Summary
וידאו זה מדגים כיצד להעסיק two ממריצים עצביים, aldicarb ו pentylenetetrazole (PTZ), בדרכים משלימות ללמוד לתפקד סינפטיים של נמטודות, C. elegans. גישה זו משלימה עשוי לשמש גם כדי לשפוך אור על מנגנוני שמור באבולוציה עבור בתיאום ויסות עצבי ויש לו השלכות על אפילפסיה והתקפים.
Abstract
נמטודות, Caenorhabditis elegans, הפך מודל רצוי ללימוד עצבית. סי אלגנס הוא ייחודי בין במודלים של בעלי חיים, כמו אנטומיה קישוריות של מערכת העצבים שלו נקבע מן micrographs אלקטרונים ומעודן ידי מבחני תרופתי. בסרטון הזה, אנו מתארים כיצד שני ממריצים עצביים משלימה, מעכב acetylcholinesterase, שנקרא aldicarb, וכן חומצה גמא-aminobutyric (GABA) אנטגוניסט לרצפטור, שנקרא pentylenetetrazole (PTZ), יכולים להיות מועסקים במיוחד כדי לאפיין איתות ב C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) ולהקל על ההבנה שלנו של מעגלים עצביים אנטגוניסטית.
מתוך 302 C. elegans נוירונים, אלף תשע GABAergic D-סוג מנוע נוירונים קיר innervate גוף שרירי (BWMs), בעוד ארבעה נוירונים GABAergic, שנקרא RMEs, שרירי הראש innervate. לעומת זאת, 39 הנוירונים המנוע לבטא את הגירוי העצבי, אצטילכולין (ACH), ואת להרגיז השידור GABA על BWMs לתאם תנועה. טבע אנטגוניסטית של נוירונים מנוע GABAergic ו cholinergic ב NMJs הגוף קיר נקבע בתחילה על ידי אבלציה לייזר חיזקה מאוחר יותר על ידי חשיפה aldicarb. חשיפה אקוטית aldicarb תוצאות שיתוק זמן מנות או מנה תגובה ב wild-type תולעים. עם זאת, הפסד של שידור אח מעוררים מקנה עמידות aldicarb, כמו אח פחות מצטבר ב NMJs תולעת, המוביל גירוי פחות BWMs. ההתנגדות aldicarb אפשר לראות עם אח ספציפי או כללי מוטנטים פונקציה הסינפטי. בהתאם GABA אנטגוניסטית ו ACH השידור, אובדן השידור GABA, או כישלון שלילי להסדיר אח שחרורו, מקנה רגישות יתר aldicarb. למרות החשיפה aldicarb הוביל לבידוד של homologs תולעת רבים של גנים עצבית, חשיפה aldicarb לבדו לא יכול לקבוע ביעילות תפקידים הרווחת עבור גנים מסלולים ספציפיים C. elegans נוירונים המנוע. לשם כך, יש לנו הציגה גישה ניסויית משלימים, אשר משתמשת PTZ.
מוטנטים עצבית להציג פנוטיפים ברורים, להבדיל משיתוק aldicarb-Induced, בתגובה PTZ. Wild-type תולעים, כמו גם מוטנטים עם inabilities ספציפי לשחרר או לקבל אח, לא מראים רגישות ברור PTZ. עם זאת, מוטציות GABA, כמו גם מוטנטים בכלל פונקציה הסינפטי, להציג עוויתות הקדמי באופן זמן או כמובן במינון תגובה. מוטאנטים שלא ניתן לווסת באופן שלילי שחרור הנוירוטרנסמיטר כללי, ולכן מפרישים כמויות עודפות של אח על BWMs, הפך משותק PTZ. PTZ-Induced פנוטיפים של כיתות מוטציה בדידה עולה כי גישה משלימים עם aldicarb ו פרדיגמות PTZ החשיפה C. elegans עשוי להאיץ את הבנתנו עצבית. יתר על כן, קטעי וידאו המדגים כיצד אנו מבצעים מבחני תרופתי צריך להקים שיטות עקבית למחקר C. elegans.
