Summary
Dieses Video zeigt, wie zwei neuronalen Stimulanzien, Aldicarb und Pentylentetrazol (PTZ), in komplementärer Weise zu synaptische Funktion in dem Fadenwurm C. elegans Studie beschäftigen. Mit diesem ergänzenden Ansatz kann auch verwendet werden, um Licht auf evolutionär konservierte Mechanismen zur Modulation neuronaler Synchronität vergossen werden und hat Auswirkungen auf Epilepsie und Krampfanfällen.
Abstract
Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans, hat sich eine sinnvolle Modell für die Untersuchung Neurotransmission. C. elegans ist einzigartig unter den Tiermodellen, wie die Anatomie und Anschlussfähigkeit seiner Nervensystem aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen ermittelt und verfeinert durch pharmakologische Tests. In diesem Video, beschreiben wir, wie zwei sich ergänzende neuronalen Stimulanzien, ein Acetylcholinesterase-Hemmer genannt Aldicarb, und ein Gamma-Aminobuttersäure (GABA)-Rezeptor-Antagonist, genannt Pentylentetrazol (PTZ), eingesetzt werden können, um speziell kennzeichnen Signalisierung bei C. elegans neuromuskulären Endplatten (NMJs) und erleichtern das Verständnis der antagonistischen neuronalen Schaltkreisen.
Von 302 C. elegans Neuronen, neunzehn GABAergen D-Typ-Motoneuronen innervieren Körperwand Muskeln (BWMs), während vier GABAergen Neuronen, genannt RMEs, innervieren Kopf Muskeln. Umgekehrt äußern 39 Motoneuronen des erregenden Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) und antagonisieren GABA-Übertragung bei BWMs die Fortbewegung zu koordinieren. Die antagonistische Natur der GABAergen und cholinergen Motoneuronen bei Körpertemperatur Wand NMJs wurde zunächst durch Laserablation ermittelt und später von Aldicarb Exposition untermauert. Akute Aldicarb Exposition führt zu einer zeitlichen Verlauf oder Dosis-responsive Lähmung in Wildtyp-Würmer. Dennoch verleiht Verlust von erregenden ACh Übergangswiderstände zu Aldicarb, als weniger ACh sammelt sich am Wurm NMJs, was zu weniger Stimulation BWMs. Der Widerstand gegen Aldicarb kann mit ACh-spezifische oder allgemeine synaptische Funktion Mutanten beobachtet werden. In Übereinstimmung mit antagonistischen GABA und ACh Übertragung, Verlust von GABA Übertragung oder einen Verstoß gegen negativ regulieren ACh Freisetzung verleiht Überempfindlichkeit gegen Aldicarb. Obwohl Aldicarb Exposition auf die Isolierung von zahlreichen Wurm Homologen der Neurotransmission Gene geführt hat, Aldicarb Exposition allein nicht effizient bestimmen vorherrschenden Rollen für Gene und Signalwege in bestimmten C. elegans Motoneuronen. Zu diesem Zweck haben wir eine komplementäre experimentelle Ansatz, der PTZ verwendet eingeführt.
Neurotransmission Mutanten Anzeige zu löschen Phänotypen, die sich von Aldicarb-induzierte Paralyse, in Reaktion auf PTZ. Wild-Typ Würmer, sowie Mutanten mit spezifischen Unfähigkeit zur Veröffentlichung oder zu empfangen ACh, zeigen nicht erkennbar Sensibilität für PTZ. Jedoch zeigen die GABA-Mutanten, sowie allgemeine synaptische Funktion Mutanten, anterior Krämpfe in einer Zeit-Gänge-oder Dosis-responsive Art und Weise. Mutanten, die nicht negativ regulieren allgemeine Freisetzung von Neurotransmittern können und somit ausscheiden übermäßige Mengen von ACh auf BWMs, gelähmt auf PTZ. Die PTZ-induzierten Phänotypen von diskreten mutierten Klassen zeigen, dass ein komplementärer Ansatz mit Aldicarb und PTZ Exposition Paradigmen in C. elegans kann unser Verständnis der Neurotransmission zu beschleunigen. Darüber hinaus sollten die Videos zeigen, wie wir pharmakologische Tests durchführen zu etablieren konsistente Methoden für C. elegans Forschung.
