auch für die neuronale Verfolgung verwendet, indem die Mikrotubuli-Organisation in den Axonen von Neuronen aufgedeckt wurde. Anti-HRP wird verwendet, um die neuronale Membran zu markieren 10,23,24. Die Co-Färbung mit Anti-Futsch- und Anti-HRP-Antikörpern wird durchgeführt, um den Mikrotubuli-Status in Axonen von Neuronen zu detektieren. Die Futsch-Färbung kann die Häufigkeit stabiler Mikrotubuli in den präsynaptischen Neuronen von NMJ9 widerspiegeln. Das Tubulin-spezifische Chaperon E (TBCE) spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des MT-Zytoskeletts. Wenn TBCE in präsynaptischen Neuronen ausgeschaltet wird, wird das Signal von Anti-Futsch schwächer und dünner, und die Färbung in den terminalen Boutons ist entweder nicht offensichtlich oder fehlt23. Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das eine wichtige Rolle bei der Assemblierung und Stabilisierung von Mikrotubuli spielt25,26. In Drosophila mit ektopischer Expression des humanen Wildtyps und des mutierten humanen Tau-Proteins zeigt sich eine Abnahme der Intensität des Futsch-Signals an den NMJ-Terminals20. Nach den Ergebnissen der Futsch-Färbung war die Färbeintensität des Axonstamms stärker als die der Äste (Abbildung 2D-F). Mikrotubuli am Ende von Ästen sind weniger stabil und anfälliger für morphologische Veränderungen, so dass die Dynamik der Mikrotubuli durch die Färbung der terminalen Mikrotubuli reflektiert werden kann.
Auch morphologische Veränderungen von Mikrotubuli können leicht visualisiert werden22. Mikrotubuli-Schleifen können mit Anti-Futsch und Anti-α-Tubulin gefärbt werden. Darüber hinaus kann die Form einer einzelnen Schleife deutlich dargestellt werden, was die quantitative Analyse erleichtert. Zum Beispiel ist Katanin ein Mikrotubuli-durchtrennendes Protein, das eine wichtige Rolle bei der Regulation der Mikrotubuli-Dynamik spielt. Es wurde berichtet, dass die katalytische Untereinheit Katanin 60 einen Einfluss auf die Morphologie von Mikrotubulihat 22. Mao hat die Katanin-60-Mutante durch P-Element-vermittelte Exzision und uas-Katanin 60 durch Einfügen von pUAST-attB-Katanin 60 in das zweite Chromosom bei 51D hergestellt. Die Zunahme der Mikrotubuli-Schleifen, die durch Katanin-60-17A-Mutationen verursacht wird, konnte deutlich nachgewiesen werden (Abbildung 2A,B,D,E). Darüber hinaus konnten bei der Überexpression von Katanin 60 auch signifikant kurze MT-Fragmente innerhalb der terminalen Boutons beobachtet werden (Abbildung 2C).
Das Mikrotubuli-Netzwerk kann durch Färbung mit α-Tubulin-Antikörpern in Muskelzellen beobachtet werden. Ein Netzwerk von Mikrotubuli, das sich um den Zellkern erstreckte, war deutlich sichtbar (Abbildung 3A). Das Mikrotubuli-durchtrennende Protein Katanin reguliert die Verteilung des Mikrotubuli-Netzwerks22. In der Katanin 6017A Mutante wiesen die Muskelzellen im Vergleich zum Wildtyp eine signifikant erhöhte perinukleäre MT-Intensität auf und wiesen stärkere Bündel auf (Abbildung 3B). Die Fragmentierung von Mikrotubulifasern durch Überexpression von Katanin 60 wurde dargestellt (Abbildung 3C). Somit ermöglicht das Protokoll die Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks sowohl in Neuronen als auch in Muskelzellen.
Abbildung 1. Dorsale Dissektion der Drosophila-Larve . (A-E) Verfahren zur Vorbereitung von Larvenkadavern (geändert von21). (A) Stecken Sie je zwei Stecknadeln in die Maulhaken und den Schwanz einer Larve. (B) Machen Sie mit der Präparierschere einen kleinen Querschnitt in der Nähe des hinteren Endes. (C) Schneiden Sie entlang der ventralen Mittellinie in Richtung des vorderen Endes. (D) Stecken Sie vier Insektennadeln an die vier Ecken der Larve. (E) Verwenden Sie eine Pinzette, um innere Organe zu entfernen, und passen Sie die Position der Stifte an, um die Larve in eine geeignete Position für die Fotografie zu bringen. (F) Phalloidin wird verwendet, um das Zytoskelett zu markieren, um den Muskel zu visualisieren, und HRP wird verwendet, um die Zellmembran von Neuronen zu markieren. Die beobachtete Region des NMJ ist auf Muskel 4 im Segment A3 beschränkt, der mit Anti-HRP (grün) und Phalloidin (magenta) kogefärbt ist. Das rechte Bild zeigt eine schematische Darstellung der lokalen Muskelstruktur. Die Bildgröße beträgt 1024 Pixel x 1024 Pixel, der Digitalzoom 0,6 und ein Abbildungsintervall von ca. 4 μm mit einem 10-fachen Objektiv (numerische Apertur 0,45). (G) Die beobachtete Region der Muskelzellen ist auf Muskel 2 in den Segmenten A3 bis A5 beschränkt, der mit Phalloidin (Magenta) gefärbt ist. Der einzelne Schnitt wird mit einem stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Maßstab: 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Konfokale Aufnahmen von Mikrotubuli innerhalb des NMJ durch Anti-α-Tubulin oder Anti-Futsch. NMJ-Terminale der w-1118-Kontrolle (A), Katanin 60 17A-Mutante (B) und neuronale Überexpression von Katanin 60 (C), co-gefärbt mit Anti-HRP (rot) und Anti-α-Tubulin (grün), sind in der linken Spalte dargestellt. Bei den Bildern