Summary
이 동영상은 선충류, C. 엘레간스의 신경 기능을 연구 보완 방법의 두 신경 자극, aldicarb 및 pentylenetetrazole (PTZ)을 고용하는 방법을 보여줍니다. 이 상호 보완적인 접근 방법은 또한 modulating의 연결 synchrony에 대한 evolutionarily 보존 메커니즘에 대해 설명해 주실 사용 간질과 발작에 대한 의미를 가지고있을 수 있습니다.
Abstract
선충류, Caenorhabditis의 엘레간스는 neurotransmission 공부를위한 편법 모델이되었다. 의 신경 계통의 해부와 연결이 전자 micrographs의 결정 및 약리 assays에 의해 정제되어로서 C. 엘레간스은 동물 모델 중 유일하다. 이 비디오에서는, 우리는 특별히 C. 엘레간스 신경근육학 분기점에서 신호 특성화 pentylenetetrazole (PTZ)라는 두 개의 상호 보완적인 신경 자극, aldicarb라는 acetylcholinesterase 억제제, 그리고 감마 aminobutyric 산 (GABA) 수용체 길항제가, 직업을 가지고있을 방법에 대해 설명합니다 (NMJs)과 대립 신경 회로의 우리의 이해를 용이하게합니다.
302 C. 엘레간스 뉴런, 열아홉 GABAergic D - 타입 모터 뉴런 신경을 분포시키다 바디 벽의 근육 (BWMs)의 동안 RMEs라는 네 GABAergic 뉴런, 신경을 분포시키다 머리 근육. 반대로, 서른아홉 모터 신경은 아세틸콜린을 흥분성의 신경 전달 물질을 표현 (ACH), 그리고 운동을 조정할 수 BWMs에서 GABA 전송을 반대. 바디 벽 NMJs에서 GABAergic 및 cholinergic 모터 뉴런의 대립 자연을 처음 레이저 절제에 의해 결정하고 나중에 aldicarb 노출에 의해 buttressed했다. 야생 형 웜의 시간 코스 또는 선량 - 반응 마비의 급성 aldicarb 노출 결과. 적은 ACH가 웜 NMJs에 축적으로하지만, 흥분성의 ACH 전송의 손실이 BWMs 적은 자극에 이르는, aldicarb에 대한 저항력을 수여. aldicarb에 저항이 ACH 특정 또는 일반 시냅스 기능 돌연변이로 관찰 수 있습니다. 대립 GABA와 ACH 전송, GABA 전송의 손실, 또는 부정적인 ACH 릴리스를 조절 실패와 일치, aldicarb에 과민성을 수여. aldicarb 노출이 neurotransmission의 유전자 수많은 웜 homologs의 고립을 주도하고 있지만, aldicarb 노출 혼자 효율적으로 특정 C. 엘레간스 모터 뉴런의 유전자 및 경로에 대한 일반적인 역할을 확인할 수 없습니다. 이러한 목적을 위해, 우리는 PTZ를 사용하는 보완 실험 방법을 도입했습니다.
Neurotransmission의 돌연변이 PTZ에 대한 응답으로 aldicarb 유발 마비와는 분명 phenotypes을, 표시됩니다. 야생 형 웜뿐만 아니라, ACH를 해제받을 특정 inabilities과 돌연변이, PTZ에 명백한 감도를 표시하지 않습니다. 그러나, GABA의 돌연변이뿐만 아니라, 일반적인 신경 기능 돌연변이 시간 코스 또는 선량 - 반응 방식으로 앞쪽에 경련을 표시합니다. 부정적인 일반적인 신경 전달 물질 방출을 규제하고, 따라서 수없는 돌연변이 PTZ에 마비되고, BWMs에 ACH의 과도한 금액을 분비. 이산 돌연변이 클래스의 PTZ - 유발 phenotypes는 aldicarb과 C. 엘레간스에서 PTZ 노출 패러다임과 상호 보완적인 접근 방식이 neurotransmission 우리의 이해를 촉진 수 있음을 나타냅니다. 또한, 우리는 약리 assays을 수행하는 방법을 보여주는 동영상은 C. 엘레간스 연구 일관된 방법을 확립해야합니다.
