Paradigmes pour la caractérisation pharmacologique de C. elegans mutants transmission synaptique

Summary

Cette vidéo montre comment employer deux stimulants de neurones, aldicarbe et pentylènetétrazole (PTZ), de façon complémentaire pour étudier la fonction synaptique dans le nématode C. elegans. Cette approche complémentaire peut également être utilisé pour faire la lumière sur les mécanismes de l'évolution, conservée pour synchronie neuronale modulant et a des implications pour l'épilepsie et des convulsions.

Abstract

Le nématode Caenorhabditis elegans, est devenu un modèle utile pour étudier la neurotransmission. C. elegans est unique parmi les modèles animaux, que l'anatomie et la connectivité de son système nerveux a été déterminée à partir de micrographies électroniques et affiné par des dosages pharmacologiques. Dans cette vidéo, nous décrivons comment deux complémentaires stimulants de neurones, un inhibiteur de l'acétylcholinestérase, appelé aldicarbe, et un acide gamma-aminobutyrique (GABA) antagoniste des récepteurs, appelés pentylènetétrazole (PTZ), peuvent être employées pour caractériser spécifiquement signalisation à C. elegans jonctions neuromusculaires (NMJs) et de faciliter notre compréhension des antagonistes circuits neuronaux.

De 302 neurones de C. elegans, dix-neuf GABAergiques de type D neurones moteurs innervant muscles de la paroi du corps (BWMs), tandis que quatre neurones GABAergiques, appelé RME, muscles de la tête innervent. Inversement, les neurones moteurs 39 exprimer le neurotransmetteur excitateur, l'acétylcholine (ACh), et la transmission antagonistes GABA à BWMs pour coordonner la locomotion. La nature antagoniste des neurones moteurs GABAergiques et cholinergiques au NMJs paroi du corps a été initialement déterminé par ablation laser et par la suite renforcée par exposition à l'aldicarbe. Aiguë des résultats d'exposition aldicarbe dans une paralysie du temps de cours ou la dose de réactif vers de type sauvage. Pourtant, la perte de l'ACh transmission excitatrice confère une résistance à l'aldicarbe, comme moins ACh s'accumule au NMJs ver, menant à moins de stimulation du BWMs. Résistance à l'aldicarbe peut être observé avec l'ACh spécifiques ou générales mutants fonction synaptique. Conformément aux antagonistes GABA et l'acétylcholine de transmission, la perte de transmission du GABA, ou une incapacité à réguler négativement la libération d'acétylcholine, confère une hypersensibilité à l'aldicarbe. Bien que l'exposition aldicarbe a conduit à l'isolement d'homologues de gènes de nombreuses ver neurotransmission, exposition à l'aldicarbe seul ne peut pas déterminer efficacement les rôles qui prévaut pour les gènes et les voies de neurones spécifiques de C. elegans moteur. À cette fin, nous avons introduit une approche complémentaire expérimentale, qui utilise PTZ.

Mutants neurotransmission affichage phénotypes claire, distincte de l'aldicarbe induite paralysie, en réponse à PTZ. Vers de type sauvage, ainsi que des mutants avec des incapacités spécifiques à la libération d'ACh ou de recevoir, ne montrent pas de sensibilité apparente à PTZ. Toutefois, les mutants de GABA, ainsi que les mutants en général la fonction synaptique, l'affichage des convulsions antérieures dans des délais de cours ou de dose-réactive. Mutants qui ne peuvent pas réguler négativement la libération de neurotransmetteurs générale et, par conséquent, sécrètent des quantités excessives d'ACh sur BWMs, devenu paralysé PTZ. Les phénotypes PTZ-induite des classes de mutants discrets indiquent qu'une approche complémentaire avec l'aldicarbe et de paradigmes d'exposition PTZ chez C. elegans peut accélérer notre compréhension de la neurotransmission. Par ailleurs, les vidéos démontrant comment nous effectuons des tests pharmacologiques devraient établir des méthodes cohérentes pour la recherche de C. elegans.

Protocol

Paradigme exposition à l'aldicarbe

1. Le premier jour, s'assurer que, au moins trente jeunes vers le stade adulte de chaque génotype et de chaque répétition sera disponible pour des essais de l'aldicarbe sur la deuxième journée. Il est préférable si un expérimentateur sélectionne une cinquantaine ou plus vers l'étape L4 sur des plaques NGM frais (mieux sans nystatine), qui contiennent E. coli (de préférence OP50) comme source de nourriture, et les cultiver pendant 12-24 heures à une température constante et permissive (20 ° C à 22 ° C est préférable, bien que 25 ° C est correct).
   
