Summary
在这里，我们提出了一个详细的方案来可视化神经肌肉接头和肌肉细胞中的微管网络。结合 黑腹果蝇强大的遗传工具，该方案极大地促进了微管网络调节蛋白在神经系统中的作用的遗传筛选和微管动力学分析。
Abstract
微管网络是神经系统的重要组成部分。许多微管调节蛋白的突变与神经发育障碍和神经系统疾病有关，如微管相关蛋白Tau对神经退行性疾病，微管切断蛋白Spastin和Katanin 60分别引起遗传性痉挛性截瘫和神经发育异常。检测神经元中的微管网络有利于阐明神经系统疾病的发病机制。然而，神经元的小尺寸和轴突微管束的密集排列使得微管网络的可视化具有挑战性。在这项研究中，我们描述了一种解剖幼虫神经肌肉接头和肌肉细胞的方法，以及α-微管蛋白和微管相关蛋白Futsch的免疫染色，以可视化果蝇中的微管网络。神经肌肉接头使我们能够观察突触前和突触后的微管，果蝇幼虫中大尺寸的肌肉细胞可以清晰地观察微管网络。在这里，通过在黑腹果蝇中突变和过表达Katanin 60，然后检查神经肌肉接头和肌肉细胞中的微管网络，我们准确地揭示了Katanin 60在神经发育中的调节作用。因此，结合果蝇黑腹果蝇强大的遗传工具，该方案极大地促进了微管网络调节蛋白在神经系统中的作用的遗传筛选和微管动力学分析。
Introduction
微管（MTs）作为细胞骨架的结构成分之一，在细胞分裂、细胞生长和运动、细胞内运输和维持细胞形状等多种生物过程中发挥着重要作用。微管动力学和功能通过与其他蛋白质的相互作用进行调节，例如 MAP1、MAP2、Tau、Katanin 和驱动蛋白 1,2,3,4,5。
在神经元中，微管对于轴突和树突的发育和维持至关重要。微管异常会导致功能障碍，甚至导致神经元死亡。例如，在阿尔茨海默氏症患者的大脑中，Tau 蛋白过度磷酸化会降低微管网络的稳定性，导致神经系统异常6。因此，检查微管网络将有助于理解神经发育和神经系统疾病的发病机制。
神经肌肉接头（NMJ）是在运动神经元轴突末梢和肌纤维之间形成的外周突触，是研究突触结构和功能的优秀而强大的模型系统7。Futsch 是果蝇中的一种蛋白质，与哺乳动物中发现的微管结合蛋白 MAP1B 同源8。它仅在神经元中表达，并在 NMJ 突触按钮的发育中发挥作用 8,9。在野生型中，通过用抗Futsch进行免疫染色来观察沿NMJ过程中心运行的丝状束。当到达 NMJ 的末端时，该束能够形成由微管组成的环或失去其丝状结构，从而导致弥漫性和点状外观10。微管环与暂停的生长锥有关，这表明微管阵列是稳定的11。因此，我们可以通过 Futsch 染色间接确定 NMJ 中微管的稳定发育。果蝇幼虫中大尺寸的肌肉细胞可以清晰地观察微管网络。通过分析微管的密度和形状，可以发现影响微管网络稳定性的因素。同时，可以将肌肉细胞的微管网络状态与NMJ的结果进行交叉验证，以获得更全面的结论。
许多协议已被用于研究微管的网络和动力学。然而，这些研究通常集中在体外研究12,13,14,15,16。或者，一些体内实验已经使用电子显微镜来检测细胞骨架17。根据荧光标记的抗体或化学染料与蛋白质或DNA的特异性结合，这里介绍的方法允许在体内单个神经元水平上检测NMJ中的微管网络，结果通过肌肉细胞的观察得到证实。当与果蝇黑腹果蝇中可用的强大遗传工具结合使用时，该方案是简单、稳定和可重复的，能够对体内神经系统中微管网络调节蛋白的作用进行各种表型检查和遗传筛选。
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Protocol
1.幼虫解剖
注意：解剖溶液血淋巴样盐水 （HL3.1）18 和固定溶液 4% 多聚甲醛 （PFA）19,20 在室温下使用，因为当温度过低时微管会解聚。
- 用长钝镊子挑选一只流浪的 3龄 幼虫。用HL3.1洗涤，并将其放在立体显微镜下的解剖皿上。
注：徘徊的3龄 幼虫由分枝的前螺旋体识别，并在约96小时（25°C）21时在管周围爬行。 - 将幼虫的背侧或腹侧朝上放置。通过两个长气管识别背侧，通过腹部齿带识别腹侧。