Protocol
Aldicarb 노출 패러다임
- 첫날, 각 유전자형의 각 복제의 적어도 30 젊은 성인 단계 웜은 두 번째 하루에 aldicarb assays에 대해 사용할 수 있는지 확인하십시오. 실험자들이 E.를 포함하는 신선한 NGM 플레이트에 오십 이상 L4 무대 웜을 (최고 nystatin 제외), 선택한다면 그것은 최고 식품 소스로 대장균 (선호 OP50), 그리고 일관성 있고 허용 온도 (20 ° 22 ° C 25 ° C 괜찮 있지만 C는 최고입니다.)에서 12-24시간 그들을 성장
- 두 번째 날, 70 % 에탄올 (EtOH) 30 % ddH 2 O.과 aldicarb의 100 MM 주식 솔루션을 원하는 aldicarb의 농도를 달성하기 위해 정의된 볼륨 NGM 마이너스 nystatin 접시에 aldicarb의 해당 금액을 확산. 우리는 지속적으로 7.5 ML의 NGM 플레이트에 도금 100 MM의 aldicarb의 37.5 μL를 0.5 MM의 aldicarb를 사용합니다. aldicarb 플레이트는 실온에서 약 30~60분에 대한 건조하실 수 있습니다. 그것은 피부를 깰 필요는 없습니다. 또는 aldicarb은 NGM에 추가하고 4 ° C 일주일 동안 저장할 수 있습니다.
- E.의 건조, 접시 일관성있는 볼륨 후 각 aldicarb 판의 중심과 실온에서 다른 30-60분에 대한 건조에 대장균 (선호 OP50). 인구 과잉없이 작은 자리에 집중 벌레를 유지하기 위해 충분히 크기의 음식 론을 만들어 우리는 지속적으로 판 OP50 25 μL를.
- 음식 잔디가 건조되면, 하나는 aldicarb의 assays 진행됩니다. aldicarb의 assays의 주관적 특성으로 인해, 그것은 매우 실험은 "맹목적으로"수행하는 것이 좋습니다. 기본 실험자의 동료 assayed 수 벌레와 함께 원래의 접시를 다시 레이블 수 있습니다. 마찬가지로, 동료는 타이머를 시작하기 전에 즉시 원래의 접시에서 계산된 aldicarb 플레이트로 웜을 전송 수 있습니다. 실험자 이러한 uncoordination 같은 특성 표현형와 벌레의 특정 긴장을 시금 예상한다면, 역시 편견을 줄이기 위해 유사한 표현형있는 컨트롤이 있어야합니다. 또한 실험자들이 assays 실험을 표준화 도움이 병렬로 야생 형 변형뿐만 아니라 저항 변형과 지나치게 긴장을하면 좋습니다. 실험자는 각 복제에 대한 웜의 일관된 번호를 분석하기 위해 노력한다. 우리는 지속적으로 각 복제에 대한 단일 유전자형 서른 벌레를 분석할 수 있습니다. 우리는 또한 적어도 세를 수행하면 각 실험에 대한 복제. 경험 실험자 한 번에 최소 6 계통을 분석 할 수 있어야합니다.
- 백금 와이어 각 벌레 일관된 방식으로 괴롭히는 의해 마비 벌레의 수를 계산합니다. 우리는 지속적으로 두 번 머리에 두 번 꼬리 3 시간 총 30 분 간격에 우리의 벌레를 찌르다. pharyngeal 펌프의 정지 또한 실험자 모든 assays 이상 마비의 일관된 정의를 고용하는 경우에만 마비를 정의하는 데 사용하지만 수 있습니다. 또한, 특히 일부 웜, aldicarb에 강한하는 사람이 접시를 크롤 링을 시도할 수 있습니다 협조할 것입니다. 이 경우에는 실험자의 aldicarb 접시 주위에, 팔미트산, 웜 운동에 대한 물리적 장벽의 일관된 금액을 확산 수 있습니다. 우린 10 MG 팔미트산 / ML EtOH 25 μL를 확산.