   
2. Le deuxième jour, faire une solution 100 mM d'aldicarbe à l'éthanol 70% (EtOH) et 30% ddH ₂ O. Passez le montant approprié de l'aldicarbe sur des plaques NGM moins nystatine avec des volumes définis pour atteindre les concentrations d'aldicarbe désiré. Nous avons constamment utiliser 0,5 mM aldicarbe par plaquage 37,5 uL de 100 mm sur 7,5 aldicarbe plaques NGM ml. Laisser les plaques aldicarbe à sécher pendant environ 30-60 minutes à température ambiante. Il n'est pas nécessaire de casser le couvercle. Alternativement, l'aldicarbe peut être ajouté à NGM et conservés à 4 ° C pendant une semaine.
    
3. Après le séchage des volumes, assiette uniforme de E. coli (de préférence OP50) sur le centre de chaque assiette aldicarbe et sec pour un autre 30-60 minutes à température ambiante. Nous avons constamment plaque 25 uL d'OP50, ce qui crée une pelouse alimentaires de taille suffisante pour maintenir les vers concentrée dans un petit coin sans surpeuplement.
    
4. Lorsque la pelouse est sèche la nourriture, on peut procéder à des dosages aldicarbe. En raison de la nature subjective des dosages aldicarbe, il est fortement recommandé que les expériences soient effectuées "aveuglément". Un collègue de l'expérimentateur primaire pourrait ré-étiqueter les plaques originales avec des vers à doser. De même, le collègue pourrait transférer vers des plaques originales sur des plaques de aldicarbe crypté immédiatement avant le démarrage d'une minuterie. Si l'expérimentateur anticipe titrant une souche particulière de virus avec un phénotype caractéristique, comme manque de coordination, alors il faut aussi un contrôle avec un phénotype similaire à réduire les préjugés. Par ailleurs, il est préférable si l'expérimentateur dosages d'une souche de type sauvage, ainsi que d'une souche résistante et une souche hypersensible, en parallèle pour aider à normaliser les expériences. L'expérimentateur doit s'efforcer d'analyser un nombre constant de vers pour chaque réplique. Nous avons constamment analyser les vers de thirty un génotype unique pour chaque répétition. Nous avons également effectuer au moins trois répétitions pour chaque expérience. Un expérimentateur expérimenté devrait être capable d'analyser au moins six souches à la fois.
    
5. Comptez le nombre de vers paralysé par aiguillon d'une manière cohérente chaque ver avec un fil de platine. Nous avons constamment prod nos vers à deux reprises sur la tête et deux sur la queue toutes les 30 minutes pour un total de trois heures. Cessation de pompage du pharynx peut également être utilisé pour définir la paralysie, mais seulement si l'expérimentateur emploie une définition cohérente de paralysie sur tous les dosages. Aussi, il est intéressant de noter que certains vers, en particulier ceux qui sont résistants à l'aldicarbe, peut tenter de ramper hors de la plaque. Dans ce cas, l'expérimentateur peut répandre une quantité constante de l'acide palmitique, une barrière physique à la locomotion ver, autour des plaques aldicarbe. Nous répandons 25 ul de 10 mg d'acide palmitique / ml EtOH.

Paradigme de l'exposition PTZ

1. Le premier jour, s'assurer que, au moins trente jeunes vers le stade adulte de chaque génotype et de chaque répétition sera disponible pour des essais de PTZ, le deuxième jour. Il est préférable si un expérimentateur sélectionne une cinquantaine ou plus vers l'étape L4 sur des plaques NGM frais (mieux sans nystatine), qui contiennent E. coli (de préférence OP50) comme source de nourriture, et les cultiver pendant 12-24 heures à une température constante et permissive (20 ° C à 22 ° C est préférable, bien que 25 ° C est correct).
   
   
2. Le deuxième jour, faire un PTZ 0,5 g / ml solution stock ddH ₂ O du PTZ. Étendre la quantité appropriée de PTZ sur NGM minus plaques nystatine avec des volumes définis pour atteindre les concentrations PTZ désiré. Parce que nous préférons dose-réponse des dosages pour PTZ, nous plateau des quantités variables de PTZ sur 7,5 ml plaques NGM. Par exemple, on peut la plaque 37,5 ul de la solution stock PTZ sur une plaque 7,5 ml NGM pour faire un 5 mg PTZ / ml solution. Laisser les plaques PTZ à sécher pendant environ 60-120 minutes à température ambiante. Il n'est pas nécessaire de casser le couvercle. Alternativement, le PTZ peut être ajouté directement à NGM, mais il devrait être immédiatement utilisé pour les essais après solidification. La stabilité du PTZ est considérablement inférieure à celle de l'aldicarbe. Par conséquent, les essais avec des plaques PTZ âgées sont moins fiables. PTZ doit être conservé à -20 ° C dans un dessicateur avec un agent de séchage avant utilisation. Nous préférons jeter PTZ environ deux mois après l'ouverture pour assurer la stabilité.
   
