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Neuroscience

Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65774
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1National & Local Joint Engineering Research Center of High-throughput Drug Screening Technology, School of life science, Hubei University

Summary

Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Abstract

La red de microtúbulos es un componente esencial del sistema nervioso. Las mutaciones en muchas proteínas reguladoras de los microtúbulos se asocian con trastornos del neurodesarrollo y enfermedades neurológicas, como la proteína Tau asociada a microtúbulos a enfermedades neurodegenerativas, la proteína cortante de microtúbulos Spastin y Katanin 60 causan paraplejia espástica hereditaria y anomalías del neurodesarrollo, respectivamente. La detección de redes de microtúbulos en las neuronas es ventajosa para dilucidar la patogénesis de los trastornos neurológicos. Sin embargo, el pequeño tamaño de las neuronas y la densa disposición de los haces de microtúbulos axonales dificultan la visualización de las redes de microtúbulos. En este estudio, describimos un método para la disección de la unión neuromuscular larvaria y las células musculares, así como la inmunotinción de α-tubulina y la proteína Futsch asociada a microtúbulos para visualizar redes de microtúbulos en Drosophila melanogaster. La unión neuromuscular nos permite observar los microtúbulos pre y postsinápticos, y el gran tamaño de las células musculares en la larva de Drosophila permite una visualización clara de la red de microtúbulos. Aquí, mutando y sobreexpresando Katanin 60 en Drosophila melanogaster, y luego examinando las redes de microtúbulos en la unión neuromuscular y las células musculares, revelamos con precisión el papel regulador de Katanin 60 en el neurodesarrollo. Por lo tanto, combinado con las poderosas herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Introduction

Los microtúbulos (MT), como uno de los componentes estructurales del citoesqueleto, desempeñan un papel importante en diversos procesos biológicos, incluida la división celular, el crecimiento y la motilidad celular, el transporte intracelular y el mantenimiento de la forma celular. La dinámica y la función de los microtúbulos están moduladas por interacciones con otras proteínas, como MAP1, MAP2, Tau, Katanin y Kinesin 1,2,3,4,5.

En las neuronas, los microtúbulos son esenciales para el desarrollo y mantenimiento de axones y dendritas. Las anomalías en los microtúbulos conducen a la disfunción e incluso a la muerte de las neuronas. Por ejemplo, en el cerebro de los pacientes con Alzheimer, la hiperfosforilación de la proteína Tau reduce la estabilidad de la red de microtúbulos, causando irregularidades neurológicas6. Por lo tanto, el examen de las redes de microtúbulos contribuirá a la comprensión del neurodesarrollo y la patogénesis de las enfermedades neurológicas.

La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis periférica formada entre el terminal axonal de una neurona motora y una fibra muscular, que es un excelente y potente sistema modelo para estudiar la estructura y las funciones sinápticas7. Futsch es una proteína de Drosophila que es homóloga a la proteína de unión a microtúbulos MAP1B que se encuentra en los mamíferos8. Se expresa solamente en las neuronas y desempeña un papel en el desarrollo de los botones sinápticos de la NMJ 8,9. En el tipo salvaje, los haces filamentosos que corren a lo largo del centro de los procesos NMJ se visualizan mediante inmunotinción con anti-Futsch. Al llegar al final de NMJ, este haz tiene la capacidad de formar un bucle formado por microtúbulos o de perder su estructura filamentosa, lo que da lugar a un aspecto difuso y punteado10. Los bucles de microtúbulos se asocian con conos de crecimiento en pausa, lo que sugiere que la matriz de microtúbulos es estable11. Por lo tanto, podemos determinar indirectamente el desarrollo estable de microtúbulos en NMJ mediante tinción de Futsch. El gran tamaño de las células musculares de la larva de Drosophila permite una visualización clara de la red de microtúbulos. Los factores que afectan la estabilidad de la red de microtúbulos se pueden encontrar analizando la densidad y la forma de los microtúbulos. Al mismo tiempo, el estado de la red de microtúbulos de las células musculares se puede verificar de forma cruzada con el resultado de la NMJ para obtener conclusiones más completas.