handelt es sich um Projektionen von kompletten Z-Stacks durch den gesamten Muskel 4 NMJ des Abdominalsegments A3. Die mittlere Spalte zeigt ein klareres Bild der Mikrotubuli in den NMJ-Terminals, indem die Mikrotubuli aus dem Muskel entfernt werden. Die rechte Spalte zeigt die Morphologie der Mikrotubuli in synaptischen Boutons mit Hilfe der Analysesoftware. Maßstab: 1 μm. NMJ-Terminale verschiedener Genotypen, die mit Anti-HRP (rot) und Anti-Futsch (grün) (D-F) kogefärbt sind. MT-Schleifen wurden durch Pfeile angezeigt. Maßstab: 5 μm. Diese Zahl wurde von22 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Färbung des perinukleären Mikrotubuli-Netzwerks in den Muskelzellen der Drosophila-Larven. (A-C) Die Larvenmuskeln werden mit Anti-α-Tubulin (grün) kogefärbt, um das Mikrotubuli-Netzwerk zu zeigen, und T3605 (blau), um den Zellkern für die w1118-Kontrolle (A), Katanin 60 17A Mutante (B) und Katanin 60 Überexpression im Muskelsystem (C) zu zeigen. Bei den Bildern handelt es sich um Projektionen von kompletten Z-Stapeln vom Auftreten der Mikrotubuli bis zum Zentrum des Kerns. Maßstab: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier wird ein Protokoll für die Dissektion und Immunfärbung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven beschrieben. Es gibt mehrere wesentliche Punkte zu beachten. Erstens ist es entscheidend, Verletzungen der beobachteten Muskeln während des Sezierprozesses zu vermeiden. Es kann sich lohnen, das Filet vor der Entfernung der inneren Organe zu fixieren, um einen direkten Kontakt zwischen der Zange und den Muskeln zu verhindern. Um Muskelschäden oder eine Trennung von der Epidermis der Larve zu vermeiden, ist darauf zu achten, dass die Drehzahl des Schüttlers während des Waschens und Inkubierens 15 U/min nicht überschreitet. Darüber hinaus ist eine präzise Kontrolle der Hautausdehnung erforderlich, um eine klare und vollständige Fotografie der NMJ-Morphologie zu gewährleisten. Es ist ratsam, Vorversuche durchzuführen, um die Antikörperkonzentration, die Fixierung, die Blockierung und die Inkubationszeiten zu optimieren. Die feste Dauer ist auf ca. 40 min begrenzt. Zu kurz oder zu lang ist für die Immunfärbung des Mikrotubuli-Netzwerks nicht förderlich.
Mikrotubuli in Neuronen sind dicht gepackt und mit konventioneller Mikroskopie nur schwer klar zu visualisieren. Im Vergleich zu Neuronen sind die Muskelzellen von Drosophila bemerkenswert groß, wobei Muskel 2 des Segments A3 bis zu 40 μm x 150 μm misst, was ihn für eine hochauflösende Bildgebung zugänglich macht. Daher ist die Verwendung von Drosophila-Muskelzellen zur Untersuchung der Regulation von Mikrotubuli-Netzwerk-assoziierten Proteinen ein intuitiver und klarer Ansatz, der für die Validierung von NMJ-Phänotypen von erheblichem Wert ist20,22,23. Im Vergleich zur vorherigen Methode27 haben wir die Dissektionsrichtung vom dorsalen zum Abdomen geändert, um ein ungehindertes Objekt zu erhalten. Der Elutionspuffer des Muskels mit 0,2 % PBST ist relativ schonend und trägt zum Erhalt der Muskelintegrität bei.
Dieser Ansatz weist noch einige Einschränkungen auf. Als Mikrotubuli-bindendes Protein wird Futsch ausschließlich in Neuronen exprimiert und kann indirekt polymerisierte Mikrotubuli repräsentieren. Wenn jedoch nur Futsch verwendet wird, um das Mikrotubuli-Netzwerk während des Interaktions-Screenings sichtbar zu machen, können einige Kandidatenproteine übersehen werden. α-Tubulin oder β-Tubulin kann das Mikrotubuli-Netzwerk direkt repräsentieren, jedoch liegen diese beiden Proteine sowohl präsynaptisch als auch postsynaptisch vor, und es ist manchmal schwierig, sie zu unterscheiden. Darüber hinaus ist eine große Anzahl von α/β-Tubulin-Heterodimeren im Zytoplasma verteilt, was bedeutet, dass die Markierung von α-Tubulin oder β-Tubulin möglicherweise nicht für die Lebendbildgebung geeignet ist, da sowohl polymerisiertes als auch nicht-polymerisiertes Tubulin gleichzeitig beobachtet werden können.
Die Beobachtung von Mikrotubuli von Motoneuronen bis hin zu Muskelzellen kann ein umfassendes Verständnis der Bewegungsmechanismen aus der Perspektive neuronaler Schaltkreise liefern und die Untersuchung neurologischer Entwicklungsprozesse und der Pathogenese neurologischer Erkrankungen erleichtern. Die Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks in verschiedenen Modellsystemen ist vorteilhaft, um die Genfunktion aus mehreren Perspektiven mit diesem Protokoll zu überprüfen. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die postsynaptischen Rezeptoren von NMJ zu beobachten, was für die Untersuchung der Kommunikation zwischen Synapsen und der synaptischen Plastizität von Vorteil ist.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Ying Xiong für die Diskussionen und Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wird durch ein Stipendium der National Science Foundation of China (NSFC) an C. M. (31500839) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
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