Summary
여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.
Abstract
미세소관 네트워크는 신경계의 필수 구성 요소입니다. 많은 미세소관 조절 단백질의 돌연변이는 신경퇴행성 질환에 대한 미세소관 관련 단백질 타우(Tau), 미세소관 절단 단백질 스파스틴(Spastin) 및 카타닌 60(Katanin 60)과 같은 신경 발달 장애 및 신경 발달 질환과 관련이 있습니다. 뉴런에서 미세소관 네트워크를 검출하는 것은 신경 장애의 발병 기전을 밝히는 데 유리합니다. 그러나 뉴런의 크기가 작고 축삭 미세소관 다발이 조밀하게 배열되어 있어 미세소관 네트워크를 시각화하는 것이 어렵습니다. 이 연구에서는 유충 신경근 접합부와 근육 세포의 해부 방법과 α-튜불린 및 미세소관 관련 단백질 Futsch의 면역염색을 통해 Drosophila melanogaster의 미세소관 네트워크를 시각화하는 방법을 설명합니다. 신경근 접합부는 시냅스 전후 미세소관을 모두 관찰할 수 있게 해주며, 초파리 유충의 근육 세포는 크기가 커서 미세소관 네트워크를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에서 카타닌 60을 돌연변이시키고 과발현시킨 다음 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 조사하여 신경 발달에서 카타닌 60의 조절 역할을 정확하게 밝힙니다. 그러므로, Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합해, 이 의정서는 매우 신경계에 있는 microtubule 네트워크 통제 단백질의 역할을 위한 유전자 검열 그리고 microtubule 역동성 분석을 촉진합니다.
Introduction
미세소관(MT)은 세포골격의 구조적 구성 요소 중 하나로서 세포 분열, 세포 성장 및 운동성, 세포 내 수송, 세포 모양 유지 등 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 미세소관의 역학 및 기능은 MAP1, MAP2, Tau, Katanin 및 Kinesin 1,2,3,4,5와 같은 다른 단백질과의 상호 작용에 의해 조절됩니다.
뉴런에서 미세소관은 축삭돌기와 수상돌기의 발달과 유지에 필수적입니다. 미세소관의 이상은 기능 장애와 심지어 뉴런의 죽음으로 이어집니다. 예를 들어, 알츠하이머 환자의 뇌에서 타우 단백질 과인산화는 미세소관 네트워크의 안정성을 감소시켜 신경학적 불규칙성을 유발한다6. 따라서 미세소관 네트워크를 검사하는 것은 신경 발달과 신경 질환의 발병 기전을 이해하는 데 기여할 것입니다.
신경근 접합부(NMJ)는 운동 뉴런 축삭 말단과 근육 섬유 사이에 형성된 말초 시냅스로, 시냅스 구조와 기능을 연구하기 위한 우수하고 강력한 모델 시스템이다7. Futsch는 포유류에서 발견되는 미세소관 결합 단백질 MAP1B와 상동적인 초파리의 단백질입니다8. 그것은 뉴런에서만 발현되며 NMJ의 시냅스 버튼 8,9의 발달에 중요한 역할을합니다. 야생형에서 NMJ 공정의 중심을 따라 흐르는 사상 다발은 anti-Futsch를 사용한 면역염색을 통해 시각화됩니다. NMJ의 말단에 도달하면, 이 다발은 미세소관으로 구성된 고리를 형성하거나 사상 구조를 잃게 되어, 확산 및 반점 모양(10)을 형성할 수 있다. 미세소관 고리는 일시 중지된 성장 원뿔과 관련이 있으며, 이는 미세소관 배열이 안정적임을 시사한다11. 따라서 Futsch 염색을 통해 NMJ에서 안정적인 미세소관 발달을 간접적으로 확인할 수 있습니다. 초파리 유충의 근육 세포의 크기가 크기 때문에 미세소관 네트워크를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 미세소관 네트워크의 안정성에 영향을 미치는 요인은 미세소관의 밀도와 모양을 분석하여 찾을 수 있습니다. 동시에 근육 세포의 미세소관 네트워크 상태를 NMJ 결과와 교차 검증하여 보다 포괄적인 결론을 얻을 수 있습니다.