Se han empleado muchos protocolos para investigar la red y la dinámica de los microtúbulos. Sin embargo, estas investigaciones muchas veces se han centrado en estudios in vitro 12,13,14,15,16. Alternativamente, algunos experimentos in vivo han empleado microscopía electrónica para detectar el citoesqueleto17. De acuerdo con la unión específica de anticuerpos marcados con fluorescencia o colorantes químicos a proteínas o ADN, los métodos aquí presentados permiten la detección de redes de microtúbulos en NMJ a nivel de neuronas individuales in vivo, con resultados corroborados por observaciones en células musculares. Este protocolo es simple, estable y repetible cuando se combina con las poderosas herramientas genéticas disponibles en Drosophila melanogaster, lo que permite una amplia gama de exámenes fenotípicos y exámenes genéticos para el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso in vivo.

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Protocol

1. Disección de larvas

NOTA: La solución diseccionadora de solución salina similar a la hemolinfa (HL3.1)18 y la solución de fijación al 4% de paraformaldehído (PFA)19,20 se utilizan a temperatura ambiente porque los microtúbulos se despolimerizan cuando la temperatura es demasiado baja.

  1. Escoge una larva errante de3er estadio con pinzas largas y romas. Lávelo con HL3.1 y colóquelo en la placa de disección bajo el microscopio estereoscópico.
    NOTA: La larva errante del3er estadio se identifica por el espiráculo anterior ramificado y se arrastra alrededor del tubo aproximadamente a 96 h (25 °C)21.
  2. Coloque la larva con el lado dorsal o ventral hacia arriba. Identifique el lado dorsal por las dos tráqueas largas y el ventral por los cinturones dentículos abdominales.
    1. Dependiendo del tejido a observar, opta por la disección dorsal o ventral. Esto permitirá una visión más precisa y detallada del área específica de interés. Para la observación de la NMJ y de las células musculares, abra las regiones dorsal y ventral de las larvas, respectivamente.
  3. Sujeta con alfileres los ganchos de la boca y la cola. Ajuste los alfileres para mantener la larva en un estado prolongado. Añade una gota de HL3.1 a la larva para evitar que se seque.
    NOTA: Se puede utilizar HL 3.1 libre de Ca2+ para minimizar la contracción de los músculos durante la disección.
  4. Use las tijeras de disección para hacer un pequeño corte transversal cerca del extremo posterior, pero no corte el extremo posterior. Luego corte a lo largo de la línea media ventral hacia el extremo anterior.
  5. Inserte cuatro alfileres de insectos en las cuatro esquinas de la larva. Reajuste los alfileres de insectos de modo que la larva se estire al máximo en todas las direcciones.
  6. Use las pinzas para extirpar los órganos internos sin dañar los músculos.

2. Fijación

  1. Añadir 100 μL de PFA (4%) para sumergir las canales durante 40 minutos mientras las canales aún están fijadas en la placa de disección.
    PRECAUCIÓN: Se toman medidas de protección efectivas para evitar el contacto directo con la piel o la inhalación, ya que el PFA es un peligro.
  2. Desmonte los pasadores y transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Enjuague el PFA con 1 solución salina tamponada con fosfato que contenga 0,2 % de Triton X-100 (0,2 % PBST) para llenar el tubo de microcentrífuga de 2 ml durante 10 min en el agitador decolorante a 15 rpm. Repita el proceso de lavado 5 veces.

3. Inmunocitoquímica

  1. Sumergir las canales en agente bloqueante (suero de cabra al 5% en PBST al 0,2%) y bloquear durante 40 min a temperatura ambiente.
  2. Retirar el agente bloqueante y sustituirlo por 200 μL del anticuerpo primario (p. ej., anti-α-tubulina, 1:1000; anti-Futsch, 1:50) diluido con PBST al 0,2% a 4 °C durante la noche. Visualizar los microtúbulos musculares mediante inmunotinción con anti-α-tubulina monoclonal. El anti-Futsch puede reflejar indirectamente la morfología de los microtúbulos en la NMJ.
  3. Después de la incubación del anticuerpo primario, lavar las larvas con PBST al 0,2% durante 10 min. Repetir 5 veces.
  4. Incubar las larvas con 200 μL de anticuerpo secundario (p. ej., anti-Mouse-488 de cabra, 1:1000) diluido con PBST al 0,2% a temperatura ambiente durante 1,5 h en la oscuridad.
  5. A continuación, agregue un colorante nuclear como yoduro TO-PRO(R) 3 (T3605) a una concentración de 1:1000 en el tubo de incubación durante 30 min al teñir los microtúbulos en la oscuridad20,22.
  6. Enjuague el anticuerpo secundario y el colorante nuclear con PBST al 0,2% durante 10 min. Repita 5 veces en la oscuridad.

