Summary
Burada, nöromüsküler kavşaklar ve kas hücrelerindeki mikrotübül ağlarını görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Drosophila melanogaster'in güçlü genetik araçlarıyla birleştiğinde, bu protokol, sinir sistemindeki mikrotübül ağı düzenleyici proteinlerin rolü için genetik taramayı ve mikrotübül dinamiği analizini büyük ölçüde kolaylaştırır.
Abstract
Mikrotübül ağı, sinir sisteminin önemli bir bileşenidir. Birçok mikrotübül düzenleyici proteindeki mutasyonlar nörogelişimsel bozukluklar ve nörolojik hastalıklarla ilişkilidir, örneğin mikrotübül ile ilişkili protein Tau nörodejeneratif hastalıklara, mikrotübül ayırıcı protein Spastin ve Katanin 60 sırasıyla kalıtsal spastik paraplejiye ve nörogelişimsel anormalliklere neden olur. Nöronlardaki mikrotübül ağlarının saptanması, nörolojik bozuklukların patogenezinin aydınlatılmasında avantajlıdır. Bununla birlikte, nöronların küçük boyutu ve aksonal mikrotübül demetlerinin yoğun düzenlenmesi, mikrotübül ağlarını görselleştirmeyi zorlaştırır. Bu çalışmada, larva nöromüsküler kavşağı ve kas hücrelerinin diseksiyonunun yanı sıra Drosophila melanogaster'deki mikrotübül ağlarını görselleştirmek için α-tübülin ve mikrotübül ile ilişkili protein Futsch'un immün boyaması için bir yöntem tanımlanmıştır. Nöromüsküler kavşak, hem sinaptik öncesi hem de sonrası mikrotübülleri gözlemlememize izin verir ve Drosophila larvasındaki büyük kas hücreleri, mikrotübül ağının net bir şekilde görüntülenmesini sağlar. Burada, Drosophila melanogaster'de Katanin 60'ı mutasyona uğratarak ve aşırı eksprese ederek ve daha sonra nöromüsküler kavşak ve kas hücrelerindeki mikrotübül ağlarını inceleyerek, Katanin 60'ın nörogelişimdeki düzenleyici rolünü doğru bir şekilde ortaya koyuyoruz. Bu nedenle, Drosophila melanogaster'in güçlü genetik araçlarıyla birleştiğinde, bu protokol, sinir sistemindeki mikrotübül ağı düzenleyici proteinlerin rolü için genetik taramayı ve mikrotübül dinamiği analizini büyük ölçüde kolaylaştırır.
Introduction
Hücre iskeletinin yapısal bileşenlerinden biri olan mikrotübüller (MT'ler), hücre bölünmesi, hücre büyümesi ve hareketliliği, hücre içi taşıma ve hücre şeklinin korunması dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Mikrotübül dinamikleri ve işlevi, MAP1, MAP2, Tau, Katanin ve Kinesin 1,2,3,4,5 gibi diğer proteinlerle etkileşimlerle modüle edilir.
Nöronlarda, mikrotübüller aksonların ve dendritlerin gelişimi ve bakımı için gereklidir. Mikrotübüllerdeki anormallikler işlev bozukluğuna ve hatta nöronların ölümüne yol açar. Örneğin, Alzheimer hastalarının beyninde, Tau protein hiperfosforilasyonu, mikrotübül ağının stabilitesini azaltarak nörolojik düzensizliklere neden olur6. Bu nedenle, mikrotübül ağlarının incelenmesi, nörogelişimin ve nörolojik hastalıkların patogenezinin anlaşılmasına katkıda bulunacaktır.