Protocol
Aldicarb Exposure Paradigm
- Am ersten Tag, dass mindestens dreißig jungen erwachsenen Stadium Würmer von jedem Genotyp und der jede Wiederholung verfügbar sein wird für Aldicarb Assays am zweiten Tag. Am besten ist es, wenn ein Experimentator wählt fünfzig oder mehr L4 Stadium Würmer auf frische NGM-Platten (am besten ohne Nystatin), die E. enthalten coli (vorzugsweise OP50) als Nahrungsquelle, und wachsen sie für 12-24 Stunden bei einer konsistenten und permissiven Temperatur (20 ° C bis 22 ° C ist am besten, obwohl 25 ° C ist okay).
- Am zweiten Tag, eine 100 mM Stammlösung von Aldicarb mit 70% Ethanol (EtOH) und 30% ddH 2 O. Verbreiten Sie den entsprechenden Betrag von Aldicarb auf NGM minus Nystatin Platten mit definierter Volumina, um die gewünschte Aldicarb Konzentrationen zu erreichen. Wir nutzen konsequent 0,5 mM Aldicarb durch Ausplattieren 37,5 ul 100 mM Aldicarb auf 7,5 ml NGM-Platten. Lassen Sie die Aldicarb Platten für etwa 30-60 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Es ist nicht notwendig, den Deckel zu knacken. Alternativ können Aldicarb auf NGM hinzugefügt werden und bei 4 ° C für eine Woche.
- Nach dem Trocknen Platte konsistente Mengen von E. coli (vorzugsweise OP50) auf die Mitte jeder Platte Aldicarb und trocken für weitere 30-60 Minuten bei Raumtemperatur. Wir orientieren uns konsequent Platte 25 ul OP50, die eine ausreichend große Lebensmittel Rasen, um die Würmer in einem kleinen Ort konzentriert, ohne Überbelegung zu halten schafft.
- Als das Essen Rasen trocken ist, kann man mit Aldicarb Assays gehen. Aufgrund der subjektiven Natur der Aldicarb-Assays ist es dringend empfohlen, dass Experimente durchgeführt "blind" werden. Ein Kollege von der primären Experimentator könnte re-label den ursprünglichen Platten mit Würmern zu untersucht werden. Ebenso könnte der Kollege Würmer aus der ursprünglichen Platten verschlüsselt Aldicarb Platten sofort in die vor dem Start eines Timers. Wenn der Experimentator erwartet Testen einer bestimmten Stamm der Würmer mit einem charakteristischen Phänotyp, wie uncoordination, dann muß es auch eine Steuerung mit einem ähnlichen Phänotyp, um Verzerrungen zu reduzieren. Darüber hinaus ist es am besten, wenn der Experimentator Assays einer Wildtyp-Stammes, sowie ein resistenter Stamm und einer Überempfindlichkeit Belastung, parallel zur Standardisierung Experimente. Der Versuchsleiter sollte sich bemühen, eine einheitliche Anzahl von Würmern für jede Wiederholung zu analysieren. Wir orientieren uns konsequent analysieren thirty Würmer aus einem einzigen Genotyp für jede Wiederholung. Wir führen auch mindestens drei Replikate für jedes Experiment. Ein erfahrener Experimentator sollte in der Lage, mindestens sechs Stämme zu einem Zeitpunkt, zu analysieren.
- Zählt die Anzahl der gelähmten Würmer durch Drängen auf konsistente Weise jeder Wurm mit einem Platindraht. Wir setzen konsequent unsere Produkte Würmer zweimal auf den Kopf und zweimal auf den Schwanz alle 30 Minuten für insgesamt drei Stunden. Einstellung der Rachen-Pumpen können auch zur Lähmung zu definieren, aber nur, wenn der Experimentator eine einheitliche Definition der Lähmung über alle Tests beschäftigt. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass einige Würmer, insbesondere diejenigen, die resistent gegen Aldicarb sind, kann versuchen, kriechen aus der Platte. In diesem Fall kann der Experimentator verbreiten eine gleichbleibende Menge an Palmitinsäure, eine physikalische Barriere gegen Wurm Fortbewegung, um die Aldicarb Platten. Wir verteilen 25 ul 10 mg Palmitinsäure / mL EtOH.
