Paradigma's voor farmacologische karakterisering van C. elegans synaptische transmissie Mutants

Summary

Deze video laat zien hoe twee neurale stimulerende middelen, aldicarb en pentyleentetrazol (PTZ), tewerkstellen in complementaire manieren om de synaptische functie in de nematode C. elegans te bestuderen. Deze complementaire aanpak kan ook gebruikt worden om licht te werpen op evolutionair geconserveerd mechanismen voor het moduleren van neuronale synchroon en heeft gevolgen voor epilepsie en aanvallen.

Abstract

Het aaltje, Caenorhabditis elegans, is uitgegroeid tot een zinvol model voor het bestuderen van neurotransmissie. C. elegans is uniek onder de diermodellen, zoals de anatomie en de connectiviteit van het zenuwstelsel is vastgesteld op basis van electronenmicroscoop en verfijnd door de farmacologische assays. In deze video, beschrijven we hoe twee complementaire neurale stimulerende middelen, een acetylcholinesterase-remmer, genaamd aldicarb, en een gamma-aminoboterzuur (GABA)-receptor antagonist, genaamd pentyleentetrazol (PTZ), kunnen worden gebruikt om van een specifiek signalering bij C. elegans neuromusculaire verbindingen (NMJs) en vergemakkelijkt ons begrip van antagonistische neurale circuits.

Van 302 C. elegans neuronen, negentien GABAergische D-type motor neuronen innerveren lichaamswand spieren (BWMs), terwijl vier GABAergische neuronen, genaamd RME's, innerveren hoofd spieren. Omgekeerd, negenendertig motorische neuronen geven de excitatoire neurotransmitter, acetylcholine (ACh), en antagoneren GABA transmissie bij BWMs te voortbeweging te coördineren. De antagonistische karakter van de GABA-erge en cholinerge motorische neuronen in het lichaam muur NMJs werd in eerste instantie bepaald door de laser ablatie en later gesteund door aldicarb blootstelling. Acute blootstelling aan aldicarb resulteert in een time-cursus of de dosis-responsieve verlamming in wild-type wormen. Toch is het verlies van excitatoire transmissie ACh resistentie tegen aldicarb, als minder ACh hoopt zich op worm NMJs, wat leidt tot minder stimulatie van BWMs. Weerstand tegen aldicarb kan worden waargenomen met ACh-specifieke of algemene synaptische functie mutanten. In overeenstemming met antagonistische GABA en ACh overdracht, verlies van GABA transmissie, of een niet negatief te reguleren ACh release, verleent overgevoeligheid voor aldicarb. Hoewel aldicarb blootstelling heeft geleid tot de isolatie van een groot aantal worm homologen van neurotransmissie genen, aldicarb blootstelling alleen kan niet efficiënt bepalen heersende rol voor genen en routes in specifieke C. elegans motorische neuronen. Voor dit doel hebben we een complementaire experimentele benadering, die gebruik maakt van PTZ.

Neurotransmissie mutanten scherm leeg fenotypes, onderscheiden van aldicarb-geïnduceerde verlammingen, in antwoord op PTZ. Wild-type wormen, evenals mutanten met specifieke onvermogen vrij te geven of te ontvangen ACh, blijkt niet duidelijk gevoeligheid voor PTZ. Echter, GABA mutanten, alsook van de algemene synaptische functie mutanten, weer te geven anterior convulsies bij een time-cursus of de dosis-responsieve manier. Mutanten die niet negatief kan reguleren algemene neurotransmitters, en dus scheiden grote hoeveelheden van ACh op BWMs, raken verlamd op PTZ. De PTZ-geïnduceerde fenotypen van discrete mutant klassen aan te geven dat een complementaire aanpak met aldicarb en PTZ blootstelling paradigma's in C. elegans kunnen ons begrip van neurotransmissie te versnellen. Bovendien moet video's te laten zien hoe we farmacologische testen uit te voeren vast te stellen consistente methoden voor het C. elegans onderzoek.

Protocol

Aldicarb Exposure Paradigm

1. Op de eerste dag, ervoor zorgen dat ten minste dertig jonge volwassen stadium wormen van elk genotype en van elke repliceren zullen beschikbaar zijn voor aldicarb assays op de tweede dag. Het is het beste als een experimentator selecteert vijftig of meer L4 stadium wormen op verse NGM platen (best zonder nystatine), die E. bevatten coli (bij voorkeur OP50) als een bron van voedsel, en groeien ze voor 12-24 uur in een consistent en permissieve temperatuur (20 ° C tot 22 ° C is het beste, alhoewel 25 ° C is oke).
   