Protocol
Aldicarb פרדיגמה חשיפה
- ביום הראשון, להבטיח כי לפחות שלושים צעירים בשלב הבוגר של תולעים גנוטיפ של לשכפל כל אחד יהיה זמין עבור מבחני aldicarb ביום השני. זה הכי טוב אם הנסיין בוחר חמישים או יותר תולעים בשלב L4 לצלחות NGM טרי (הכי טוב בלי nystatin), אשר מכילים E. coli (רצוי OP50) כמקור מזון, לגדל אותם במשך 12-24 שעות בטמפרטורת עקבית מתירני (20 ° C עד 22 ° C היא הטובה ביותר, למרות 25 מעלות זה בסדר).
- ביום השני, לעשות 100 מניות mM פתרון של aldicarb עם אתנול 70% (EtOH) ו -30% DDH 2 O. מורחים את הכמות המתאימה של aldicarb לצלחות NGM מינוס nystatin עם כמויות מוגדרות כדי להשיג את הריכוזים aldicarb הרצוי. אנחנו באופן עקבי להשתמש 0.5 aldicarb mM על ידי ציפוי 37.5 μL aldicarb של 100 מ"מ על גבי צלחות 7.5 מ"ל NGM. אפשר צלחות aldicarb להתייבש במשך כ 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. אין צורך לפצח את העפעפיים. לחלופין, aldicarb ניתן להוסיף NGM ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע.
- לאחר כרכים, צלחת ייבוש עקבית של E. coli (רצוי OP50) על גבי במרכז כל צלחת aldicarb ויבש למשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. אנחנו באופן עקבי צלחת 25 μL של OP50, אשר יוצרת הדשא מזון בגודל מספיק כדי לשמור על תולעים מרוכז במקום קטן בלי הצפיפות.
- כאשר הדשא מזון יבש, אפשר להמשיך עם מבחני aldicarb. בשל האופי הסובייקטיבי של מבחני aldicarb, מומלץ מאוד כי הניסויים יבוצעו "בצורה עיוורת". עמיתו של הניסוי הראשוני יכול מחדש התווית המקורית צלחות עם תולעים להיות assayed. כמו כן, העמית יכול להעביר תולעים מהצלחות המקורי צלחות aldicarb מוצפנת מיד לפני תחילת טיימר. אם הנסיין צופה assaying זן מסוים של תולעים עם פנוטיפ אופייני, כגון uncoordination, אז חייב להיות גם שליטה עם פנוטיפ דומה כדי לצמצם הטיות. יתר על כן, עדיף אם הנסיין מבחני זן wild-type, כמו גם זן עמיד זן רגיש, במקביל כדי לסייע לתקנן ניסויים. הנסיין צריך לשאוף לנתח מספר עקבית של תולעים עבור לשכפל כל אחד. אנחנו באופן עקבי לנתח thirty תולעים של גנוטיפ אחד עבור כל לשכפל. אנחנו גם לבצע לפחות שלוש משכפל עבור כל ניסוי. הנסיין מנוסה אמור להיות מסוגל לנתח לפחות ששה זנים בכל פעם.
- ספירת תולעים משותק על ידי דרבון באופן עקבי כל תולעת עם חוט פלטינה. אנחנו באופן עקבי לדרבן תולעים שלנו פעמיים על הראש ופעמיים על הזנב כל 30 דקות עבור סכום כולל של שלוש שעות. הפסקת השאיבה בלוע עשוי לשמש גם כדי להגדיר שיתוק, אבל רק אם הנסיין מעסיקה הגדרה עקבית של שיתוק על כל מבחני. כמו כן, ראוי לציין כי חלק תולעים, במיוחד אלה עמידים aldicarb, עשויים לנסות לזחול מעל צלחת. במקרה זה, הניסוי עלול להתפשט כמות קבועה של חומצה פלמיטית, מכשול פיזי כדי תנועה תולעת, סביב צלחות aldicarb. פרשנו 25 μL של 10 מ"ג חומצה פלמיטית / mL EtOH.