- 根据要观察的组织，选择背侧或腹侧解剖。这将允许更精确、更详细地了解感兴趣的特定区域。对于NMJ和肌肉细胞观察，分别切开幼虫背侧和腹侧区域。
- 别住嘴钩和尾巴。调整销钉以保持幼虫处于伸展状态。在幼虫中加入一滴HL3.1，以防止其干燥。
注意：不含 Ca2+ 的 HL 3.1 可用于最大限度地减少解剖过程中肌肉的收缩。 - 用解剖剪刀在靠近后端的地方做一个小的横向切口，但不要剪掉后端。然后沿腹侧中线向前端切开。
- 在幼虫的四个角上插入四个昆虫针。重新调整昆虫针，使幼虫在各个方向上最大限度地伸展。
- 使用镊子切除内脏，同时不损伤肌肉。
2. 固定
- 加入 100 μL PFA （4%） 将胴体浸泡 40 分钟，同时胴体仍固定在解剖皿上。
注意： 采取有效的保护措施以避免直接接触皮肤或吸入，因为 PFA 是一种危险。 - 卸下针脚并将样品转移到 2 mL 微量离心管中。用含有0.2%Triton X-100（0.2%PBST）的1x磷酸盐缓冲盐水冲洗PFA，以15rpm在脱色振荡器上填充2mL微量离心管10分钟。重复洗涤过程 5 次。
3. 免疫细胞化学
- 将胴体浸入封闭剂（5%山羊血清在0.2%PBST中）中，并在室温下封闭40分钟。
- 除去封闭剂，并用200μL的一抗（例如，抗α-微管蛋白，1：1000;抗Futsch，1：50）在4°C下用0.2%PBST稀释过夜。通过用单克隆抗α-微管蛋白免疫染色来观察肌肉微管。Anti-Futsch可以间接反映NMJ中的微管形态。
- 一抗孵育后，用0.2%PBST洗涤幼虫10分钟，重复5次。
- 将幼虫与200μL二抗（例如，山羊抗Mouse-488,1：1000）在室温下用0.2%PBST稀释在黑暗中孵育1.5小时。
- 接下来，在黑暗20,22中对微管进行染色时，将浓度为1：1000的核染料如TO-PRO（R）3碘化物（T3605）加入孵育管中30分钟。
- 用 0.2% PBST 冲洗掉二抗和核染料 10 分钟。在黑暗中重复 5 次。
4. 安装
- 将幼虫胴体置于载玻片上的0.2%PBST中，并在立体显微镜下进行调整。确保幼虫胴体的内表面朝上，并且所有幼虫胴体都按所需排列。
- 用擦拭物吸收多余的PBST溶液，然后轻轻加入一滴抗淬灭封固剂。
- 在载玻片上放置盖玻片，缓慢而轻柔地覆盖解剖的幼虫，以避免气泡。
- 在盖玻片周围涂抹指甲油。将载玻片放在黑暗空间中以减少荧光衰减。
5. 图像采集
- 要获取图像，请使用激光扫描共聚焦显微镜，选择60倍油浸物镜（数值孔径1.42）或类似物镜，并根据实验调整激光功率和波长。
- 要识别 NMJ，请在 A3 段的肌肉 4 中捕获图像（如图 1F 中的位置所示）。选择 488 nm 激光以激活 α-微管蛋白或 Futsch，选择 543 nm 以激活 HRP 成像轨迹。将参数调整为 800 像素 x 800 像素的帧大小、2.0 的数码变焦和 0.8 μm 的成像间隔（图 2）。
- 为了识别肌肉中的微管，捕获A3-A5段中肌肉2的图像（ 如图1G中的位置所示），因为它具有较少的气管分支。选择 488 nm 激光器激活 α-微管蛋白，选择 635 nm 激光器激活 T3605 成像轨道。将参数调整为1024像素x 1024像素的帧大小，3.0的数码变焦和肌肉细胞中0.4μm的成像间隔（图3）。
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Representative Results
我们演示了可视化神经肌肉接头 （NMJ） 和肌肉细胞中微管网络的分步程序。根据示意图（图1A-E）解剖后，进行免疫染色，随后在激光共聚焦显微镜或立体荧光显微镜下观察和收集图像（图1F，G）。