   
2. Op de tweede dag, maak een 100 mM voorraad oplossing van aldicarb met 70% ethanol (EtOH) en 30% DDH ₂ O. Verdeel de juiste hoeveelheid van aldicarb op NGM minus nystatine platen met gedefinieerde volumes om de gewenste aldicarb-concentraties te bereiken. Wij consequent gebruiken 0,5 mM aldicarb door uitplating 37,5 pi van 100 mM aldicarb op 7,5 mL NGM platen. Laat de aldicarb platen te drogen voor ongeveer 30-60 minuten bij kamertemperatuur. Het is niet nodig om de deksels te kraken. Als alternatief kan aldicarb worden toegevoegd aan NGM en opgeslagen bij 4 ° C gedurende een week.
    
3. Na het drogen, plaat consistente volumes van E. coli (bij voorkeur OP50) op het midden van elk bord en aldicarb drogen voor een 30-60 minuten bij kamertemperatuur. Wij consequent plaat 25 uL van OP50, die een groot genoeg voedsel gazon aan de wormen geconcentreerd in een klein plekje te houden, zonder overbevolking creëert.
    
4. Wanneer het voedsel gazon droog is, kan men verder met aldicarb assays. Vanwege het subjectieve karakter van aldicarb testen, is het ten zeerste aanbevolen dat de experimenten worden uitgevoerd "blindelings". Een collega van de primaire onderzoeker kan re-label van de originele platen met wormen te worden getest. Ook zou de collega wormen onmiddellijk overdracht van de originele platen versleuteld aldicarb platen vóór het begin van een timer. Als de onderzoeker voorziet het testen van een bepaalde stam van wormen met een karakteristiek fenotype, zoals uncoordination, dan moet er ook een controle met een vergelijkbaar fenotype om vertekening te beperken. Bovendien is het het beste als de experimentator assays een wild-type stam, evenals een resistente stam en een overgevoelige stam, in parallel te helpen standaardiseren experimenten. De experimentator moet streven naar een consistent aantal wormen te analyseren voor elke repliceren. Wij consequent analyseren dertig wormen van een enkel genotype voor iedere repliceren. We voeren ook ten minste drie replica voor elk experiment. Een ervaren onderzoeker moet in staat zijn om ten minste zes stammen te analyseren op een moment.
    
5. Tel het aantal wormen verlamd door porren op een consistente wijze kan elke worm met een platina draad. We consequent prod onze wormen twee keer op het hoofd en twee keer op de staart elke 30 minuten voor een totaal van drie uur. Stopzetting van de keelholte pompen kunnen ook worden gebruikt om verlamming te definiëren, maar alleen als de experimentator een uniforme definitie van verlamming over alle assays in dienst heeft. Ook is het opvallend dat enkele wormen, vooral die die resistent zijn tegen aldicarb, kan proberen te kruipen uit de plaat. In dat geval kan de onderzoeker zich een consistente hoeveelheid palmitinezuur, een fysieke barrière voor worm motoriek, rond de aldicarb platen. We verspreiden 25 il van 10 mg palmitinezuur / ml EtOH.

PTZ Exposure Paradigm

1. Op de eerste dag, ervoor zorgen dat ten minste dertig jonge volwassen stadium wormen van elk genotype en van elke repliceren zullen beschikbaar zijn voor PTZ assays op de tweede dag. Het is het beste als een experimentator selecteert vijftig of meer L4 stadium wormen op verse NGM platen (best zonder nystatine), die E. bevatten coli (bij voorkeur OP50) als een bron van voedsel, en groeien ze voor 12-24 uur in een consistent en permissieve temperatuur (20 ° C tot 22 ° C is het beste, alhoewel 25 ° C is oke).
   
   
2. Op de tweede dag, maak een 0,5 g PTZ / mL DDH ₂ O stockoplossing van PTZ. Verdeel de juiste hoeveelheid van de PTZ op NGM minus nystatine platen met gedefinieerde volumes om de gewenste PTZ-concentraties te bereiken. Omdat we de dosis-respons assays voorkeur voor PTZ, we plaat variërende hoeveelheden van PTZ op 7,5 mL NGM platen. Bijvoorbeeld, kan men plaat 37,5 pi van de PTZ-aandelen oplossing op een 7,5 mL NGM plaat aan een 5 mg PTZ / ml oplossing te maken. Laat de PTZ-platen te drogen voor ongeveer 60-120 minuten bij kamertemperatuur. Het is niet nodig om de deksels te kraken. Als alternatief kan PTZ direct worden toegevoegd aan NGM, maar het moet onmiddellijk worden gebruikt voor het testen na het stollen. De stabiliteit van PTZ is aanzienlijk minder dan die van aldicarb. Daarom testen met oudere PTZ-platen zijn minder betrouwbaar. PTZ moet worden bewaard bij -20 ° C in een exsiccator met een droogmiddel voor gebruik. Wij geven de voorkeur aan PTZ weggooien ongeveer twee maanden na de opening om de stabiliteit te garanderen.
   