미세소관의 네트워크와 역학을 조사하기 위해 많은 프로토콜이 사용되었습니다. 그러나, 이러한 연구들은 종종 시험관 내 연구(in vitro studies)12,13,14,15,16에 초점을 맞추었다. 대안적으로, 일부 생체내 실험은 세포골격(17)을 검출하기 위해 전자 현미경을 이용하였다. 형광 표지된 항체 또는 화학 염료가 단백질 또는 DNA에 특이적으로 결합하는 것에 따르면, 여기에 제시된 방법을 사용하면 생체 내 개별 뉴런 수준에서 NMJ의 미세소관 네트워크를 검출할 수 있으며, 결과는 근육 세포의 관찰에 의해 확증됩니다. 이 프로토콜은 Drosophila melanogaster에서 사용할 수 있는 강력한 유전 도구와 결합할 때 간단하고 안정적이며 반복 가능하여 생체 내 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 다양한 표현형 검사 및 유전자 스크리닝을 가능하게 합니다.
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Protocol
1. 유충 해부
알림: 해부 용액 혈림프 유사 식염수(HL3.1)18 및 고정 용액 4% 파라포름알데히드(PFA)19,20은 온도가 너무 낮을 때 미세소관이 해중합되기 때문에 실온에서 사용됩니다.
- 길고 뭉툭한 집게로 방황하는 3번째 인스타 유충을 골라냅니다. HL3.1로 세척하고 실체현미경 아래의 해부 접시에 놓습니다.
참고: 방황하는 3번째 인스타 유충은 분지된 전방 나선으로 식별되며 약 96시간(25°C)21에서 튜브 주위를 기어 다닙니다. - 등쪽이나 배쪽이 위로 향하도록 유충을 배치합니다. 두 개의 긴 기관으로 등쪽을 식별하고 복부 치아 벨트로 복부를 식별합니다.
- 관찰할 조직에 따라 등쪽 또는 복부 절개를 선택하십시오. 이렇게 하면 특정 관심 영역을 보다 정확하고 자세하게 볼 수 있습니다. NMJ 및 근육 세포 관찰을 위해 유충 등쪽과 복부 부위를 각각 절개합니다.
- 입 고리와 꼬리를 고정합니다. 핀을 조정하여 유충을 확장된 상태로 유지합니다. HL3.1 한 방울을 유충에 떨어뜨려 유충이 마르지 않도록 합니다.
알림: Ca2+ -free HL 3.1은 해부 중 근육 수축을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다. - 해부 가위를 사용하여 뒤쪽 끝 가까이에 작은 가로 절단을 하되 뒤쪽 끝을 자르지 마십시오. 그런 다음 복부 정중선을 따라 앞쪽 끝을 향해 자릅니다.
- 유충의 네 모서리에 4 개의 곤충 핀을 삽입하십시오. 유충이 모든 방향으로 최대한 늘어나도록 곤충 핀을 다시 조정하십시오.
- 집게를 사용하여 근육을 손상시키지 않으면서 내부 장기를 제거합니다.
2. 고정
- 100μL의 PFA(4%)를 추가하여 사체가 해부 접시에 고정되어 있는 동안 사체를 40분 동안 담그십시오.
주의 : PFA는 위험하므로 피부와의 직접적인 접촉이나 흡입을 피하기 위해 효과적인 보호 조치를 취합니다. - 핀을 분리하고 샘플을 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 0.2% Triton X-100(0.2% PBST)을 함유한 1x 인산염 완충 식염수로 PFA를 헹구어 15rpm의 탈색 셰이커에서 10분 동안 2mL 미세 원심분리기 튜브를 채웁니다. 세탁 과정을 5회 반복합니다.
3. 면역세포화학
- 사체를 차단제(0.2% PBST에 5% 염소 혈청)에 담그고 실온에서 40분 동안 차단합니다.
- 차단제를 제거하고 4°C에서 밤새 0.2% PBST로 희석한 200μL의 1차 항체(예: anti-α-tubulin, 1:1000; anti-Futsch, 1:50)로 교체합니다. 단클론 항α-튜불린(anti--tubulin)으로 면역염색을 통해 근육 미세소관을 시각화합니다. Anti-Futsch는 NMJ의 미세소관 형태를 간접적으로 반영할 수 있습니다.
- 1차 항체를 배양한 후 0.2% PBST로 유충을 10분 동안 세척하고 5회 반복합니다.
- 0.2% PBST로 희석한 200μL의 2차 항체(예: goat anti-Mouse-488, 1:1000)로 유충을 어두운 곳에서 실온에서 1.5시간 동안 배양합니다.
