Summary
Este é um protocolo que descreve como isolar e cultura primária de neurônios simpáticos gânglios cervical superior (GCS) de filhotes de rato recém-nascido.
Abstract
Os gânglios cervical superior (GCS) de ratos são pequenos, brilhantes, em forma de amêndoa estruturas que contêm neurônios simpáticos. Esses neurônios fornecem inervação simpática para a cabeça e pescoço e constituem uma população bem caracterizados e relativamente homogêneo (4). Neurônios simpáticos são dependentes de fator de crescimento neural (NGF) para a diferenciação, sobrevivência e crescimento axonal ea propagação de grande disponibilidade de NGF facilita sua cultura e manipulação experimental (2, 3, 6). Por estas razões, cultivadas neurônios simpáticos têm sido utilizadas em uma ampla variedade de estudos, incluindo o desenvolvimento neuronal e diferenciação, os mecanismos de morte celular programada e patológicos, e transdução de sinal (1, 2, 5 e 6). Dissecando o SCG de ratos recém-nascidos e neurônios simpáticos cultura não é muito complicado e pode ser dominada com bastante rapidez. Neste artigo, iremos descrever em detalhes como dissecar o SCG de filhotes de rato recém-nascido e para usá-los para estabelecer culturas de neurônios simpáticos. O artigo também descreve as etapas preparatórias e os vários reagentes e equipamentos que são necessários para alcançar este objectivo.
Protocol
1. Preparação para a dissecação:
- Selecione o prato de cultura apropriado (10 cm ou placas de seis poços ou 24 poços, etc), dependendo da natureza de suas experiências, e revesti-los com rat tail-colágeno 24 horas antes da dissecção. Os métodos para a preparação de rato-cauda de colágeno e usá-lo para placas de cultura de revestimento têm sido descritos em outra parte (1).
- Prepare uma solução de tripsina 0,25% em tampão fosfato salino (PBS) (sem EDTA) e filtro de esterilizar. Prepare um alíquotas ml e armazenar a -20 º C.
- Prepare uma solução contendo 2,5 mM de cada Uridina e 5-FDU em água destilada / deionizada H 2 O. Filtro de esterilizar e preparar 50 mL alíquotas. Armazenar a -20 º C.
- Prepare Médio Completo: meio de cultura RPMI 1640 com inativado pelo calor de 10% soro de cavalo (calor inativar incubando em banho-maria 56 º C por 30 minutos) e 5% de soro fetal bovino.
- Prepare Médio Final: meio de cultura RPMI 1640 com inativado pelo calor 1% soro de cavalo + NGF (100ηg/ml concentração final) + penicilina / estreptomicina (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU solução (10 mM de concentração final) . Nota: este meio deve ser composto fresco antes de usar o tempo todo. Para um experimento em um formato de placa de 24 cavidades, a pessoa precisa preparar 12 ml deste meio. É recomendado que você prepare um pouco mais. NGF pode ser comprado de uma variedade de fontes comerciais (ver tabela no final deste protocolo).
- Equipamento: Um vai precisar de um microscópio de dissecação e fonte de luz. Um iluminador de fibra óptica dupla gooseneck com dicas foco é o preferido. Além disso, teremos de limpar e esterilizar (em autoclave ou imersão em etanol 70% por pelo menos 20 minutos) as ferramentas de dissecção seguinte: dois pares de micro-dissecção pinças de aço inoxidável, e um par de tesouras de dissecação (também de aço inoxidável e tanto do Roboz). Duas agulhas de seringa estéril (26 gague x 1 ½ polegadas ou similar) também será necessário. É necessário criar um quadro de dissecção, que é um pedaço 3 "x3" de isopor embrulhado em papel de alumínio e coberto com uma Kimwipe. Pulverizar a placa com álcool 70% para descontaminar. Finalmente, prepare um fogo-polido pipeta de vidro de pastagem. , A fim de-fogo polonês, tome a pipeta de vidro e manter a ponta na chama por alguns segundos, enquanto gira. Após a inspeção, a ponta ficará mais suave ea abertura será mais estreito. Isso é necessário para a etapa onde as células serão dissociados. Executar fogo polimento em uma capa de cultura de células para que permanece a pipeta estéril.