   
3. Après le séchage des volumes, assiette uniforme de E. coli (de préférence OP50)sur le centre de chaque assiette PTZ et sec pour un autre 30-60 minutes à température ambiante. Nous avons constamment plaque 25 uL d'OP50, ce qui crée une pelouse alimentaires de taille suffisante pour maintenir les vers concentrée dans un petit coin sans surpeuplement.
    
4. Lorsque la pelouse est sèche la nourriture, on peut procéder à des dosages PTZ. Bien que des dosages PTZ sont moins subjectifs que des dosages aldicarbe, il est toujours fortement recommandé que les expériences soient effectuées "aveuglément". Un collègue de l'expérimentateur primaire pourrait ré-étiqueter les plaques originales avec des vers à doser. De même, le collègue pourrait transférer vers des plaques originales sur des plaques de PTZ crypté immédiatement avant le démarrage d'une minuterie. Si l'expérimentateur anticipe titrant une souche particulière de virus avec un phénotype caractéristique, comme manque de coordination, alors il faut aussi un contrôle avec un phénotype similaire à réduire les préjugés. Par ailleurs, il est préférable si l'expérimentateur dosages d'une souche de type sauvage, ainsi que les souches ayant antérieure ou du corps entier des convulsions, en parallèle pour aider à normaliser les expériences. L'expérimentateur doit s'efforcer d'analyser un nombre constant de vers pour chaque réplique. Nous avons constamment analyser les vers de thirty un génotype unique pour chaque répétition. Nous avons également effectuer au moins trois répétitions pour chaque expérience. Un expérimentateur expérimenté devrait être capable d'analyser au moins trois souches à la fois. Pourtant, la fréquence et l'intensité du PTZ convulsions provoquées par habitude pic entre 15-30 minutes d'exposition, puis atténuer les vers deviennent paralysés ou, dans certains cas, s'acclimater à la drogue.
   
   
5. Comptez le nombre de "épileptique comme« convulsions vers toutes les 30 minutes pour un total d'une heure. Il est préférable de marquer le nombre de vers avec des convulsions antérieures, que nous appelons «la tête-bobs», séparément du nombre de vers avec tout le corps des convulsions, une paralysie complète du corps, que nous appelons «tonique», ou une combinaison des convulsions antérieures à la paralysie BWM, que nous appelons «tonico-cloniques». La plupart des vers d'un seul génotype exposer un seul type de convulsion. Toutefois, tonico-cloniques des vers souvent devenus complètement tonique, si on doit continuer le test des 30 dernières minutes, même si tous les vers ont déjà montré des convulsions. Aussi, il est intéressant de noter que certains vers peuvent tenter de ramper hors de la plaque. Dans ce cas, l'expérimentateur peut répandre une quantité constante de l'acide palmitique autour des plaques PTZ. Nous répandons 25 ul de 10 mg d'acide palmitique / ml EtOH.

Réponses comportementales de certains mutants de C. elegans transmission synaptique à l'aldicarbe et PTZ

Nom Mutant	Rôle Synaptic	Comportement sans drogue	Réponse comportementale à l'aldicarbe (comparé au type sauvage N2)	Réponse comportementale au PTZ
Tom-1 (ok188)	inhibe la transmission synaptique	non coordonnés	taux bonifié de la paralysie	indiscernable de type sauvage
unc-43 (n498n1186)	complexes	non coordonnés	taux bonifié de la paralysie	du corps entier des convulsions
unc-25 (E156)	favorise la transmission du GABA	non coordonnés	taux bonifié de la paralysie	convulsions antérieures, une paralysie complète du corps
SNB-1 (md247)	favorise la transmission synaptique	non coordonnés	taux réduit de la paralysie	convulsions antérieures
unc-4 (E120)	favorise la transmission d'ACh	non coordonnés	taux réduit de la paralysie	indiscernable de type sauvage