- 다음으로, 어두운 곳에서 미세소관을 염색할 때 3605:1000 농도의 TO-PRO(R) 3 요오드화물(T20,22)과 같은 핵 염료를 배양 튜브에 추가합니다.
- 2차 항체와 핵 염료를 0.2% PBST로 10분 동안 헹굽니다. 어둠 속에서 5회 반복합니다.
4. 장착
- 유충 사체를 유리 슬라이드에 0.2% PBST로 놓고 실체현미경으로 조정합니다. 유충 사체의 내부 표면이 위를 향하고 모든 유충 사체가 원하는 대로 배열되었는지 확인하십시오.
- 물티슈로 과도한 PBST 용액을 흡수하고 페이드 방지 장착 매체를 부드럽게 추가합니다.
- 슬라이드에 커버슬립을 놓아 해부된 유충을 천천히 부드럽게 덮어 기포가 생기지 않도록 합니다.
- 커버슬립 주위에 손톱 광택제를 바릅니다. 형광 감쇠를 줄이기 위해 슬라이드를 어두운 공간에 놓으십시오.
5. 이미지 취득
- 이미지를 획득하려면 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 60x 오일 이멀젼 대물렌즈(개구수 1.42) 또는 이와 유사한 것을 선택하고 실험에 따라 레이저 출력과 파장을 조정합니다.
- NMJ를 식별하려면 세그먼트 A4의 근육 3에서 이미지를 캡처합니다( 그림 1F의 위치 참조). 488nm 레이저를 선택하여 α-tubulin 또는 Futsch를 활성화하고 543nm를 선택하여 HRP 이미징 트랙을 활성화합니다. 파라미터를 800픽셀 x 800픽셀의 프레임 크기, 2.0의 디지털 줌, 0.8μm의 이미징 간격(NMJ)으로 조정합니다(그림 2).
- 근육의 미세소관을 식별하려면 기관 가지가 더 적기 때문에 세그먼트 A3-A5( 그림 1G의 위치 참조)에서 근육 2의 이미지를 캡처합니다. α-튜불린을 활성화하기 위해 488nm 레이저를 선택하고 T3605 이미징 트랙을 활성화하기 위해 635nm 레이저를 선택하십시오. 파라미터를 1024픽셀 x 1024픽셀의 프레임 크기, 3.0의 디지털 줌, 근육 세포의 이미징 간격 0.4μm로 조정합니다(그림 3).
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Representative Results
우리는 신경근 접합부(NMJ)와 근육 세포 모두에서 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 단계별 절차를 시연했습니다. 개략도(그림 1A-E)에 따라 해부한 후 면역염색을 수행하고 레이저 컨포칼 현미경 또는 입체 형광 현미경(그림 1F,G)으로 이미지를 관찰 및 수집합니다.
NMJ의 시냅스 전후 미세소관 조직 모두 항α-튜불린으로 표지할 수 있으며, 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경의 층 두께를 선택하여 다양한 절편의 미세소관 형태를 표시할 수 있습니다(그림 2A-C). Futsch는 또한 뉴런의 축삭에 있는 미세소관 조직을 밝혀 신경 추적에 사용되었습니다. Anti-HRP는 신경 세포막 10,23,24를 표시하는 데 사용됩니다. 항-Futsch 및 항-HRP 항체와의 동시 염색은 뉴런의 축삭돌기에서 미세소관 상태를 검출하기 위해 수행됩니다. Futsch 염색은 NMJ9의 시냅스전 뉴런(presynaptic neuron)에 있는 안정된 미세소관의 풍부함을 반영할 수 있다. 튜불린 특이적 샤페론 E(TBCE)는 MT 세포골격의 발달에 중요한 역할을 합니다. TBCE가 시냅스전 뉴런에서 녹다운되면 항-풋쉬의 신호는 약해지고 얇아지며 말단 부톤의 염색은 불분명하거나 부재하다23. 타우(Tau)는 미세소관 조립 및 안정화에 중요한 역할을 하는 미세소관 관련 단백질이다25,26. 인간 야생형 및 돌연변이 인간 타우 단백질의 이소성 발현을 갖는 초파리에서, NMJ 말단에서 Futsch 신호의 강도가 감소하는 것으로 나타났다20. Futsch 염색 결과에 따르면, 축삭돌기 줄기의 염색 강도는 가지의 염색 강도보다 강했습니다(그림 2D-F). 가지 끝에 있는 미세소관은 덜 안정적이고 형태학적 변화가 더 발생하기 쉽기 때문에 말단 미세소관을 염색하여 미세소관의 역학을 반영할 수 있습니다.
