초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화
Summary
여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.
Abstract
미세소관 네트워크는 신경계의 필수 구성 요소입니다. 많은 미세소관 조절 단백질의 돌연변이는 신경퇴행성 질환에 대한 미세소관 관련 단백질 타우(Tau), 미세소관 절단 단백질 스파스틴(Spastin) 및 카타닌 60(Katanin 60)과 같은 신경 발달 장애 및 신경 발달 질환과 관련이 있습니다. 뉴런에서 미세소관 네트워크를 검출하는 것은 신경 장애의 발병 기전을 밝히는 데 유리합니다. 그러나 뉴런의 크기가 작고 축삭 미세소관 다발이 조밀하게 배열되어 있어 미세소관 네트워크를 시각화하는 것이 어렵습니다. 이 연구에서는 유충 신경근 접합부와 근육 세포의 해부 방법과 α-튜불린 및 미세소관 관련 단백질 Futsch의 면역염색을 통해 Drosophila melanogaster의 미세소관 네트워크를 시각화하는 방법을 설명합니다. 신경근 접합부는 시냅스 전후 미세소관을 모두 관찰할 수 있게 해주며, 초파리 유충의 근육 세포는 크기가 커서 미세소관 네트워크를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 여기에서는 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에서 카타닌 60을 돌연변이시키고 과발현시킨 다음 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 조사하여 신경 발달에서 카타닌 60의 조절 역할을 정확하게 밝힙니다. 그러므로, Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합해, 이 의정서는 매우 신경계에 있는 microtubule 네트워크 통제 단백질의 역할을 위한 유전자 검열 그리고 microtubule 역동성 분석을 촉진합니다.
Introduction
미세소관(MT)은 세포골격의 구조적 구성 요소 중 하나로서 세포 분열, 세포 성장 및 운동성, 세포 내 수송, 세포 모양 유지 등 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다. 미세소관의 역학 및 기능은 MAP1, MAP2, Tau, Katanin 및 Kinesin 1,2,3,4,5와 같은 다른 단백질과의 상호 작용에 의해 조절됩니다.
뉴런에서 미세소관은 축삭돌기와 수상돌기의 발달과 유지에 필수적입니다. 미세소관의 이상은 기능 장애와 심지어 뉴런의 죽음으로 이어집니다. 예를 들어, 알츠하이머 환자의 뇌에서 타우 단백질 과인산화는 미세소관 네트워크의 안정성을 감소시켜 신경학적 불규칙성을 유발한다6. 따라서 미세소관 네트워크를 검사하는 것은 신경 발달과 신경 질환의 발병 기전을 이해하는 데 기여할 것입니다.
신경근 접합부(NMJ)는 운동 뉴런 축삭 말단과 근육 섬유 사이에 형성된 말초 시냅스로, 시냅스 구조와 기능을 연구하기 위한 우수하고 강력한 모델 시스템이다7. Futsch는 포유류에서 발견되는 미세소관 결합 단백질 MAP1B와 상동적인 초파리의 단백질입니다8. 그것은 뉴런에서만 발현되며 NMJ의 시냅스 버튼 8,9의 발달에 중요한 역할을합니다. 야생형에서 NMJ 공정의 중심을 따라 흐르는 사상 다발은 anti-Futsch를 사용한 면역염색을 통해 시각화됩니다. NMJ의 말단에 도달하면, 이 다발은 미세소관으로 구성된 고리를 형성하거나 사상 구조를 잃게 되어, 확산 및 반점 모양(10)을 형성할 수 있다. 미세소관 고리는 일시 중지된 성장 원뿔과 관련이 있으며, 이는 미세소관 배열이 안정적임을 시사한다11. 따라서 Futsch 염색을 통해 NMJ에서 안정적인 미세소관 발달을 간접적으로 확인할 수 있습니다. 초파리 유충의 근육 세포의 크기가 크기 때문에 미세소관 네트워크를 명확하게 시각화할 수 있습니다. 미세소관 네트워크의 안정성에 영향을 미치는 요인은 미세소관의 밀도와 모양을 분석하여 찾을 수 있습니다. 동시에 근육 세포의 미세소관 네트워크 상태를 NMJ 결과와 교차 검증하여 보다 포괄적인 결론을 얻을 수 있습니다.
미세소관의 네트워크와 역학을 조사하기 위해 많은 프로토콜이 사용되었습니다. 그러나, 이러한 연구들은 종종 시험관 내 연구(in vitro studies)12,13,14,15,16에 초점을 맞추었다. 대안적으로, 일부 생체내 실험은 세포골격(17)을 검출하기 위해 전자 현미경을 이용하였다. 형광 표지된 항체 또는 화학 염료가 단백질 또는 DNA에 특이적으로 결합하는 것에 따르면, 여기에 제시된 방법을 사용하면 생체 내 개별 뉴런 수준에서 NMJ의 미세소관 네트워크를 검출할 수 있으며, 결과는 근육 세포의 관찰에 의해 확증됩니다. 이 프로토콜은 Drosophila melanogaster에서 사용할 수 있는 강력한 유전 도구와 결합할 때 간단하고 안정적이며 반복 가능하여 생체 내 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 다양한 표현형 검사 및 유전자 스크리닝을 가능하게 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포의 해부 및 면역염색을 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 고려해야 할 몇 가지 필수 사항이 있습니다. 첫째, 관찰된 근육의 부상을 피하는 것은 해부 과정에서 매우 중요합니다. 집게와 근육 사이의 직접적인 접촉을 방지하기 위해 내부 장기를 제거하기 전에 필렛을 고정하는 것이 좋습니다. 근육 손상이나 유충 표피로부터의 분리를 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고에 대한 토론과 논평을 해주신 Ying Xiong 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립과학재단(NSFC)이 C. M.(31500839)에 제공한 보조금으로 지원됩니다.
Materials
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
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