Nöromüsküler kavşak (NMJ), sinaptik yapı ve işlevleri incelemek için mükemmel ve güçlü bir model sistem olan bir motor nöron akson terminali ile bir kas lifi arasında oluşan periferik sinapstır7. Futsch, Drosophila'da memelilerde bulunan mikrotübül bağlayıcı protein MAP1B'ye homolog olan bir proteindir8. Sadece nöronlarda eksprese edilir ve NMJ'nin sinaptik düğmeleriningelişiminde rol oynar 8,9. Yabani tipte, NMJ işlemlerinin merkezi boyunca uzanan filamentli demetler, anti-Futsch ile immün boyama ile görselleştirilir. NMJ'nin sonuna ulaştığında, bu demet ya mikrotübüllerden oluşan bir halka oluşturma ya da ipliksi yapısını kaybetme yeteneğine sahiptir, bu da dağınık ve noktasal bir görünümeneden olur 10. Mikrotübül döngüleri, duraklatılmış büyüme konileri ile ilişkilidir, bu da mikrotübül dizisinin kararlıolduğunu gösterir 11. Bu nedenle, NMJ'deki kararlı mikrotübül gelişimini Futsch boyama ile dolaylı olarak belirleyebiliriz. Drosophila larvasındaki büyük kas hücreleri, mikrotübül ağının net bir şekilde görüntülenmesini sağlar. Mikrotübül ağının stabilitesini etkileyen faktörler, mikrotübüllerin yoğunluğu ve şekli analiz edilerek bulunabilir. Aynı zamanda, kas hücrelerinin mikrotübül ağ durumu, daha kapsamlı sonuçlar elde etmek için NMJ sonucu ile çapraz doğrulanabilir.
Mikrotübüllerin ağını ve dinamiklerini araştırmak için birçok protokol kullanılmıştır. Ancak bu araştırmalar sıklıkla in vitro çalışmalaraodaklanmıştır 12,13,14,15,16. Alternatif olarak, bazı in vivo deneylerde hücre iskeletini tespit etmek için elektron mikroskobukullanılmıştır 17. Floresan etiketli antikorların veya kimyasal boyaların proteinlere veya DNA'ya spesifik bağlanmasına göre, burada sunulan yöntemler, NMJ'deki mikrotübül ağlarının in vivo olarak bireysel nöronlar düzeyinde saptanmasına izin verir ve sonuçlar kas hücrelerindeki gözlemlerle doğrulanır. Bu protokol, Drosophila melanogaster'de bulunan güçlü genetik araçlarla birleştirildiğinde basit, kararlı ve tekrarlanabilir olup, mikrotübül ağ düzenleyici proteinlerin sinir sistemindeki rolü için çok çeşitli fenotipik incelemelere ve genetik taramalara olanak tanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Larvaların diseksiyonu
NOT: Diseksiyon solüsyonu hemolenf benzeri salin (HL3.1)18 ve sabitleme solüsyonu %4 paraformaldehit (PFA)19,20 oda sıcaklığında kullanılır, çünkü sıcaklık çok düşük olduğunda mikrotübüller depolimerize olur.
- Uzun künt forsepsli dolaşan bir 3. instar larvası seçin. HL3.1 ile yıkayın ve stereomikroskop altında diseksiyon kabına yerleştirin.
NOT: Gezici 3. instar larva, dallanmış anterior spiracle ile tanımlanır ve yaklaşık 96 saat (25 °C) 21'de tüpün etrafında sürünür. - Larvaları dorsal veya ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Dorsal tarafı iki uzun trakea ile ve ventrali abdominal diş eti kayışları ile tanımlayın.
- Gözlemlenecek dokuya bağlı olarak, dorsal veya ventral diseksiyonu tercih edin. Bu, belirli bir ilgi alanının daha kesin ve ayrıntılı bir görünümünü sağlayacaktır. NMJ ve kas hücresi gözlemi için sırasıyla larva dorsal ve ventral bölgeleri kesin.
- Ağız kancalarını ve kuyruğu sabitleyin. Larvaları uzatılmış durumda tutmak için pimleri ayarlayın. Kurumasını önlemek için larvaya bir damla HL3.1 ekleyin.
NOT: Diseksiyon sırasında kasların kasılmasını en aza indirmek için Ca2+ içermeyen HL 3.1 kullanılabilir. - Arka uca yakın küçük bir enine kesim yapmak için diseksiyon makasını kullanın, ancak arka ucu kesmeyin. Sonra ventral orta hat boyunca ön uca doğru kesin.