2. Dissecção da Gânglios Cervical Superior:
- Coletar filhotes de rato recém-nascidos que estão em idade de P0 ou P1.
- Rapidamente limpar o filhote para dissecação com etanol 70% para reduzir as chances de contaminação.
- Rapidamente decapitar filhote com uma tesoura afiada (este passo não será mostrado no vídeo). Segure a cabeça, usando uma pinça estéril contra gaze esterilizada brevemente drenar o excesso de sangue.
- Colocar a cabeça na almofada dissecção com o lado ventral para cima ea extremidade caudal orientada para você. A traquéia cortada deve ser facilmente visível. Use as agulhas de seringa estéril para proteger a cabeça cortada para o bloco de dissecação da seguinte forma: empurre um pino que o céu da boca no teclado e empurre o segundo pino que a traquéia cortada no teclado. Coloque a almofada sob o microscópio de dissecação e começar a dissecção.
- Utilizando ambas as pinças (uma em cada mão), pele clara distância e gordura ao redor da traquéia, tomando cuidado para não ir muito fundo. Fazendo isso irá expor um par de músculos praticamente paralelos entre si em ambos os lados da traquéia. Nota: durante a dissecção, você vai precisar para irrigar com o frio PBS estéril ou frio, isento de soro RPMI 1640, entregues com uma estéril, pipeta Pasteur para lavar o excesso de sangue e para manter a área limpa e úmida. Isso pode ser feito apenas uma vez ou mais de uma vez dependendo de quão rápido se trabalha. Para um dissector experiência, que leva apenas cerca de 2-3 minutos para dissecar um par de gânglios.
- Use a pinça para cortar e remover o músculo de um lado primeiro.
- Uma vez que o músculo é removido, a artéria carótida se tornará visível. Muitas vezes é a luz rosada e contém sangue. Pode parecer cor mais clara que outros vasos sanguíneos que você pode ver na vizinhança e por esta razão a artéria carótida pode não ser notado de imediato. Esta artéria corre ao lado da traquéia e bifurca-se em o que parece um "Y" em forma de fita. Esta bifurcação é um marco importante e uma vez que está localizado, será relativamente fácil encontrar a SCG.
- Sever artéria no final mais caudal e levante-o ligeiramente com a pinça (do outro lado ainda está em anexo). Uma vez que você fizer isso, você vai ver uma forma de amêndoa, massa olhar brilhante pequena de tecido que é vagamente ligado à artéria apenas no ponto de bifurcação e que tem thread-como pré e / ou pós-ganglionares conectivos. Este é o gânglio cervical superior. Use um segundo par de pinças na outra mão para retirá-la com cuidado e coloque em um prato de cultura pequeno (35 mm) contendo frio, isento de soro RPMI 1640.
- Em seguida, extrair o gânglio do outro lado da traquéia seguindo o mesmo protocolo.
3. A limpeza da Gânglios:
- Uma vez que todos os gânglios foram dissecados, eles devem ser libertados, tanto quanto possível de tecido estranho.
- Sob o microscópio de dissecção, você pode ver que os gânglios ter anexado pedaços de artéria carótida, tecido adiposo ou outros. Trabalho com uma pinça em cada mão para arreliar fora esses materiais indesejados. Lugar limpo gânglios em um estéril 15ml cônicos, tubos de polipropileno, contendo meio RPMI 1640.
- Conectivos pré e / ou pós-ganglionares também deve ser aparado. Cada gânglio tem cerca de 10 mil neurônios. Uma vez que os neurônios são banhados, eles vão regenerar suas neurites.
4. Estabelecer cultura Neuron simpática:
- Centrifugar os gânglios no 200xg por 2 minutos e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender os gânglios em 0,5 a 1 ml da solução de tripsina 0,25%. Coloque em uma 37 ˚ C banho-maria ou incubadora durante 30 minutos. Isso ajudará a dissociar as células nos gânglios.
- Após 30 minutos, adicione 10 ml de meio completo para diluir-se e neutralizar os tripsina e centrifugar a 200xg por 2 minutos.
- Elimine o sobrenadante e ressuspender em 2 ml de meio final.
- Além disso dissociar as células por trituração dos gânglios cima e para baixo com o fogo-polido pipeta de vidro de pastagem. Triturar os gânglios 20 vezes e colocar o tubo no gelo por alguns minutos.