PTZ 노출 패러다임
- 첫날, 각 유전자형의 각 복제의 적어도 30 젊은 성인 단계 웜은 두 번째 날에 PTZ의 assays에 대해 사용할 수 있는지 확인하십시오. 실험자들이 E.를 포함하는 신선한 NGM 플레이트에 오십 이상 L4 무대 웜을 (최고 nystatin 제외), 선택한다면 그것은 최고 식품 소스로 대장균 (선호 OP50), 그리고 일관성 있고 허용 온도 (20 ° 22 ° C 25 ° C 괜찮 있지만 C는 최고입니다.)에서 12-24시간 그들을 성장
- 둘째 날에는, PTZ의 0.5 g PTZ / ML ddH 2 O 주식 솔루션을합니다. 원하는 PTZ의 농도를 달성하기 위해 NGM 마이너스 정의된 볼륨 nystatin 플레이트에 PTZ의 해당 금액을 확산. 우리가 PTZ에 대한 선량 - 반응 assays을 선호하기 때문에, 우리는 플레이트 7.5 ML의 NGM 플레이트에 PTZ의 양의 변화. 예를 들어, 한 접시 7.5 ML의 NGM 판에 PTZ 주식 솔루션의 37.5 μL 수 있습니다 5 MG PTZ / ML 솔루션을 만들 수 있습니다. PTZ 플레이트는 실온에서 약 60~1백20분에 대한 건조하실 수 있습니다. 그것은 피부를 깰 필요는 없습니다. 또는, PTZ는 NGM에 직접 추가할 수 있지만, 그것은 바로 응고 후 assays 사용해야합니다. PTZ의 안정성 aldicarb보다 훨씬 적습니다. 따라서, 기존의 PTZ 번호판과 assays 덜 믿을 수 있습니다. PTZ는 사용하기 전에 건조 에이전트와 건조기에서 -20 ° C에서 저장해야합니다. 우리는 안정성을 보장하기 위해 여는 후 약 이개월 PTZ을 삭제하는 것을 선호합니다.
- E.의 건조, 접시 일관성있는 볼륨 후 대장균 (선호 OP50)각 PTZ 플레이트와 실온에서 다른 30-60분에 대한 건조의 중심지로. 인구 과잉없이 작은 자리에 집중 벌레를 유지하기 위해 충분히 크기의 음식 론을 만들어 우리는 지속적으로 판 OP50 25 μL를.
- 음식 잔디가 건조되면, 하나는 PTZ의 assays 진행됩니다. PTZ의 assays가 aldicarb의 assays보다 주관적이지만, 그것은 여전히 매우 실험은 "맹목적으로"수행하는 것이 좋습니다. 기본 실험자의 동료 assayed 수 벌레와 함께 원래의 접시를 다시 레이블 수 있습니다. 마찬가지로, 동료는 타이머를 시작하기 전에 즉시 원래의 접시에서 계산된 PTZ 플레이트로 웜을 전송 수 있습니다. 실험자 이러한 uncoordination 같은 특성 표현형와 벌레의 특정 긴장을 시금 예상한다면, 역시 편견을 줄이기 위해 유사한 표현형있는 컨트롤이 있어야합니다. 또한, 그것은 실험자들이 assays 실험을 표준화 도움이 병렬로 앞쪽에 또는 전신 경련과 야생 타입 변형뿐만 아니라 종자를하면 좋습니다. 실험자는 각 복제에 대한 웜의 일관된 번호를 분석하기 위해 노력한다. 우리는 지속적으로 각 복제에 대한 단일 유전자형 서른 벌레를 분석할 수 있습니다. 우리는 또한 적어도 세를 수행하면 각 실험에 대한 복제. 경험 실험자 한 번에 적어도 세 계통을 분석 할 수 있어야합니다. 벌레가 약물에 적응을 마비되거나, 어떤 경우에, 아직은, 다음 PTZ - 유도된 노출 15-30분 사이에 일반적으로 정상 경련, 그리고 빈도와 강도가 감쇠.