- Larvaların dört köşesine dört böcek iğnesi yerleştirin. Böcek pimlerini, larva her yöne maksimum gerilecek şekilde yeniden ayarlayın.
- Kaslara zarar vermeden iç organları çıkarmak için forseps kullanın.
2. Fiksasyon
- Karkaslar hala diseksiyon kabına tutturulmuşken karkasları 40 dakika daldırmak için 100 μL PFA (%4) ekleyin.
DİKKAT: PFA bir tehlike olduğundan, cilt ile doğrudan teması veya solumayı önlemek için etkili koruma önlemleri alınır. - Pimleri sökün ve numuneyi 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. PFA'yı %0,2 Triton X-100 (%0,2 PBST) içeren 1x fosfat tamponlu salin ile durulayın ve 2 mL mikrosantrifüj tüpünü 15 rpm'de renk açıcı çalkalayıcıda 10 dakika doldurun. Yıkama işlemini 5 kez tekrarlayın.
3. İmmünositokimya
- Karkasları bloke edici maddeye (%0.2 PBST'de %5 keçi serumu) daldırın ve oda sıcaklığında 40 dakika bloke edin.
- Bloke edici ajanı çıkarın ve 200 μL primer antikor ile değiştirin (ör., anti-α-tubulin, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) gece boyunca 4 ° C'de% 0.2 PBST ile seyreltilir. Monoklonal anti-α-tubulin ile immün boyama yaparak kas mikrotübüllerini görselleştirin. Anti-Futsch, NMJ'deki mikrotübül morfolojisini dolaylı olarak yansıtabilir.
- Primer antikorun inkübasyonundan sonra, larvaları 10 dakika boyunca% 0.2 PBST ile yıkayın.
- Larvaları 200 μL ikincil antikor ile inkübe edin (ör., keçi anti-Mouse-488, 1:1000) karanlıkta 1.5 saat oda sıcaklığında% 0.2 PBST ile seyreltilmiş.
- Daha sonra, mikrotübülleri karanlıkta boyarken 3605:1000 konsantrasyonda inkübasyon tüpüne 1:1000 konsantrasyonda TO-PRO(R)20,22 iyodür (T30) gibi bir nükleer boya ekleyin.
- İkincil antikoru ve nükleer boyayı% 0.2 PBST ile 10 dakika durulayın. Karanlıkta 5x tekrarlayın.
4. Montaj
- Larva karkasını bir cam slayt üzerine% 0.2 PBST'ye yerleştirin ve stereomikroskop altında ayarlayın. Larva karkasının iç yüzeyinin yukarı baktığından ve tüm larva karkaslarının istenildiği gibi düzenlendiğinden emin olun.
- Fazla PBST çözeltisini bir mendille emdirin ve nazikçe bir damla antifade montaj ortamı ekleyin.
- Kabarcıkları önlemek için disseke edilen larvaları yavaşça ve nazikçe örtmek için slaydın üzerine bir lamel yerleştirin.
- Lamelin etrafına oje sürün. Floresan zayıflamasını azaltmak için slaytı karanlık alana yerleştirin.
5. Görüntü edinme
- Görüntüleri elde etmek için bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın, 60x yağa daldırma objektifini (sayısal açıklık 1.42) veya benzerini seçin ve deneye göre lazer gücünü ve dalga boyunu ayarlayın.
- NMJ'yi tanımlamak için, A3 segmentindeki kas 4'teki görüntüleri yakalayın ( Şekil 1F'deki konumda gösterildiği gibi). α-tubulin veya Futsch'u etkinleştirmek için 488 nm'lik bir lazer ve HRP görüntüleme izini etkinleştirmek için 543 nm'lik bir lazer seçin. Parametreleri 800 piksel x 800 piksel çerçeve boyutuna, 2,0 dijital yakınlaştırmaya ve NMJ'lerde 0,8 μm görüntüleme aralığına ayarlayın (Şekil 2).