PTZ פרדיגמה חשיפה
- ביום הראשון, להבטיח כי לפחות שלושים צעירים בשלב הבוגר של תולעים גנוטיפ של לשכפל כל אחד יהיה זמין עבור מבחני PTZ ביום השני. זה הכי טוב אם הנסיין בוחר חמישים או יותר תולעים בשלב L4 לצלחות NGM טרי (הכי טוב בלי nystatin), אשר מכילים E. coli (רצוי OP50) כמקור מזון, לגדל אותם במשך 12-24 שעות בטמפרטורת עקבית מתירני (20 ° C עד 22 ° C היא הטובה ביותר, למרות 25 מעלות זה בסדר).
- ביום השני, ליצור 0.5 גרם PTZ / mL DDH פתרון 2 O המניות של PTZ. מורחים את הכמות המתאימה של PTZ על NGM מינוס צלחות nystatin עם כמויות מוגדרות כדי להשיג את בריכוזים PTZ הרצוי. כי אנחנו מעדיפים מנה תגובה עבור מבחני PTZ, אנו צלחת כמויות משתנות של PTZ על צלחות 7.5 מ"ל NGM. לדוגמה, אחד עשוי צלחת 37.5 μL הפתרון מניות PTZ לצלחת mL 7.5 NGM לעשות PTZ 5 מ"ג / מ"ל פתרון. אפשר צלחות PTZ להתייבש במשך כ 60-120 דקות בטמפרטורת החדר. אין צורך לפצח את העפעפיים. לחילופין, ניתן להוסיף PTZ ישירות NGM, אך יש להשתמש מיד לאחר לחיזוק עבור מבחני. יציבות PTZ היא הרבה פחות מזה של aldicarb. לכן, מבחני עם מבוגרים צלחות PTZ מהימנים פחות. PTZ צריך להיות מאוחסן ב -20 מעלות ייבוש עם סוכן ייבוש לפני השימוש. אנחנו מעדיפים להתעלם PTZ כחודשיים לאחר הפתיחה כדי להבטיח יציבות.
- לאחר כרכים, צלחת ייבוש עקבית של E. coli (רצוי OP50)על גבי במרכז כל צלחת PTZ ויבש עוד 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. אנחנו באופן עקבי צלחת 25 μL של OP50, אשר יוצרת הדשא מזון בגודל מספיק כדי לשמור על תולעים מרוכז במקום קטן בלי הצפיפות.
- כאשר הדשא מזון יבש, אפשר להמשיך עם מבחני PTZ. למרות מבחני PTZ הן סובייקטיביות פחות מבחני aldicarb, הוא עדיין מומלץ מאוד לבצע ניסויים "באופן עיוור". עמיתו של הניסוי הראשוני יכול מחדש התווית המקורית צלחות עם תולעים להיות assayed. כמו כן, העמית יכול להעביר תולעים מהצלחות המקורי צלחות PTZ מוצפנת מיד לפני תחילת טיימר. אם הנסיין צופה assaying זן מסוים של תולעים עם פנוטיפ אופייני, כגון uncoordination, אז חייב להיות גם שליטה עם פנוטיפ דומה כדי לצמצם הטיות. יתר על כן, עדיף אם הנסיין מבחני זן wild-type, כמו גם זנים עם גוף מלא עוויתות קדמית או, במקביל כדי לסייע לתקנן ניסויים. הנסיין צריך לשאוף לנתח מספר עקבית של תולעים עבור לשכפל כל אחד. אנחנו באופן עקבי לנתח thirty תולעים של גנוטיפ אחד עבור כל לשכפל. אנחנו גם לבצע לפחות שלוש משכפל עבור כל ניסוי. הנסיין מנוסה אמור להיות מסוגל לנתח לפחות שלושה זנים בכל פעם. עם זאת, התדירות והעוצמה של PTZ-Induced עוויתות השיא בדרך כלל בין 15-30 דקות של חשיפה, ולאחר מכן להחליש כמו תולעים להיות משותק או, במקרים מסוימים, להסתגל לתרופה.