- 1 시간 총 "간질 같은"벌레를 경련을 30 분 간격의 개수를 계산합니다. 그것은 전신 경련, 전신 마비, 우리는 "토닉"전화 또는 조합 벌레의 수를 별도로, 우리는 "머리 밥스"이라고 앞쪽에 경련과 벌레의 수를 점수하는 것이 가장 좋은 방법입니다 우리가 "토닉 - clonic"이라고 BWM 마비와 앞쪽에 경련. 단일 유전자형 대부분의 벌레는 경련의 한 종류를 나타냅니다. 그러나, 토닉 - clonic 벌레들은 종종 완전히 토닉되기 때문에 모든 벌레가 이미 경련을 출품 경우에도 한 30 분 지난 분석을 계속해야합니다. 또한, 일부 웜은 접시를 크롤 링을 시도할 수 있습니다 협조할 것입니다. 이 경우에는 실험자의 PTZ 플레이트 주변 팔미트산의 일관된 금액을 확산 수 있습니다. 우린 10 MG 팔미트산 / ML EtOH 25 μL를 확산.
Aldicarb 및 PTZ 선정 C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 행동 응답
| 돌연변이 이름 | 시냅스 역할 | 약물없는 행동 | Aldicarb하는 행동 응답 (야생 형에 비해 N2) | PTZ하는 행동 응답 |
|---|---|---|---|---|
| 톰 - 1 (ok188) | 시냅스 전달을 억제 | uncoordinated | 마비의 향상된 속도 | 야생 형에서 분간 |
| UNC - 43 (n498n1186) | 복잡한 | uncoordinated | 마비의 향상된 속도 | 전신 경련 |
| UNC - 25 (e156) | GABA 전송을 촉진 | uncoordinated | 마비의 향상된 속도 | 앞쪽에 경련, 전신 마비 |
| snb - 1 (md247) | 시냅스 전송을 추진 | uncoordinated | 마비의 감소 속도 | 앞쪽에 경련 |
| UNC - 4 (e120) | ACH 전송을 추진 | uncoordinated | 마비의 감소 속도 | 야생 형에서 분간 |
pentylenetetrazole (PTZ)라는 두 개의 신경 자극, aldicarb라는 acetylcholinesterase 억제제, 그리고 GABA 수용체 길항제는, C. 엘레간스 시냅스 전송 돌연변이를 특성화 보완 방식으로 사용할 수 있습니다. 초과 흥분성의 아세틸콜린 (ACH)는 ACH 전송의 부정적인 규제에 해로운 돌연변이에서 웜 몸을 벽 신경근육학 분기점 (NMJs)에 축적 (예 : 톰 - 1과 UNC - 43) 또는 억제 GABA 전송 (예, UNC - 25)의 긍정적인 규제. 반대로, 웜 NMJs에서 흥분성의 ACH 수준은 일반적인 시냅스 전송 (예 : snb - 1) 또는 ACH 특정 전송 유전자 (예 : UNC - 4)의 긍정적인 규제에 해로운 돌연변이에 의해 감소됩니다. 인하 흥분성의 ACH 전송과 돌연변이 웜은 aldicarb 유발 마비의 감소 속도를 보여주는 반면에 야생 형 N2 벌레에 비해, NMJs에서 고가 흥분성의 ACH 전송과 돌연변이 벌레는 aldicarb 유발 마비의 향상된 속도를 나타냅니다. PTZ가 aldicarb 달리 C. 엘레간스 신체 벽 근육에의 연결을 synchrony하지 방해 있지만, PTZ는 C. 엘레간스 헤드 근육에서 억제 GABA를 antagonizes. 결과적으로, aldicarb 감도 정확하게 PTZ 민감도를 예측할 수 없습니다. 부정적 또는 긍정적인 regul의 특정 결함 돌연변이 웜ACH 전송 에이션은 PTZ의 존재에 야생 형 N2 벌레에서 구별할 수 있으며, 억제 GABA 전송 전시 강력한 PTZ - 유발 앞쪽에 경련 일반적으로 시냅스 전송 또는 특정 결함 긍정적인 규정에 결함 돌연변이 벌레 반면. 또한, UNC - 43 손실 기능 돌연변이 PTZ의 존재에 전신 경련을 표시하고 가능성이 독특한 약물 반응에 기여하는 추가적인 시냅스 전달 이상을 보유하고 있습니다.