- Kastaki mikrotübülleri tanımlamak için, daha az trakeal dala sahip olduğu için A3-A5 segmentindeki ( Şekil 1G'deki konumda gösterildiği gibi) kas 2'nin görüntülerini yakalayın. α-tubulini etkinleştirmek için 488 nm lazer ve T3605 görüntüleme izini etkinleştirmek için 635 nm lazer seçin. Parametreleri 1024 piksel x 1024 piksel çerçeve boyutuna, 3,0 dijital yakınlaştırmaya ve kas hücrelerinde 0,4 μm görüntüleme aralığına ayarlayın (Şekil 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hem nöromüsküler kavşaklarda (NMJ'ler) hem de kas hücrelerinde mikrotübül ağını görselleştirmek için adım adım bir prosedür gösterdik. Şematik diyagrama (Şekil 1A-E) göre diseksiyonu takiben, immün boyama yapılır ve görüntüler daha sonra bir lazer konfokal mikroskop veya stereoskopik floresan mikroskobu altında izlenir ve toplanır (Şekil 1F,G).
NMJ'nin hem sinaptik öncesi hem de sonrası mikrotübül organizasyonu, anti-α-tübülin ile etiketlenebilir ve lazer taramalı konfokal mikroskobun katman kalınlığı seçilerek, farklı dilimlerin mikrotübül morfolojisi görüntülenecektir (Şekil 2A-C). Futsch, nöronların aksonlarındaki mikrotübül organizasyonunu ortaya çıkararak nöral izleme için de kullanılmıştır. Anti-HRP, nöronal membranı 10,23,24 etiketlemek için kullanılır. Nöronların aksonlarındaki mikrotübül durumunu tespit etmek için anti-Futsch ve anti-HRP antikorları ile birlikte boyama yapılır. Futsch boyama, NMJ9'un presinaptik nöronlarındaki stabil mikrotübüllerin bolluğunu yansıtabilir. Tübüline özgü şaperon E (TBCE), MT hücre iskeletinin gelişiminde çok önemli bir rol oynar. TBCE presinaptik nöronlarda yere serildiğinde, anti-Futsch sinyali zayıflar ve incelir ve terminal butonlardaki lekelenme ya belirgin değildir ya da yoktur23. Tau, mikrotübül montajı ve stabilizasyonunda önemli bir role sahip olan mikrotübül ile ilişkili bir proteindir25,26. İnsan vahşi tip ve mutant insan Tau proteininin ektopik ekspresyonu olan Drosophila'da, NMJ terminallerinde Futsch sinyalinin yoğunluğunda bir azalma ortaya çıkar20. Futsch boyama sonuçlarına göre, akson gövdesinin boyama yoğunluğu dallarınkinden daha güçlüydü (Şekil 2D-F). Dalların sonundaki mikrotübüller daha az kararlıdır ve morfolojik değişikliklere daha yatkındır, bu nedenle mikrotübüllerin dinamikleri terminal mikrotübüllerin boyanmasıyla yansıtılabilir.
Mikrotübüllerin morfolojik değişimleri de kolayca görselleştirilebilir22. Mikrotübül halkaları, anti-Futsch ve anti-α-tubulin ile boyanabilir. Ayrıca, tek bir döngünün şekli net bir şekilde görüntülenebilir, bu da nicel analizi kolaylaştırır. Örneğin, Katanin, mikrotübül dinamiklerinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan mikrotübül ayırıcı bir proteindir. Katalitik alt birim Katanin 60'ın mikrotübüllerin22 morfolojisi üzerinde bir etkisi olduğu bildirilmiştir. Mao, P-element aracılı eksizyon ile Katanin 60 mutantını ve 51D'de ikinci kromozoma pUAST-attB-Katanin 60'ı yerleştirerek uas-Katanin 60'ı inşa etti. Katanin 6017A mutasyonlarının neden olduğu mikrotübül döngülerindeki artış açıkça gösterilmiştir (Şekil 2A, B, D, E). Ek olarak, Katanin 60'ın aşırı ekspresyonunda, terminal butonları içinde kısa MT fragmanları da önemli ölçüde gözlenebilir (Şekil 2C).