   
3. Na het drogen, plaat consistente volumes van E. coli (bij voorkeur OP50)op het midden van elk bord en PTZ drogen voor een 30-60 minuten bij kamertemperatuur. Wij consequent plaat 25 uL van OP50, die een groot genoeg voedsel gazon aan de wormen geconcentreerd in een klein plekje te houden, zonder overbevolking creëert.
    
4. Wanneer het voedsel gazon droog is, kan men verder met PTZ assays. Hoewel de PTZ-assays zijn minder subjectief dan aldicarb testen, is het nog steeds ten zeerste aanbevolen dat de experimenten worden uitgevoerd "blindelings". Een collega van de primaire onderzoeker kan re-label van de originele platen met wormen te worden getest. Ook zou de collega wormen onmiddellijk overdracht van de originele platen versleuteld PTZ-platen vóór het begin van een timer. Als de onderzoeker voorziet het testen van een bepaalde stam van wormen met een karakteristiek fenotype, zoals uncoordination, dan moet er ook een controle met een vergelijkbaar fenotype om vertekening te beperken. Bovendien is het het beste als de experimentator assays een wild-type stam, maar ook stammen met anterior of full-body stuiptrekkingen, parallel te helpen standaardiseren experimenten. De experimentator moet streven naar een consistent aantal wormen te analyseren voor elke repliceren. Wij consequent analyseren dertig wormen van een enkel genotype voor iedere repliceren. We voeren ook ten minste drie replica voor elk experiment. Een ervaren onderzoeker moet in staat zijn om ten minste drie stammen te analyseren op een moment. Toch, de frequentie en de intensiteit van de PTZ-geïnduceerde convulsies meestal piek tussen de 15-30 minuten van de blootstelling, en dan dempen als wormen verlamd raken of, in sommige gevallen, wennen aan het geneesmiddel.
   
   
5. Tel het aantal "epileptische-achtige" stuiptrekkend wormen elke 30 minuten voor een totaal van een uur. Het beste is om het aantal wormen score met anterior convulsies, die wij noemen "head-bobs", los van het aantal wormen met een full-body convulsies, full-body verlamming, die noemen we 'tonic', of een combinatie van anterior convulsies met BWM verlamming, die noemen we 'tonisch-clonische ". De meeste wormen van een enkele genotype vertonen slechts een soort stuiptrekking. Echter, tonisch-clonische wormen worden vaak volledig tonic, dus men moet de test verder afgelopen 30 minuten, zelfs als alle wormen zijn al tentoongesteld stuiptrekkingen. Ook is het opvallend dat enkele wormen kunnen proberen te kruipen uit de plaat. In dat geval kan de onderzoeker zich een consistente hoeveelheid palmitinezuur rond de PTZ-platen. We verspreiden 25 il van 10 mg palmitinezuur / ml EtOH.

Gedragsreacties van geselecteerde C. elegans synaptische transmissie Mutants om Aldicarb en PTZ

Mutant Naam	Synaptic Rol	Gedrag zonder Drug	Behavioral Reactie op Aldicarb (in vergelijking met wild-type N2)	Behavioral Reactie op PTZ
tom-1 (ok188)	remt de synaptische transmissie	ongecoördineerde	verbeterde snelheid van verlamming	niet te onderscheiden van wild-type
unc-43 (n498n1186)	complex	ongecoördineerde	verbeterde snelheid van verlamming	full-body stuiptrekkingen
unc-25 (e156)	bevordert de GABA transmissie	ongecoördineerde	verbeterde snelheid van verlamming	anterior convulsies, full-body verlamming
SNB-1 (md247)	bevordert de synaptische transmissie	ongecoördineerde	verlaagd tarief van verlamming	anterior convulsies
UNC-4 (E120)	bevordert ACh transmissie	ongecoördineerde	verlaagd tarief van verlamming	niet te onderscheiden van wild-type