NMJ的突触前后微管组织都可以用抗α微管蛋白标记，通过选择激光扫描共聚焦显微镜的层厚，可以显示不同切片的微管形态（图2A-C）。Futsch 还通过揭示神经元轴突中的微管组织来用于神经追踪。抗 HRP 用于标记神经元膜 10,23,24。用抗Futsch和抗HRP抗体进行共染色，以检测神经元轴突中的微管状态。Futsch 染色可以反映 NMJ9 突触前神经元中稳定微管的丰度。微管蛋白特异性伴侣 E （TBCE） 在 MT 细胞骨架的发育中起着至关重要的作用。当TBCE在突触前神经元中被敲除时，抗Futsch的信号变得更弱和更薄，并且末端布顿中的染色不明显或不存在23。Tau 是一种微管相关蛋白，在微管组装和稳定中起重要作用25,26。在具有异位表达人野生型和突变人 Tau 蛋白的果蝇中，揭示了 NMJ 末端 Futsch 信号强度的降低20。根据Futsch染色结果，轴突干的染色强度强于分支（图2D-F）。分支末端的微管稳定性较差，更容易发生形态变化，因此可以通过对末端微管进行染色来反映微管的动力学。
微管的形态变化也可以很容易地可视化22。微管袢可以用抗Futsch和抗α-微管蛋白染色。此外，可以清楚地显示单个环的形状，便于定量分析。例如，Katanin 是一种微管切断蛋白，在微管动力学的调节中起着重要作用。据报道，催化亚基 Katanin 60 对微管的形态有影响22。Mao 通过 P 元素介导的切除构建了 Katanin 60 突变体，并通过在 51D 处的第二条染色体中插入 pUAST-attB-Katanin 60 构建了 uas-Katanin 60。Katanin 6017A突变引起的微管环增加被清楚地证明（图2A，B，D，E）。此外，在Katanin 60的过表达中，在末端布顿中也可以显着观察到短MT片段（图2C）。
可以通过在肌肉细胞中用α-微管蛋白抗体染色来观察微管网络。在细胞核周围延伸的微管网络清晰可见（图3A）。微管切断蛋白Katanin调节微管网络的分布22。在 Katanin 6017A 突变体中，与野生型相比，肌肉细胞的核周MT强度显着增加，并表现出更强的束（图3B）。表示 由Katanin 60 的过表达引起的微管纤维断裂（图3C）。因此，该协议使神经元和肌肉细胞中的微管网络可视化成为可能。
图 1. 果蝇 幼虫的背部解剖程序。 （A-E）制备幼虫尸体的程序（修改自21）。（A） 将两根针分别插入幼虫的嘴钩和尾巴。（B） 用解剖剪刀在靠近后端的地方做一个小的横向切口。（C） 沿腹侧中线向前端切开。（D） 在幼虫的四个角上插入四个昆虫针。（五）用镊子取出内脏，重新调整针的位置，将幼虫放在合适的位置进行拍照。（F）鬼笔环肽用于标记细胞骨架以可视化肌肉，HRP用于标记神经元的细胞膜。NMJ 的观察区域仅限于 A3 段的肌肉 4，与抗 HRP（绿色）和鬼笔环肽（品红色）共染色。右图显示了局部肌肉结构的示意图。使用10倍物镜（数值孔径0.45）的画面尺寸为1024像素×1024像素，数码变焦为0.6，成像间隔约为4μm。（G） 观察到的肌肉细胞区域仅限于 A3 至 A5 段的肌肉 2，用鬼笔环肽（品红色）染色。单个切片由立体荧光显微镜捕获。比例尺：500μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2.通过抗α-微管蛋白或抗Futsch对NMJ内的微管进行共聚焦图像。w1118对照（A），Katanin 60 17A突变体（B）的NMJ末端和Katanin 60（C）的神经元过表达，与抗HRP（红色）和抗α-微管蛋白（绿色）共染色，如左列所示。这些图像是从完整的 z 堆栈到腹段 A3 的整个肌肉 4 NMJ 的投影。中间一列通过从肌肉中取出微管，显示了 NMJ 末端微管的更清晰图像。右列使用分析软件描绘了突触胸膜中微管的形态。比例尺：1μm。 不同基因型的NMJ末端用抗HRP（红色）和抗Futsch（绿色）（D-F）共染色。MT 循环用箭头表示。比例尺：5μm。这个数字改编自22。请点击这里查看此图的较大版本.