4. Montaje

  1. Coloque el cadáver de la larva en PBST al 0,2% en un portaobjetos de vidrio y ajústelo bajo el microscopio estereoscópico. Asegúrese de que la superficie interna del cadáver de la larva esté hacia arriba y que todos los cadáveres de las larvas estén dispuestos como se desee.
  2. Absorba el exceso de solución PBST con una toallita y agregue suavemente una gota de medio de montaje antidecoloración.
  3. Coloque un cubreobjetos en el portaobjetos para cubrir las larvas disecadas lenta y suavemente para evitar burbujas.
  4. Aplica esmalte de uñas alrededor del cubreobjetos. Coloque el portaobjetos en el espacio oscuro para reducir la atenuación fluorescente.

5. Adquisición de imágenes

  1. Para adquirir las imágenes, utilice un microscopio confocal de barrido láser, seleccione el objetivo de inmersión en aceite de 60x (apertura numérica 1,42) o similar, y ajuste la potencia del láser y la longitud de onda en función del experimento.
  2. Para identificar la NMJ, capture imágenes en el músculo 4 en el segmento A3 (como se muestra en la ubicación de la Figura 1F). Seleccione un láser de 488 nm para activar la α-tubulina o Futsch y 543 nm para activar la pista de imágenes HRP. Ajuste los parámetros a un tamaño de fotograma de 800 píxeles x 800 píxeles, un zoom digital de 2,0 y un intervalo de imagen de 0,8 μm en NMJ (Figura 2).
  3. Para identificar los microtúbulos en el músculo, capture imágenes del músculo 2 en el segmento A3-A5 (como se muestra en la ubicación de la Figura 1G) ya que tiene menos ramas traqueales. Elija un láser de 488 nm para activar la α-tubulina y un láser de 635 nm para activar la pista de imágenes T3605. Ajuste los parámetros a un tamaño de fotograma de 1024 píxeles x 1024 píxeles, un zoom digital de 3,0 y un intervalo de imagen de 0,4 μm en células musculares (Figura 3).

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Representative Results

Demostramos un procedimiento paso a paso para visualizar la red de microtúbulos tanto en las uniones neuromusculares (NMJ) como en las células musculares. Después de la disección de acuerdo con el diagrama esquemático (Figura 1A-E), se realiza la inmunotinción y posteriormente se observan las imágenes y se recogen bajo un microscopio confocal láser o un microscopio de fluorescencia estereoscópica (Figura 1F, G).

Tanto la organización de los microtúbulos pre como postsinápticos de la NMJ podría marcarse con anti-α-tubulina, y al seleccionar el espesor de la capa del microscopio confocal de barrido láser, se mostraría la morfología de los microtúbulos de diferentes cortes (Figura 2A-C). El futsch también se ha utilizado para el rastreo neuronal al revelar la organización de los microtúbulos en los axones de las neuronas. El anti-HRP se utiliza para marcar la membrana neuronal 10,23,24. La tinción conjunta con anticuerpos anti-Futsch y anti-HRP se realiza para detectar el estado de los microtúbulos en los axones de las neuronas. La tinción de Futsch puede reflejar la abundancia de microtúbulos estables en las neuronas presinápticas de NMJ9. La chaperona E específica de la tubulina (TBCE) desempeña un papel crucial en el desarrollo del citoesqueleto MT. Cuando la TBCE es eliminada en las neuronas presinápticas, la señal de anti-Futsch se vuelve más débil y delgada, y la tinción en los botones terminales no es obvia o está ausente23. La tau es una proteína asociada a los microtúbulos que tiene un papel importante en el ensamblaje y estabilización de los microtúbulos25,26. En Drosophila con expresión ectópica de la proteína Tau humana de tipo salvaje y mutante humana, se revela una disminución en la intensidad de la señal de Futsch en los terminales NMJ20. De acuerdo con los resultados de la tinción de Futsch, la intensidad de la tinción del tronco del axón fue más fuerte que la de las ramas (Figura 2D-F). Los microtúbulos al final de las ramas son menos estables y más propensos a cambios morfológicos, por lo que la dinámica de los microtúbulos puede reflejarse tiñendo los microtúbulos terminales.