Mikrotübül ağı, kas hücrelerinde α-tübülin antikorları ile boyanarak gözlemlenebilir. Çekirdeğin etrafında uzanan bir mikrotübül ağı açıkça görülebiliyordu (Şekil 3A). Mikrotübül ayırma proteini Katanin, mikrotübül ağınındağılımını düzenler 22. Katanin 6017A mutantında, kas hücreleri önemli ölçüde artmış perinükleer MT yoğunluğuna sahipti ve vahşi tipe kıyasla daha güçlü demetler sergiledi (Şekil 3B). Katanin 60'ın aşırı ekspresyonunun neden olduğu mikrotübül liflerinin parçalanması temsil edildi (Şekil 3C). Böylece protokol, hem nöronlarda hem de kas hücrelerinde mikrotübül ağının görselleştirilmesini sağlar.
Şekil 1. Drosophila larvasının dorsal diseksiyon prosedürü. (A-E) Larva karkaslarını hazırlama prosedürü (21'den değiştirilmiş). (A) Bir larvanın ağız kancalarına ve kuyruğuna ikişer iğne sokun. (B) Arka uca yakın küçük bir enine kesim yapmak için diseksiyon makasını kullanın. (C) Ventral orta hat boyunca ön uca doğru kesin. (D) Larvaların dört köşesine dört böcek iğnesi yerleştirin. (E) İç organları çıkarmak için forseps kullanın ve larvaları fotoğrafçılık için uygun bir konuma yerleştirmek için pimlerin konumunu yeniden ayarlayın. (F) Phalloidin, kası görselleştirmek için hücre iskeletini etiketlemek için kullanılır ve HRP, nöronların hücre zarını etiketlemek için kullanılır. NMJ'nin gözlenen bölgesi, anti-HRP (yeşil) ve phalloidin (macenta) ile birlikte boyanmış A3 segmentindeki kas 4 ile sınırlıdır. Sağdaki panel, yerel kas yapısının şematik bir temsilini gösterir. 1024 piksel x 1024 piksel çerçeve boyutu, 0,6 dijital yakınlaştırma ve 10x objektif lens (sayısal diyafram açıklığı 0,45) kullanılarak yaklaşık 4 μm görüntüleme aralığı. (G) Kas hücrelerinin gözlenen bölgesi, falloidin (macenta) ile boyanmış A3 ila A5 segmentlerinde kas 2 ile sınırlıdır. Tek kesit stereoskopik floresan mikroskobu ile yakalanır. Ölçek çubuğu: 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. NMJ içindeki mikrotübüllerin anti-α-tubulin veya anti-Futsch ile konfokal görüntüleri. W1118 kontrol (A), Katanin 60 17A mutantının (B) NMJ terminalleri ve Katanin 60'ın (C) nöronal aşırı ekspresyonu, anti-HRP (kırmızı) ve anti-α-tubulin (yeşil) ile birlikte boyanmıştır. Görüntüler, karın segmenti A3'ün tüm kas 4 NMJ'si boyunca tam z-yığınlarından gelen projeksiyonlardır. Ortadaki sütun, mikrotübülleri kastan çıkararak NMJ terminallerindeki mikrotübüllerin daha net bir görüntüsünü gösterir. Sağdaki sütun, analiz yazılımını kullanarak sinaptik boutonlardaki mikrotübüllerin morfolojisini gösterir. Ölçek çubuğu: 1 μm. Anti-HRP (kırmızı) ve anti-Futsch (yeşil) (D-F) ile birlikte boyanmış farklı genotiplere sahip NMJ terminalleri. MT döngüleri oklarla gösterildi. Ölçek çubuğu: 5 μm. Bu rakam22'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Drosophila larva kas hücrelerinde perinükleer mikrotübül ağı boyama. (A-C) Larva kasları, mikrotübül ağını göstermek için anti-α-tubulin (yeşil) ve kas sisteminde (C) w1118 kontrolü (A), Katanin 60 17A mutantı (B) ve Katanin 60 aşırı ekspresyonu için çekirdeği göstermek için T3605 (mavi) ile birlikte boyanır. Görüntüler, mikrotübüllerin görünümünden nükleerin merkezine kadar tam z-yığınlarından projeksiyonlardır. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada Drosophila larva nöromüsküler kavşaklarının ve kas hücrelerinin diseksiyonu ve immün boyanması için bir protokol tanımlanmıştır. Dikkate alınması gereken birkaç önemli nokta vardır. İlk olarak, diseksiyon işlemi sırasında gözlemlenen kasların yaralanmasını önlemek çok önemlidir. Forseps ve kaslar arasında doğrudan teması önlemek için iç organları çıkarmadan önce filetoyu sabitlemeye değer olabilir. Kas hasarını veya larva epidermisinden ayrılmayı önlemek için, yıkama ve inkübasyon sırasında çalkalayıcının hızının 15 rpm'yi geçmemesini sağlamak önemlidir. Ek olarak, NMJ morfolojisinin net ve eksiksiz fotoğrafını çekmek için cilt uzantısı üzerinde hassas kontrol gereklidir. Antikor konsantrasyonunu, fiksasyonunu, blokajını ve inkübasyon sürelerini optimize etmek için ön deneylerin yapılması tavsiye edilir. Sabit süre yaklaşık 40 dakika ile sınırlıdır. Çok kısa veya çok uzun, mikrotübül ağının immün boyalaşmasına elverişli değildir.