PTZ Exposure Paradigm
- Am ersten Tag, dass mindestens dreißig jungen erwachsenen Stadium Würmer von jedem Genotyp und der jede Wiederholung verfügbar sein wird für PTZ-Assays am zweiten Tag. Am besten ist es, wenn ein Experimentator wählt fünfzig oder mehr L4 Stadium Würmer auf frische NGM-Platten (am besten ohne Nystatin), die E. enthalten coli (vorzugsweise OP50) als Nahrungsquelle, und wachsen sie für 12-24 Stunden bei einer konsistenten und permissiven Temperatur (20 ° C bis 22 ° C ist am besten, obwohl 25 ° C ist okay).
- Am zweiten Tag, eine 0,5 g PTZ / mL ddH 2 O Stammlösung von PTZ. Verbreiten Sie die entsprechende Menge an PTZ auf NGM minus Nystatin Platten mit definierter Volumina, um die gewünschte PTZ-Konzentrationen zu erreichen. Weil wir Dosis-Wirkungs-Assays lieber für PTZ, wir Platte unterschiedliche Mengen von PTZ auf 7,5 ml NGM-Platten. Zum Beispiel kann man Teller 37,5 ul der PTZ-Stammlösung auf eine 7,5 ml NGM Platte zu machen eine 5 mg PTZ / ml-Lösung. Lassen Sie die PTZ-Platten für etwa 60-120 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Es ist nicht notwendig, den Deckel zu knacken. Alternativ können PTZ direkt an NGM hinzugefügt werden, aber es sollte sofort für Tests werden nach dem Erstarren verwendet. Die Stabilität des PTZ ist erheblich geringer als die von Aldicarb. Daher sind Tests mit älteren PTZ Platten weniger zuverlässig. PTZ sollte bei -20 ° C in einem Exsikkator mit Trockenmittel vor der Verwendung gelagert. Wir bevorzugen es, PTZ verwerfen etwa zwei Monate nach der Eröffnung, um die Stabilität zu gewährleisten.
- Nach dem Trocknen Platte konsistente Mengen von E. coli (vorzugsweise OP50)auf die Mitte eines jeden PTZ Platte und trocken für weitere 30-60 Minuten bei Raumtemperatur. Wir orientieren uns konsequent Platte 25 ul OP50, die eine ausreichend große Lebensmittel Rasen, um die Würmer in einem kleinen Ort konzentriert, ohne Überbelegung zu halten schafft.
- Als das Essen Rasen trocken ist, kann man mit PTZ-Assays vor. Obwohl PTZ-Assays weniger subjektiv als Aldicarb Assays sind, ist es dennoch dringend empfohlen, dass Experimente durchgeführt "blind" werden. Ein Kollege von der primären Experimentator könnte re-label den ursprünglichen Platten mit Würmern zu untersucht werden. Ebenso könnte der Kollege Würmer aus der ursprünglichen Platten verschlüsselt PTZ Platten sofort in die vor dem Start eines Timers. Wenn der Experimentator erwartet Testen einer bestimmten Stamm der Würmer mit einem charakteristischen Phänotyp, wie uncoordination, dann muß es auch eine Steuerung mit einem ähnlichen Phänotyp, um Verzerrungen zu reduzieren. Darüber hinaus ist es am besten, wenn der Experimentator Assays einer Wildtyp-Stammes, sowie Stämme mit Front-oder Ganzkörper-Krämpfe, parallel zur Standardisierung Experimente. Der Versuchsleiter sollte sich bemühen, eine einheitliche Anzahl von Würmern für jede Wiederholung zu analysieren. Wir orientieren uns konsequent analysieren thirty Würmer aus einem einzigen Genotyp für jede Wiederholung. Wir führen auch mindestens drei Replikate für jedes Experiment. Ein erfahrener Experimentator sollte in der Lage, mindestens drei Stämme zu einem Zeitpunkt, zu analysieren. Dennoch dämpfen die Häufigkeit und Intensität von PTZ-induzierten Krämpfe in der Regel Höhepunkt zwischen 15-30 Minuten der Exposition, und dann als Würmer gelähmt zu werden oder, in einigen Fällen zu gewöhnen, um das Medikament.