미세소관의 형태학적 변화도 쉽게 시각화할 수 있다22. 미세소관 루프는 항-Futsch와 항-α-튜불린으로 염색할 수 있습니다. 또한 단일 루프의 모양을 명확하게 표시할 수 있어 정량 분석이 용이합니다. 예를 들어, 카타닌은 미세소관 역학 조절에 중요한 역할을 하는 미세소관 절단 단백질입니다. 촉매 서브유닛 카타닌(Katanin) 60은 미세소관(22)의 형태에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. Mao는 P-원소 매개 절제에 의해 Katanin 60 돌연변이를 구성하고, 51D의 두 번째 염색체에 pUAST-attB-Katanin 60을 삽입하여 uas-Katanin 60을 구성했습니다. Katanin 6017A 돌연변이로 인한 미세소관 루프의 증가는 명확하게 입증되었습니다(그림 2A,B,D,E). 또한, Katanin 60의 과발현에서 짧은 MT 단편은 말단 부톤 내에서도 유의하게 관찰될 수 있습니다(그림 2C).
미세소관 네트워크는 근육 세포에서 α-튜불린 항체로 염색하여 관찰할 수 있습니다. 핵 주위를 뻗어 있는 미세소관의 네트워크가 명확하게 보였다(그림 3A). 미세소관 절단 단백질 카타닌(Katanin)은 미세소관 네트워크(22)의 분포를 조절한다. Katanin 6017A 돌연변이에서 근육 세포는 야생형에 비해 핵 주위 MT 강도가 크게 증가했으며 더 강한 다발을 나타냈습니다(그림 3B). Katanin 60 의 과발현으로 인한 미세소관 섬유의 단편화가 나타났습니다(그림 3C). 따라서 이 프로토콜은 뉴런과 근육 세포 모두에서 미세소관 네트워크 시각화를 가능하게 합니다.
그림 1. 초파리 유충의 등쪽 해부 절차. (A-E) 유충 사체를 준비하는 절차 (21에서 수정 됨). (A) 유충의 입 고리와 꼬리에 각각 두 개의 핀을 삽입합니다. (B) 해부 가위를 사용하여 뒤쪽 끝 가까이에 작은 가로 절단을 만듭니다. (C) 복부 정중선을 따라 앞쪽 끝을 향해 자릅니다. (D) 유충의 네 모서리에 4개의 곤충 핀을 삽입합니다. (이자) 집게를 사용하여 내부 장기를 제거하고 핀의 위치를 재조정하여 유충을 사진 촬영에 적합한 위치에 놓습니다. (F) 팔로이딘(Phalloidin)은 근육을 시각화하기 위해 세포골격(cytoskeleton)을 표지하는 데 사용되며, HRP는 뉴런의 세포막을 표지하는 데 사용됩니다. NMJ의 관찰 영역은 항 HRP(녹색) 및 팔로이딘(자홍색)과 함께 염색된 세그먼트 A3의 근육 4로 제한됩니다. 오른쪽 패널은 국소 근육 구조의 개략도를 보여줍니다. 1024픽셀 x 1024픽셀의 프레임 크기, 0.6의 디지털 줌, 10x 대물 렌즈(개구수 0.45)를 사용한 약 4μm의 이미징 간격. (G) 근육 세포의 관찰 영역은 팔로이딘(자홍색)으로 염색된 세그먼트 A3 내지 A5의 근육 2로 제한됩니다. 단일 섹션은 입체 형광 현미경으로 캡처됩니다. 척도 막대: 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 항α-튜불린 또는 항-Futsch에 의한 NMJ 내 미세소관의 공초점 이미지. 항-HRP(적색) 및 항-α-튜불린(녹색)과 함께 염색된 w1118 대조군(A), Katanin 6017A 돌연변이(B) 및 Katanin 60 (C)의 신경 과발현의 NMJ 말단이 왼쪽 열에 나와 있습니다. 이미지는 복부 분절 A3의 전체 근육 4NMJ를 통한 완전한 z-스택의 투영입니다. 중간 열은 근육에서 미세소관을 제거하여 NMJ 말단의 미세소관에 대한 더 선명한 이미지를 보여줍니다. 오른쪽 열은 분석 소프트웨어를 사용하여 시냅스 부톤에서 미세소관의 형태를 보여줍니다. 척도 막대: 1 μm. 항-HRP(빨간색) 및 항-Futsch(녹색)(DF)와 함께 염색된 다양한 유전자형의 NMJ 말단. MT 루프는 화살표로 표시되었습니다. 척도 막대: 5 μm. 이 수치는22에서 조정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. Drosophila 유충 근육 세포의 핵 주위 미세소관 네트워크 염색. (A-C) 유충 근육은 미세소관 네트워크를 보여주기 위해 항α-튜불린(녹색)과 함께 염색되고 근육 시스템(C)에서 w1118 대조군(A), Katanin 60 17A 돌연변이(B) 및 Katanin 60 과발현에 대한 핵을 보여주기 위해 T3605(파란색)와 함께 염색됩니다. 