Twee neurale stimulerende middelen, een acetylcholinesterase-remmer, genaamd aldicarb, en een GABA-receptor antagonist, genaamd pentyleentetrazol (PTZ), kan worden gebruikt in een complementaire wijze om C. elegans synaptische transmissie mutanten te karakteriseren. Excess excitatoire acetylcholine (ACh) hoopt zich op worm lichaam muur neuromusculaire verbindingen (NMJs) van schadelijke mutaties in negatieve regulatoren van ACh transmissie (bijv. tom-1 en unc-43) of positieve regulatoren van remmende GABA transmissie (bijv. unc-25). Omgekeerd zijn prikkelende ACh niveaus worm NMJs verminderd door schadelijke mutaties in positieve regulatoren van de algemene synaptische transmissie (bijv. SNB-1) of ACh-specifieke genen transmissie (bijv. unc-4). In vergelijking met wild-type N2 wormen, wormen mutant met verhoogde prikkelende ACh transmissie bij NMJs vertonen verhoogde tarieven van aldicarb-geïnduceerde verlammingen, terwijl mutant wormen met een verlaagde prikkelende ACh overdracht aan te tonen verlaagde tarieven van aldicarb-geïnduceerde verlammingen. Hoewel PTZ neuronale synchroon verstoort bij C. elegans het lichaam muur spieren, niet in tegenstelling tot aldicarb, PTZ antagoneert ook remmende GABA bij C. elegans het hoofd spieren. Als gevolg hiervan kan aldicarb gevoeligheid niet nauwkeurig te voorspellen PTZ gevoeligheid. Mutant wormen met specifieke afwijkingen in negatieve of positieve regulatie van ACh transmissie zijn niet te onderscheiden van wild-type N2 wormen in het bijzijn van PTZ, terwijl mutant wormen met defecten in positieve verordening van algemeen synaptische transmissie of specifieke afwijkingen in remmende GABA transmissie vertonen robuuste PTZ-geïnduceerde anterior stuiptrekkingen. Bovendien, unc-43 verlies-van-functie mutanten weer full-body stuiptrekkingen in de aanwezigheid van PTZ en waarschijnlijk hebben extra synaptische transmissie afwijkingen, die bijdragen aan hun unieke drugs reacties.

Discussion

De huidige protocollen voor aldicarb blootstelling aan C. elegans staan ​​niet toe dat onderzoekers onderscheid te maken tussen mutanten met specifieke tekorten in ACh transmissie en mutanten met algemene tekorten in synaptische transmissie, aangezien beide klassen van mutanten vertonen weerstand tegen aldicarb. Zo kan aldicarb niet worden gebruikt om te bepalen of mutanten specifieke tekorten in de GABA-transmissie of algemene fouten negatief reguleren ACh transmissie, aangezien beide klassen van mutanten vertonen overgevoeligheid voor aldicarb. Resultaten van onze PTZ blootstelling testen, in combinatie met de resultaten van aldicarb blootstelling assays, stelt onderzoekers in staat om beter te karakteriseren synaptische transmissie mutanten.

C. elegans synaptische transmissie mutanten kunnen worden ingedeeld in een eenvoudige manier door complementaire aldicarb en PTZ blootstelling paradigma's. Aldicarb resistente mutanten met PTZ-geïnduceerde anterior stuiptrekkingen zullen waarschijnlijk een tekort in het algemeen synaptische functie. Omgekeerd, aldicarb resistente mutanten zonder PTZ-geïnduceerde anterior stuiptrekkingen zijn waarschijnlijk specifiek een tekort aan ACh transmissie. Mutanten met aldicarb overgevoeligheid, die niet vertonen PTZ-geïnduceerde anterior convulsies, waarschijnlijk niet negatief te reguleren ACh transmissie. Tot slot, mutanten met aldicarb overgevoeligheid, die vertonen PTZ-geïnduceerde anterior stuiptrekkingen te doen, zijn waarschijnlijk GABA tekort.

Het nut van aldicarb blootstelling is ook verzwakt door haar subjectiviteit, omdat verschillende onderzoekers hebben vaak uiteenlopende definities van verlamming. Een enkele experimentator techniek kan ook fluctueren. Ook aldicarb blootgestelde wormen verplaatsen anders in reactie op de verschillende krachten van porren. Het onderscheid tussen een verlamde worm en een responsieve worm kan net zo subtiel als een lichte kop of staart trillen. In aanvulling op het aanvullen van aldicarb assays voor een betere karakterisering van C. elegans synaptische transmissie mutanten, kan PTZ ook worden gebruikt om synaptische transmissie mutanten, vooral die mutanten te isoleren die overgevoelig zijn voor aldicarb. Onderzoekers, die PTZ blootstelling te gebruiken, kunnen gewoon op zoek naar anterior convulsies, in plaats van subtiele verschillen in de aldicarb-geïnduceerde verlammingen.>

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Aldicarb	Reagent	Supelco, Sigma-Aldrich	PS734	Purchasable from Sigma
Pentylenetetrazole	Reagent	Sigma-Aldrich	P6500