- ספירת "דמויי אפילפסיה" עוויתות תולעים כל 30 דקות עבור סכום כולל של שעה אחת. זה הכי טוב כדי להבקיע את מספר תולעים עם עוויתות הקדמי, שאנו מכנים "הראש מיטלטל", בנפרד במספר תולעים עם גוף מלא, עוויתות, שיתוק גוף מלא, שאנו מכנים "טוניק", או שילוב של עוויתות קדמית עם שיתוק BWM, שאנו מכנים "טוניק-clonic". רוב התולעים של גנוטיפ אחד התערוכה רק סוג אחד של פרכוס. עם זאת, טוניק-clonic תולעים לעתים קרובות להיות טוניק לחלוטין, ולכן יש להמשיך את assay בעבר 30 דקות, גם אם כל התולעים הפגינו כבר עוויתות. כמו כן, ראוי לציין כי תולעים מסוימים עשויים לנסות לזחול מעל צלחת. במקרה זה, הניסוי עלול להתפשט כמות קבועה של חומצה פלמיטית סביב צלחות PTZ. פרשנו 25 μL של 10 מ"ג חומצה פלמיטית / mL EtOH.
תגובות התנהגותיות של מוטאנטים C. elegans נבחרים הילוכים Synaptic כדי Aldicarb ו PTZ
| Mutant שם | Synaptic תפקיד | התנהגות ללא תרופות | תגובה התנהגותית כדי Aldicarb (בהשוואה ל wild-type N2) | תגובה התנהגותית כדי PTZ |
|---|---|---|---|---|
| tom-1 (ok188) | מעכב הולכה סינפטית | ללא תיאום | שיעור משופרת של שיתוק | נבדל wild-type |
| UNC-43 (n498n1186) | מורכב | ללא תיאום | שיעור משופרת של שיתוק | גוף מלא עוויתות |
| UNC-25 (e156) | מקדם תמסורת GABA | ללא תיאום | שיעור משופרת של שיתוק | עוויתות הקדמי, גוף מלא שיתוק |
| snb-1 (md247) | מקדם ההולכה הסינפטית | ללא תיאום | שיעור מופחת של שיתוק | קדמית עוויתות |
| UNC-4 (E120) | מקדם תמסורת ACH | ללא תיאום | שיעור מופחת של שיתוק | נבדל wild-type |
שני ממריצים עצבית, מעכב acetylcholinesterase, שנקרא aldicarb, וכן אנטגוניסט לרצפטור GABA, שנקרא pentylenetetrazole (PTZ), ניתן להשתמש באופן משלים לאפיין C. elegans מוטנטים בשידור סינפטי. אצטילכולין מעוררים עודף (ACH) מצטבר בגוף התולעת קיר neuromuscular צמתים (NMJs) מן המוטציות המזיקות של הרגולטורים שלילית של אח השידור (למשל tom-1 ו-UNC-43) או רגולטורים חיוביים של השידור GABA מעכבות (למשל, UNC-25). לעומת זאת, מעוררים רמות אח בבית NMJs תולעת הם פחתה על ידי מוטציות מזיקות ב הרגולטורים חיובי של שידור הסינפטי כללי (למשל, snb-1) או אח העברת גנים ספציפיים (למשל UNC-4). כאשר בהשוואה ל wild-type תולעים N2, תולעים מוטציה עם שידור גבוהות אח מעוררים ב NMJs התערוכה שיעורי מוגברת של שיתוק aldicarb-Induced, ואילו תולעים מוטציה עם הילוכים הוריד אח מעוררים להפגין מוזלים של שיתוק aldicarb-Induced. למרות PTZ משבש בתיאום עצבי ב C. elegans קיר השרירים בגוף, שלא כמו aldicarb, PTZ גם מהופך GABA מעכבות ב C. elegans שרירי הראש. כתוצאה מכך, הרגישות aldicarb לא יכול לחזות במדויק את הרגישות PTZ. תולעים Mutant עם פגמים ספציפיים regul חיובית או שליליתation של שידור אח הם