Deux stimulants de neurones, un inhibiteur de l'acétylcholinestérase, appelé aldicarbe, et un antagoniste des récepteurs GABA, appelé pentylènetétrazole (PTZ), peuvent être utilisées de manière complémentaire à caractériser C. elegans mutants transmission synaptique. L'excès d'acétylcholine excitateurs (ACh) s'accumule au ver corps mur de jonctions neuromusculaires (NMJs) de mutations délétères dans les régulateurs négatifs de l'ACh transmission (par exemple tam-1 et unc-43) ou des régulateurs positifs de la transmission inhibitrice GABA (par exemple, unc-25). Inversement, les niveaux de l'acétylcholine au excitateurs NMJs ver sont diminués par des mutations délétères dans les régulateurs positifs de la transmission synaptique général (par exemple, SNB-1) ou des gènes de transmission ACh spécifiques (par exemple unc-4). Lorsqu'on les compare à des vers N2 de type sauvage, vers mutants présentant un taux élevé d'ACh transmission excitatrice au NMJs présentent des taux majorés d'aldicarbe-induite paralysie, tandis que les vers mutants avec des abaissé ACh transmission excitatrice montrent des taux réduits de l'aldicarbe induite paralysie. Bien PTZ perturbe synchronie neuronale au muscles C. elegans paroi du corps, n'est pas sans rappeler l'aldicarbe, PTZ antagonise aussi inhibiteur GABA au muscles C. elegans la tête. En conséquence, la sensibilité aldicarbe peut pas prédire avec précision la sensibilité PTZ. Vers mutants avec des défauts spécifiques au règl négatif ou positiftion de la transmission d'ACh sont indiscernables des vers N2 de type sauvage en présence du PTZ, tandis que vers mutants avec des défauts dans la régulation positive de la transmission synaptique général ou des défauts spécifiques à la pièce de transmission inhibiteur GABA robustes PTZ convulsions provoquées antérieure. Par ailleurs, unc-43 de perte de fonction de mutants d'affichage complet du corps des convulsions en présence du PTZ et probablement d'autres anomalies de la transmission synaptique, qui contribuent à leurs réponses médicament unique.

Discussion

Les protocoles actuels d'exposition à l'aldicarbe avec C. elegans ne permettent pas de distinguer entre les expérimentateurs mutants avec des déficits spécifiques dans la transmission de l'acétylcholine et des mutants avec des déficits généralisés dans la transmission synaptique, comme les deux classes de mutants présentent une résistance à l'aldicarbe. De même, l'aldicarbe ne peut pas être utilisé pour déterminer si les mutants ont des déficits spécifiques dans la transmission du GABA ou les défaillances généralisées à réguler négativement l'ACh de transmission, comme les deux classes de mutants présentent une hypersensibilité à l'aldicarbe. Les résultats de nos essais d'exposition PTZ, lorsqu'ils sont combinés avec les résultats des tests exposition à l'aldicarbe, permet aux chercheurs de mieux caractériser les mutants de la transmission synaptique.

C. elegans mutants transmission synaptique peuvent être classés d'une manière directe par les complémentaires aldicarbe et paradigmes d'exposition PTZ. Mutants résistants à l'aldicarbe PTZ convulsions provoquées antérieure sont susceptibles déficient dans la fonction synaptique général. Inversement, des mutants résistants, sans aldicarbe PTZ convulsions provoquées antérieure sont susceptibles spécifiquement déficients en ACh transmission. Mutants avec aldicarbe hypersensibilité, qui ne présentent pas PTZ convulsions provoquées antérieure, probablement pas à réguler négativement la transmission d'ACh. Enfin, des mutants ayant une hypersensibilité aldicarbe, qui ne présentent PTZ convulsions provoquées antérieure, sont susceptibles de GABA déficient.

L'utilité d'exposition à l'aldicarbe est également affaibli par sa subjectivité, comme différents expérimentateurs ont souvent différentes définitions de la paralysie. Technique de l'expérimentateur Une seule peut également varier. Des vers aussi, l'aldicarbe-exposés évoluent différemment en réponse à diverses forces de l'aiguillon. La distinction entre un ver et un ver paralysée réactif peut être aussi subtile que d'une tête légère, bougent la queue. En plus de compléter les analyses aldicarbe pour une meilleure caractérisation de C. mutants elegans transmission synaptique, le PTZ peut aussi être utilisé pour isoler des mutants de la transmission synaptique, en particulier ceux des mutants présentant une hypersensibilité à l'aldicarbe. Les expérimentateurs, qui utilisent l'exposition PTZ, peuvent simplement chercher des convulsions antérieures, au lieu de subtiles différences dans l'aldicarbe induite paralysie.>

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Aldicarb	Reagent	Supelco, Sigma-Aldrich	PS734	Purchasable from Sigma
Pentylenetetrazole	Reagent	Sigma-Aldrich	P6500