Nöronlardaki mikrotübüller yoğun bir şekilde paketlenmiştir ve geleneksel mikroskopi kullanılarak net bir şekilde görselleştirilmesi zordur. Nöronlarla karşılaştırıldığında, Drosophila'nın kas hücreleri, 40 μm x 150 μm'ye kadar olan segment A3'ün 2. kası ile oldukça büyüktür ve bu da onu yüksek çözünürlüklü görüntülemeye uygun hale getirir. Bu nedenle, mikrotübül ağı ile ilişkili proteinlerin düzenlenmesini araştırmak için Drosophila kas hücrelerinin kullanılması, NMJ fenotiplerinin doğrulanmasında önemli değere sahip sezgisel ve berrak bir yaklaşımdır20,22,23. Önceki yöntem27 ile karşılaştırıldığında, tıkanmamış bir nesne elde etmek için diseksiyon yönünü dorsalden karına değiştirdik. % 0.2 PBST ile kasın elüsyon tamponu nispeten yumuşaktır ve kas bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur.
Bu yaklaşımın hala bazı sınırlamaları vardır. Mikrotübül bağlayıcı bir protein olarak, Futsch sadece nöronlarda eksprese edilir ve dolaylı olarak polimerize mikrotübülleri temsil edebilir. Bununla birlikte, etkileşim taraması sırasında mikrotübül ağını görselleştirmek için yalnızca Futsch kullanılırsa, bazı aday proteinler gözden kaçabilir. α-tübülin veya β-tübülin doğrudan mikrotübül ağını temsil edebilir, ancak bu iki protein hem sinaptik hem de postsinaptik sunar ve bazen ayırt edilmesi zordur. Ayrıca, sitoplazmada çok sayıda α/β-tübülin heterodimeri dağılmıştır, bu da hem polimerize hem de polimerize olmayan tübülin aynı anda gözlemlenebildiğinden, α-tübülin veya β-tübülin etiketlemenin canlı görüntüleme için uygun olmayabileceği anlamına gelir.
Motor nöronlardan kas hücrelerine kadar mikrotübülleri gözlemlemek, nöral devreler perspektifinden hareket mekanizmalarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlayabilir, nörogelişimsel süreçlerin ve nörolojik hastalıkların patogenezinin incelenmesini kolaylaştırabilir. Mikrotübül ağını farklı model sistemlerde görselleştirmek, bu protokolü kullanarak gen fonksiyonunu birden fazla perspektiften doğrulamak için faydalıdır. Bu yöntem aynı zamanda sinapslar ve sinaptik plastisite arasındaki iletişimin incelenmesi için faydalı olan NMJ'nin postsinaptik reseptörlerini gözlemlemek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Dr. Ying Xiong'a el yazması hakkındaki tartışmalar ve yorumlar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSFC) C. M.'ye (31500839) verilen bir hibe ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
References
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J.
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R.
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