נבדלים מן wild-type תולעים N2 בנוכחות PTZ, ואילו תולעים מוטציה עם ליקויים בוויסות החיובי של שידור הסינפטי כללית או פגמים ספציפיים בתערוכה מעכבות השידור GABA חזקים PTZ-Induced עוויתות הקדמי. יתר על כן, UNC-43-הפסד של פונקציה מוטנטים להציג גוף מלא עוויתות בנוכחות PTZ וסביר יש הפרעות בשידור סינפטי נוספים, אשר תורמים התגובות הייחודי שלהם לסמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקולים נוכחי לחשיפה aldicarb עם C. elegans אינם מאפשרים להבחין בין הנסיינים מוטנטים עם גירעונות ספציפיים שידור ACH ו מוטנטים עם גירעונות כללית בשידור סינפטי, כמו גם סוגים של מוטציות התערוכה התנגדות aldicarb. כמו כן, aldicarb לא ניתן להשתמש כדי לקבוע אם יש גירעונות מוטנטים ספציפיים השידור GABA או כשלים להכליל שלילי להסדיר אח השידור, כמו גם סוגים של מוטציות מפגינים רגישות יתר aldicarb. תוצאות מבחני PTZ החשיפה שלנו, בשילוב עם תוצאות מבחני aldicarb חשיפה, מאפשר לחוקרים לאפיין טוב יותר מוטציות בשידור סינפטי.
סי אלגנס מוטנטים בשידור סינפטי ניתן לסווג בצורה ישירה על ידי aldicarb משלימה פרדיגמות PTZ חשיפה. מוטנטים עמידים Aldicarb עם PTZ-Induced עוויתות הקדמי צפויים לקוי בתפקוד סינפטי בכלל. לעומת זאת, מוטנטים עמידים aldicarb ללא PTZ-Induced עוויתות הקדמי צפויים לקוי במיוחד אח השידור. מוטאנטים עם aldicarb רגישות יתר, אשר אינם מציגים PTZ-Induced עוויתות הקדמי, צפוי להיכשל שלילי להסדיר העברת אח. לבסוף, מוטציות aldicarb עם רגישות יתר, אשר עושים PTZ-Induced התערוכה עוויתות הקדמי, הם GABA סביר לקוי.
כלי השירות של חשיפה aldicarb הוא נחלש גם הסובייקטיביות שלה, כמו הנסיינים שונה לעיתים קרובות יש הגדרות שונות של שיתוק. טכניקת הניסוי של יחיד יכול גם להשתנות. תולעים כמו כן, aldicarb חשוף לנוע בצורה שונה בתגובה כוחות מגוונים של דרבון. ההבחנה בין תולעת משותקת תולעת תגובה יכול להיות עדין כמו ראש קלה או עווית הזנב. בנוסף המשלימה מבחני aldicarb לאפיון טוב יותר של ג מוטנטים elegans בשידור סינפטי, PTZ עשוי לשמש גם כדי לבודד מוטנטים בשידור סינפטי, במיוחד אלו עם מוטציות רגישות יתר aldicarb. הניסויים, אשר מנצלים את החשיפה PTZ, יכול פשוט לחפש עוויתות הקדמי, במקום הבדלים דקים שיתוק aldicarb-Induced.>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו רוצים להכיר את רוח שיתוף פעולה של כל חברי המעבדה קולדוול. פרס אוקונור בזיל המלומד מן מצעד הפרוטות ואת פרס הקריירה מן הקרן הלאומית למדע כדי GAC, וכן מחקר לתואר ראשון במדעי תוכנית גרנט מן הווארד יוז רפואי במכון של אוניברסיטת אלבמה, לממן רגישות עצבית ו אפילפסיה מחקר מעבדה קולדוול.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma-Aldrich | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