- Zählt die Anzahl der "Epilepsie-ähnliche" convulsing Würmer alle 30 Minuten für insgesamt eine Stunde. Am besten ist es, die Zahl der Würmer mit vorderen Krämpfe, die wir als "head-Bobs" score, getrennt von der Anzahl der Würmer mit Ganzkörper-Krämpfe, Ganzkörper-Lähmung, die wir als "Tonic", oder eine Kombination aus vorderen Krämpfe mit BWM Lähmung, die wir als "tonisch-klonischen". Die meisten Würmer aus einem einzigen Genotyp weisen nur eine Art von Erschütterung. Allerdings tonisch-klonischen Würmer häufig völlig Tonic, so sollte man den Test letzten 30 Minuten weiter, selbst wenn alle Würmer bereits Krämpfe gezeigt haben. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass einige Würmer kann versuchen, kriechen aus der Platte. In diesem Fall kann der Experimentator verbreiten eine gleichbleibende Menge an Palmitinsäure rund um den PTZ-Platten. Wir verteilen 25 ul 10 mg Palmitinsäure / mL EtOH.
Verhaltensreaktionen ausgewählter C. elegans Synaptic Transmission Mutanten zu Aldicarb und PTZ
| Mutant Namen | Synaptic Rolle | Verhalten ohne Droge | Behavioral Response to Aldicarb (im Vergleich zu Wildtyp-N2) | Behavioral Response to PTZ |
|---|---|---|---|---|
| tom-1 (ok188) | hemmt die synaptische Übertragung | unkoordiniert | höhere Geschwindigkeit der Lähmung | nicht von Wildtyp- |
| unc-43 (n498n1186) | Komplex | unkoordiniert | höhere Geschwindigkeit der Lähmung | Ganzkörper-Krämpfe |
| unc-25 (e156) | fördert GABA Übertragung | unkoordiniert | höhere Geschwindigkeit der Lähmung | vorderen Krämpfe, Ganzkörper-Lähmung |
| SNB-1 (md247) | fördert die synaptische Übertragung | unkoordiniert | ermäßigten Satz von Lähmung | vorderen Krämpfe |
| unc-4 (e120) | fördert ACh Übertragung | unkoordiniert | ermäßigten Satz von Lähmung | nicht von Wildtyp- |
Zwei neuronale Stimulanzien, ein Acetylcholinesterase-Hemmer genannt Aldicarb, und ein GABA-Rezeptor-Antagonist, genannt Pentylentetrazol (PTZ), kann in Ergänzung zu C. elegans synaptischen Übertragung Mutanten kennzeichnen verwendet werden. Überschüssiges exzitatorischen Acetylcholin (ACh) sammelt sich am Wurm Körperwand neuromuskulären Synapsen (NMJs) von schädlichen Mutationen in negative Regulatoren der ACh-Übertragung (zB tom-1 und unc-43) oder positive Regulatoren der hemmenden GABA-Übertragung (zB unc-25). Umgekehrt sind die erregenden ACh Ebenen, auf Wurm NMJs von schädlichen Mutationen in positive Regulatoren der allgemeinen synaptischen Übertragung (zB SNB-1) oder ACh-spezifische Übertragung Gene (zB unc-4) verringert. Wenn zum Wildtyp N2 Würmer zeigen gegenüber mutierten Würmer mit erhöhten exzitatorischen ACh-Übertragung bei NMJs verbesserten Raten von Aldicarb-induzierte Paralyse, während mutierten Würmer mit gesenktem erregenden ACh Übertragung ermäßigte Aldicarb-induzierte Paralyse zu demonstrieren. Obwohl PTZ stört neuronalen Synchronie bei C. elegans Körperwand Muskeln, nicht anders als Aldicarb, PTZ auch antagonisiert hemmenden GABA bei C. elegans Kopf Muskeln. Als Ergebnis kann Aldicarb Empfindlichkeit nicht genau vorhersagen, PTZ-Empfindlichkeit. Mutant Würmer mit bestimmten Defekten in negative oder positive regulATION von ACh Übertragung aus Wildtyp-N2 Würmer in Gegenwart von PTZ unterscheiden, während mutierten Würmer mit Defekten in positive Regelung der allgemeinen synaptischen Übertragung oder spezifische Defekte in inhibitorischen GABA Transmission aufweisen robust PTZ-induzierten vorderen Krämpfe. Darüber hinaus zeigen unc-43 loss-of-function-Mutanten Ganzkörper-Krämpfe in Gegenwart von PTZ und wahrscheinlich zusätzliche synaptische Übertragung Anomalien, die auf ihre einzigartigen Wirkstoff Lösungen beitragen.