이미지는 미세소관의 모양에서 핵의 중심까지 완전한 z-스택에서 투영한 것입니다. 기준자: 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서는 초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포의 해부 및 면역염색을 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 고려해야 할 몇 가지 필수 사항이 있습니다. 첫째, 관찰된 근육의 부상을 피하는 것은 해부 과정에서 매우 중요합니다. 집게와 근육 사이의 직접적인 접촉을 방지하기 위해 내부 장기를 제거하기 전에 필렛을 고정하는 것이 좋습니다. 근육 손상이나 유충 표피로부터의 분리를 방지하려면 세척 및 배양 중에 셰이커의 속도가 15rpm을 초과하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 또한 NMJ 형태를 선명하고 완벽하게 촬영하기 위해서는 피부 확장에 대한 정밀한 제어가 필요합니다. 항체 농도, 고정, 차단 및 배양 시간을 최적화하기 위해 예비 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 고정 시간은 약 40분으로 제한됩니다. 너무 짧거나 너무 길면 미세소관 네트워크의 면역염색에 도움이 되지 않습니다.
뉴런의 미세소관은 조밀하게 밀집되어 있어 기존 현미경으로 명확하게 시각화하기 어렵습니다. 뉴런과 비교했을 때, 초파리의 근육 세포는 현저히 커서 세그먼트 A3의 근육 2가 최대 40μm x 150μm로 측정되어 고해상도 이미징이 가능합니다. 따라서 미세소관 네트워크 관련 단백질의 조절을 조사하기 위해 초파리 근육 세포를 활용하는 것은 NMJ 표현형20,22,23을 검증하는 데 중요한 가치를 지니는 직관적이고 명쾌한 접근 방식입니다. 앞의 방법(27)과 비교하여, 방해받지 않는 물체를 얻기 위해 해부 방향을 등쪽에서 복부로 변경하였다. 0.2% PBST가 함유된 근육의 용출 완충액은 비교적 부드러우며 근육 무결성을 보존하는 데 도움이 됩니다.
이 접근 방식에는 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 미세소관 결합 단백질인 Futsch는 뉴런에서만 발현되며 중합된 미세소관을 간접적으로 나타낼 수 있습니다. 그러나 상호 작용 스크리닝 중에 미세소관 네트워크를 시각화하는 데 Futsch만 사용하는 경우 일부 후보 단백질을 놓칠 수 있습니다. α-튜불린 또는 β-튜불린은 미세소관 네트워크를 직접 나타낼 수 있지만, 이 두 단백질은 시냅스 전과 시냅스 후를 모두 나타내며 때로는 구별하기 어렵습니다. 더욱이, 많은 수의 α/β-튜불린 헤테로다이머가 세포질에 분포되어 있는데, 이는 중합된 튜불린과 중합되지 않은 튜불린을 동시에 관찰할 수 있기 때문에 α-튜불린 또는 β-튜불린을 라벨링하는 것이 라이브 이미징에 적합하지 않을 수 있음을 의미합니다.
운동 뉴런에서 근육 세포에 이르는 미세소관을 관찰하면 신경 회로의 관점에서 운동 메커니즘을 포괄적으로 이해할 수 있어 신경 발달 과정과 신경 질환의 발병 기전에 대한 연구를 촉진할 수 있습니다. 다양한 모델 시스템에서 미세소관 네트워크를 시각화하는 것은 이 프로토콜을 사용하여 여러 관점에서 유전자 기능을 검증하는 데 유용합니다. 이 방법은 NMJ의 시냅스후 수용체를 관찰하는 데에도 사용할 수 있으며, 이는 시냅스와 시냅스 가소성 사이의 통신 연구에 유용합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
원고에 대한 토론과 논평을 해주신 Ying Xiong 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립과학재단(NSFC)이 C. M.(31500839)에 제공한 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
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