- Enquanto isso, o fogo-polonês pipeta a mais para fazer a abertura mais estreita (cerca de 2 mm / 3 a 02/01 de diâmetro). Aguarde alguns minutos até que esfrie e triturar os gânglios 20 vezes mais. Como você continuar, o meio se tornará progressivamente cloudier indicando que as células estão a ser dissociados. Repita este passo uma ou duas vezes mais, dependendo de quão bem as células se dissociam. Depois de algum tempo, você vai notar que todos os gânglios têm o dissociada em neurônios e gânglios intactos não são visíveis no tubo. Pode haver algum material de tecido que não se dissociam. Neste ponto, vamos sentar o tubo no gelo por alguns minutos para que todos os detritos não dissociado pode se depositar no fundo. Agora, cuidadosamente, coletar quase todos do meio da parte superior e coloque em outro tubo. Para garantir que você não recolhem os detritos não dissociado, deixar cerca de 50 ul na parte inferior do tubo. Adicionar mais do meio para o final do tubo contendo células dissociadas: este volume depende do tipo de uma placa de cultura está usando para a cultura de neurônios. Por exemplo: se um prato de 24 é bem a ser empregado, então placa 0,5 gânglios por poço (~ 10 mil neurônios por poço) em 0,5 ml de meio de final por poço. Uma ninhada de ratos típico consiste de 12 filhotes, o que daria 24 gânglios. Isso é suficiente para uma placa de sementes de 24 poços eo volume total de meio final é de 12 ml. Nota: os gânglios também contêm uma pequena população de células gliais e outros tipos celulares que estarão presentes na cultura. Usando Uridine/5-FDU no médio final irá impedir a sua proliferação e promover a sua morte.
- Células de alimentação a cada 48 horas, substituindo dois terços do meio RPMI fresco com 1% soro de cavalo + NGF e uridine/5-FDU. Nota: No início, a cultura contém neurônios simpáticos que olhar em volta sem neurites. Neurites curtos tornam visível 24 horas após a dissecção e progressivamente se tornam mais densos e mais ramificadas ao longo do tempo.
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Discussion
Nós usamos ratos Sprague Dawley de nossas culturas.
Tire um tempo e cuidado ao limpar os gânglios. Remover todos os detritos, vasos sangüíneos e gordura. Este passo é importante para garantir uma cultura que é mais ou menos homogêneo e livre de tipos de células estranhas. A adição de uridine/5-FDU em grande parte eliminar qualquer resquício de células não-neuronais (mitose) contaminando a cultura ou, pelo menos, reprimir a sua proliferação.
Além disso, durante a etapa de dissociação, ser paciente e ter tempo para separar os neurônios para que eles não são encontrados em grandes aglomerações, uma vez que são semeados em placas. Tendo grandes aglomerações de células não renderá bons resultados experimentais. Por exemplo, as grandes aglomerações tornará difícil para os neurônios a serem transfectadas ou infectados. Imunocoloração também pode ser prejudicado e quaisquer experimentos que necessitam de contar os neurônios será difícil de realizar, também.
Não é necessário completar o meio com caneta / strep cada vez que as culturas são alimentados. Além da caneta / strep tempo o primeiro as células são banhados é suficiente. Adicionam uridine/5-FDU fresco ao meio cada vez que o meio é trocado.
Temos usado a cultura neuronal simpática para estudar a apoptose em resposta a retirada de NGF. Por exemplo, em Biswas et al. 2007 (2), neurônios simpáticos foram transfectadas com shRNA contra várias moléculas que desempenham papéis importantes na promoção de apoptose. Deckwerth et al. 1996 (5) usaram neurônios simpáticos de ratos e camundongos do tipo selvagem sem o gene pró-apoptótica Bax. Eles analisaram como esses neurônios se comportam quando são privados de NGF. Figura 6 de Biswas et al. 2007 (2) e na Figura 3 a partir Deckwerth et al. 1996 (5) mostram o que transfectadas e não transfectadas simpático culturas neuronal parecem, respectivamente.
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Acknowledgments
NZ gostaria de agradecer aos membros do laboratório Subhas Biswas, Andrew Sproul, e Ryan Willet para a formação dela em dissecar e colheita neurônios simpáticos. Suportada por concessões do NIH-NINDS.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