Los cambios morfológicos de los microtúbulos también pueden visualizarse fácilmente22. Los bucles de microtúbulos se pueden teñir con anti-Futsch y anti-α-tubulina. Además, la forma de un solo bucle se puede mostrar claramente, lo que facilita el análisis cuantitativo. Por ejemplo, la katanina es una proteína que corta los microtúbulos y que desempeña un papel importante en la regulación de la dinámica de los microtúbulos. Se ha informado que la subunidad catalítica Katanin 60 tiene un efecto sobre la morfología de los microtúbulos22. Mao ha construido el mutante Katanin 60 mediante escisión mediada por el elemento P y el UAS-Katanin 60 mediante la inserción de pUAST-attB-Katanin 60 en el segundo cromosoma en 51D. El aumento de los bucles de microtúbulos causado por las mutaciones de Katanin 6017A quedó claramente demostrado (Figura 2A, B, D, E). Además, en la sobreexpresión de Katanin 60, también se pudieron observar significativamente fragmentos cortos de MT dentro de los botones terminales (Figura 2C).

La red de microtúbulos se puede observar mediante tinción con anticuerpos α-tubulina en las células musculares. Una red de microtúbulos que se extendía alrededor del núcleo era claramente visible (Figura 3A). La proteína cortadora de microtúbulos Katanin regula la distribución de la red de microtúbulos22. En el mutante Katanin 6017A , las células musculares tenían una intensidad de MT perinuclear significativamente mayor y exhibían haces más fuertes en comparación con el tipo salvaje (Figura 3B). Se representó la fragmentación de las fibras de los microtúbulos causada por la sobreexpresión de Katanina 60 (Figura 3C). Por lo tanto, el protocolo permite la visualización de la red de microtúbulos tanto en neuronas como en células musculares.

Figure 1
Figura 1. Procedimiento de disección dorsal de larva de Drosophila . (A-E) Procedimiento de preparación de cadáveres de larvas (modificado a partir delpunto 21). (A) Inserte dos alfileres en cada uno de los ganchos de la boca y la cola de una larva. (B) Use las tijeras de disección para hacer un pequeño corte transversal cerca del extremo posterior. (C) Cortar a lo largo de la línea media ventral hacia el extremo anterior. (D) Inserte cuatro alfileres de insectos en las cuatro esquinas de la larva. (E) Use pinzas para extraer los órganos internos y reajuste la posición de los alfileres para colocar la larva en una posición adecuada para la fotografía. (F) La faloidina se usa para etiquetar el citoesqueleto para visualizar el músculo, y la HRP se usa para etiquetar la membrana celular de las neuronas. La región observada de la NMJ está restringida al músculo 4 en el segmento A3, co-teñido con anti-HRP (verde) y faloidina (magenta). El panel de la derecha muestra una representación esquemática de la estructura muscular local. El tamaño del fotograma es de 1024 píxeles x 1024 píxeles, el zoom digital es de 0,6 y un intervalo de imagen de aproximadamente 4 μm con un objetivo de 10x (apertura numérica de 0,45). (G) La región observada de las células musculares está restringida al músculo 2 en los segmentos A3 a A5, teñido con faloidina (magenta). La sección única se captura con un microscopio de fluorescencia estereoscópica. Barra de escala: 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Imágenes confocales de microtúbulos dentro de NMJ por anti-α-tubulina o anti-Futsch. En la columna de la izquierda se muestran los terminales NMJ del control w1118 (A), el mutante Katanin 60 17A (B) y la sobreexpresión neuronal de Katanin 60 (C), co-teñidos con anti-HRP (rojo) y anti-α-tubulina (verde). Las imágenes son proyecciones de pilas z completas a través de todo el músculo 4 NMJ del segmento abdominal A3. La columna central muestra una imagen más clara de los microtúbulos en los terminales de la NMJ mediante la eliminación de los microtúbulos del músculo. La columna de la derecha muestra la morfología de los microtúbulos en los botones sinápticos utilizando el software de análisis. Barra de escala: 1 μm. Terminales NMJ de diferentes genotipos co-teñidos con anti-HRP (rojo) y anti-Futsch (verde) (D-F). Los bucles MT se indicaban con flechas. Barra de escala: 5 μm. Esta cifra ha sido adaptada de22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Tinción de la red de microtúbulos perinucleares en las células musculares de las larvas de Drosophila . (A-C) Los músculos de las larvas se tiñen conjuntamente con anti-α-tubulina (verde) para mostrar la red de microtúbulos y T3605 (azul) para mostrar el núcleo para el control de w1118 (A), el mutante de Katanina 60 17A (B) y la sobreexpresión de Katanina 60 en el sistema muscular (C). Las imágenes son proyecciones de pilas z completas desde la aparición de microtúbulos hasta el centro de la energía nuclear. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí se describe un protocolo para la disección e inmunotinción de las uniones neuromusculares y las células musculares de las larvas de Drosophila . Hay varios puntos esenciales a tener en cuenta. En primer lugar, evitar lesiones en los músculos observados es crucial durante el proceso de disección. Puede valer la pena arreglar el filete antes de extraer los órganos internos para evitar el contacto directo entre las pinzas y los músculos. Para evitar daños musculares o la separación de la epidermis larvaria, es importante asegurarse de que la velocidad del agitador no supere las 15 rpm durante el lavado y la incubación. Además, es necesario un control preciso sobre la extensión de la piel para garantizar una fotografía clara y completa de la morfología de la NMJ. Es recomendable realizar experimentos preliminares para optimizar los tiempos de concentración, fijación, bloqueo e incubación de anticuerpos. La duración fija está limitada a unos 40 minutos. Demasiado corto o demasiado largo no es propicio para la inmunotinción de la red de microtúbulos.