图3. 果蝇 幼虫肌肉细胞中的核周微管网络染色。 （空调）用抗α-微管蛋白（绿色）共染色幼虫肌肉以显示微管网络，T3605（蓝色）显示 w1118 对照（A），Katanin 60 17A 突变体（B）和 Katanin 60 在肌肉系统中过表达的细胞核（C）。这些图像是从完整的z-stacks投影，从微管的外观到核的中心。比例尺：10μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
这里描述了用于 果蝇 幼虫神经肌肉接头和肌肉细胞的解剖和免疫染色的方案。有几个要点需要考虑。首先，在解剖过程中，避免观察到的肌肉受伤至关重要。在切除内脏之前，可能值得固定鱼角，以防止镊子和肌肉直接接触。为避免肌肉损伤或与幼虫表皮分离，重要的是要确保在洗涤和孵育过程中振荡器的速度不超过 15 rpm。此外，必须精确控制皮肤延伸，以确保清晰、完整地拍摄 NMJ 形态。建议进行初步实验，以优化抗体浓度、固定、封闭和孵育时间。固定持续时间限制在约 40 分钟。过短或过长都不利于微管网络的免疫染色。
神经元中的微管密集堆积，使用传统显微镜很难清晰地观察。与神经元相比，果蝇的肌肉细胞非常大，A3段的肌肉2的尺寸高达40μm x 150μm，使其适合高分辨率成像。因此，利用果蝇肌肉细胞研究微管网络相关蛋白的调节是一种直观而清晰的方法，在验证 NMJ 表型20、22、23 方面具有重要价值。与之前的方法27相比，我们将解剖方向从背部改为腹部，以获得畅通无阻的物体。用0.2%PBST洗脱肌肉缓冲液相对温和，有助于保持肌肉完整性。
这种方法仍然存在一些局限性。作为一种微管结合蛋白，Futsch仅在神经元中表达，可以间接代表聚合的微管。然而，如果在相互作用筛选过程中仅使用 Futsch 来可视化微管网络，则可能会遗漏一些候选蛋白。α-微管蛋白或β-微管蛋白可以直接代表微管网络，然而，这两种蛋白质同时存在于突触前和突触后，有时很难区分。此外，大量的α/β-微管蛋白异二聚体分布在细胞质中，这意味着标记α-微管蛋白或β-微管蛋白可能不适合实时成像，因为可以同时观察到聚合和非聚合微管蛋白。
观察从运动神经元到肌肉细胞的微管，可以从神经回路的角度全面了解运动机制，有利于神经发育过程和神经系统疾病发病机制的研究。在不同的模型系统中可视化微管网络有利于使用该协议从多个角度验证基因功能。该方法还可用于观察NMJ的突触后受体，有利于研究突触之间的通讯和突触可塑性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢熊莹博士对手稿的讨论和评论。这项工作得到了中国国家科学基金委员会（NSFC）对C.M.（31500839）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
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