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Discussion
C.와 aldicarb 노출에 대한 현재 프로토콜 엘레간스는 돌연변이의 두 클래스가 aldicarb에 대한 저항력을 전시 같은 경험은 시냅스 전달의 일반적인 적자와 ACH 전송 및 돌연변이의 구체적인 결손과 돌연변이 사이의 구분을 허용하지 않습니다. 마찬가지로, aldicarb는 돌연변이의 두 클래스가 aldicarb에 과민성을 전시 등 돌연변이 부정적인 ACH 전송을 규제하는 GABA 전송 또는 일반 장애에서 특정 적자가 있는지 확인하는 데 사용할 수 없습니다. 우리 PTZ 노출 assays, aldicarb 노출 assays의 결과와 함께,에서 결과는 연구자 더 신경 전달 돌연변이를 특성을 수 있습니다.
C. 엘레간스 시냅스 전송 돌연변이 보완 aldicarb 및 PTZ 노출 패러다임에 의해 직접적인 방식으로 분류됩니다. PTZ 유도 앞쪽에 경련과 Aldicarb 방지 돌연변이 일반적인 시냅스 기능에 가능성이 부족한 있습니다. 반대로, PTZ - 유발 앞쪽에 경련없이 aldicarb 방지 돌연변이 ACH 전송의 가능성이 구체적으로 부족한 있습니다. PTZ 유도 앞쪽에 경련을 전시하지 aldicarb 과민성과 돌연변이 가능성이 부정 ACH 전송을 규제하기 위해 실패합니다. 마지막으로, 전시 PTZ - 유발 앞쪽에 경련을 aldicarb 과민성과 돌연변이, 결함 가능성 GABA 수 있습니다.
aldicarb 노출의 유틸리티는 또한 다른 경험은 종종 마비의 정의를 다양한 것처럼, 그 주관에 의해 약화됩니다. 한 실험자의 기술은 수시로 바뀔 수 있습니다. 또한, aldicarb 노출 웜은 괴롭히는의 다양한 세력에 대응 다르게 이동합니다. 마비 웜 및 웜 반응 사이의 구분은 약간의 머리 또는 꼬리 트위치처럼 미묘 수 있습니다. C.보다 특성화를위한 aldicarb assays을 보완하는 것 외에도 엘레간스 시냅스 전송 돌연변이, PTZ도 aldicarb에 과민성 특히 시냅스 전송 돌연변이, 돌연변이들을 격리하는 데 사용할 수 있습니다. PTZ 노출을 활용 경험은 단순히 대신 aldicarb 유발 마비의 미묘한 차이의 앞쪽에 경련에 대해 볼 수 있습니다.>
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Acknowledgments
우리 모두는 콜드 웰 연구소 회원의 협력 정신을 인정하고 싶습니다. 천의 월, 국립 과학 재단에서 GAC에 직업 상부터 바질 오코너 학술 상뿐만 아니라, 하워드 휴즈 의학 연구소에서 앨러배마 대학 학사 연구 과학 프로그램 그랜트의 연결을 흥분과이 자금이 콜드웰 연구소의 간질 연구.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma-Aldrich | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