Los microtúbulos de las neuronas están densamente empaquetados y son difíciles de visualizar con claridad mediante microscopía convencional. En comparación con las neuronas, las células musculares de Drosophila son notablemente grandes, con el músculo 2 del segmento A3 midiendo hasta 40 μm x 150 μm, lo que lo hace susceptible de imágenes de alta resolución. Por lo tanto, la utilización de células musculares de Drosophila para investigar la regulación de las proteínas asociadas a la red de microtúbulos es un enfoque intuitivo y lúcido que tiene un valor significativo en la validación de los fenotipos NMJ20,22,23. En comparación con el método anterior27, hemos cambiado la dirección de disección de la dorsal al abdomen para obtener un objeto sin obstrucciones. El tampón de elución del músculo con 0,2% de PBST es relativamente suave y ayuda a preservar la integridad muscular.

Este enfoque sigue teniendo algunas limitaciones. Como proteína de unión a microtúbulos, Futsch se expresa exclusivamente en las neuronas y puede representar indirectamente microtúbulos polimerizados. Sin embargo, si solo se utiliza Futsch para visualizar la red de microtúbulos durante el cribado de la interacción, es posible que se pasen por alto algunas proteínas candidatas. α-tubulina o β-tubulina pueden representar directamente la red de microtúbulos, sin embargo, estas dos proteínas presentan tanto presinápticas como postsinápticas, y a veces es difícil distinguirlas. Además, un gran número de heterodímeros de α/β-tubulina se distribuyen en el citoplasma, lo que significa que el marcaje de α-tubulina o β-tubulina puede no ser adecuado para la obtención de imágenes en vivo, ya que se pueden observar tubulinas polimerizadas y no polimerizadas al mismo tiempo.

La observación de los microtúbulos desde las neuronas motoras hasta las células musculares puede proporcionar una comprensión completa de los mecanismos de movimiento desde la perspectiva de los circuitos neuronales, facilitando el estudio de los procesos del neurodesarrollo y la patogénesis de las enfermedades neurológicas. La visualización de la red de microtúbulos en diferentes sistemas modelo es beneficiosa para verificar la función génica desde múltiples perspectivas utilizando este protocolo. Este método también se puede utilizar para observar los receptores postsinápticos de la NMJ, lo que es beneficioso para el estudio de la comunicación entre las sinapsis y la plasticidad sináptica.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Ying Xiong por las discusiones y comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo cuenta con el apoyo de una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias de China (NSFC) a C. M. (31500839).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin invitrogen A30104 dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium Beyotime P0128M
FV10-ASW confocal microscope Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated Thermo Fisher A-11001 dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710 Zeiss
Micro Scissors 66vision 54138B
Mouse anti-Futsch antibody Developmental Studies Hybridoma Bank   22C10 dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody Sigma T5168 dilute 1:1,000
Paraformaldehyde Wako 168-20955 Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins Entomoravia 0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161 Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41 Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP Jackson ImmunoResearch dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide Invitrogen T3605 dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8 Kylin-Bell lab instruments E0018
TritonX-100 BioFroxx 1139
Tweezers  dumont 500342

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Zhang, S., Wang, X., Liu, Z., Jin, S., Mao, C. X. Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network. J. Vis. Exp. (200), e65774, doi:10.3791/65774 (2023).

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