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Discussion
Aktuelle Protokolle für Aldicarb Exposition mit C. elegans nicht zulassen Experimentatoren zwischen Mutanten mit besonderen Defiziten der ACh Übertragung und Mutanten mit generalisierten Defizite in der synaptischen Übertragung zu unterscheiden, da beide Klassen von Mutanten Resistenz gegenüber Aldicarb. Ebenso können Aldicarb nicht verwendet werden, um festzustellen, ob Mutanten spezifische Defizite in GABA Übertragung oder generalisierte Ausfälle haben, negativ zu regulieren ACh Übertragung, da beide Klassen von Mutanten Überempfindlichkeit aufweisen, um Aldicarb werden. Ergebnisse aus unseren PTZ Exposition Assays, wenn mit den Ergebnissen aus Aldicarb Exposition Assays kombiniert, ermöglicht es Forschern, besser zu charakterisieren synaptischen Übertragung Mutanten.
C. elegans synaptischen Übertragung Mutanten können auf einfache Weise durch komplementäre Aldicarb und PTZ Exposition Paradigmen klassifiziert werden. Aldicarb resistenten Mutanten mit PTZ-induzierten vorderen Krämpfe sind wahrscheinlich in der Regel synaptische Funktion mangelhaft. Umgekehrt sind Aldicarb resistenten Mutanten ohne PTZ-induzierten vorderen Krämpfe wahrscheinlich speziell Mangel an ACh-Übertragung. Mutanten mit Aldicarb Überempfindlichkeit, die nicht aufweisen PTZ-induzierten vorderen Krämpfe, wahrscheinlich nicht, negativ regulieren ACh-Übertragung. Schließlich sind Mutanten mit Aldicarb Überempfindlichkeit, die Ausstellung PTZ-induzierten vorderen Krämpfen zu tun, wahrscheinlich GABA mangelhaft.
Der Nutzen der Aldicarb Exposition ist auch durch seine Subjektivität geschwächt, da verschiedene Experimentatoren haben oft unterschiedliche Definitionen der Lähmung. Ein einziger Experimentators Technik kann auch schwanken. Auch Aldicarb ausgesetzten Würmer bewegen sich anders als Reaktion auf diverse Kräfte des Drängens. Die Unterscheidung zwischen einem gelähmten Wurm und eine ansprechende Wurm kann so subtil wie eine leichte Kopf oder Schwanz zucken. Zusätzlich zu ergänzen Aldicarb Assays zur besseren Charakterisierung von C. elegans synaptischen Übertragung Mutanten können PTZ auch zur synaptischen Übertragung Mutanten, vor allem solche Mutanten mit Überempfindlichkeit gegen Aldicarb zu isolieren. Experimentatoren, die PTZ Exposition zu nutzen, kann einfach für Front-Krämpfe schauen, statt feine Unterschiede in Aldicarb-induzierten Paralyse.>
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Acknowledgments
Wir wollen den Geist der Zusammenarbeit aller Caldwell Lab Mitglieder anzuerkennen. Ein Basil O'Connor Scholar Award der March of Dimes und ein Career Award von der National Science Foundation an GAC, sowie ein Undergraduate Research Science Program Stipendium des Howard Hughes Medical Institute an der University of Alabama haben neuronale Erregbarkeit und finanziert Epilepsie-Forschung in den Caldwell Lab.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma-Aldrich | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
