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显微镜和染色:革兰克、胶囊和内孔染色
 

显微镜和染色:革兰克、胶囊和内孔染色

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细菌是微生物,具有许多显著特征,如形状、细胞排列、是否产生胶囊以及是否形成孢子。这些特征都可以通过染色和帮助识别和分类不同的细菌物种来可视化。

为了检查细胞形状和排列的前两个特征,我们可以使用一种叫做革兰染色的简单技术。在这里,水晶紫罗兰被应用于细菌,这些细菌被热固定在幻灯片上。然后应用去色剂,任何含有厚肽的细菌都会染上紫色,因为脱色剂不容易穿透这一层。这些细菌被称为革兰氏阳性。

革兰氏阴性细菌具有更薄的肽类,会去污脱色剂,失去紫色。然而,当添加沙夫兰宁计数器染色时,它们会染红-粉红色,与外侧的脂多糖层结合。一旦染色,细胞可以观察到形态,大小和排列,如链或簇,这进一步有助于分类和识别。

微生物学家工具包中的另一个有用技术是胶囊染色,用于可视化环绕某些类型的细菌细胞的外部胶囊。由于胶囊的非离子成分和排斥污渍的倾向,简单的染色方法将不起作用。相反,使用负染色技术,首先用酸性着色剂(如刚果红)在细菌细胞被水晶紫罗兰染色之前,将背景染色。这留下任何胶囊作为一个明确的光环在细胞周围存在。

这里介绍的最后一个主要染色技术可以帮助确定正在研究的细菌是否形成孢子。在不利条件下,一些细菌产生内孢子,休眠,坚韧,非生殖结构,其主要功能是确保细菌通过环境压力时期,如极端温度或脱水生存。然而,并非所有的细菌物种都产生内孔,它们很难用标准技术染色,因为它们对许多染料是不可渗透的。舍弗-富尔顿方法使用麦芽绿染色,应用于固定在幻灯片上的细菌。然后用清水冲洗幻灯片,然后再用沙夫兰果进行反污。植物细胞将显示粉红色-红色,而任何存在内窥镜将呈绿色。在本视频中,您将学习如何执行这些常见的细菌染色技术,然后使用光显微镜检查染色样品。

开始手术时,系好长发,并穿上适当的个人防护装备,包括实验室外套和手套。

然后,用实验室擦拭清洁新的显微镜幻灯片。接下来,移液器 10 微升 1X 磷酸盐缓冲盐水放在第一个幻灯片上。然后,使用无菌移液器尖端从 LB 琼脂板中选择单个细菌菌落。涂抹液体中的细菌菌群,产生薄的均匀层。将幻灯片放在工作台面上,使其完全晾干。

干燥后,点燃邦森燃烧器加热固定细菌。使用钳子,通过燃烧器火焰几次滑动,细菌侧起,注意不要将幻灯片在火焰中保持太久,这可能会扭曲细胞。

现在,在水槽上工作,握住滑台,涂上几滴革兰的水晶紫罗兰,完全覆盖细菌涂抹,然后将幻灯片放在长凳上,站立 45 秒。接下来,以一定角度握住幻灯片,轻轻将水流喷到幻灯片顶部,注意不要直接喷出细菌污迹。现在,再次保持滑动水平,应用Gram的碘溶液,以完全覆盖染色的细菌,然后,让它再站立45秒。接下来,仔细冲洗幻灯片中的碘,如前所述。在以一定角度握住幻灯片时,向幻灯片添加几滴 Gram 的脱色剂,使其在染色细菌上运行,直到决选清除,大约 5 秒。立即用水冲洗,如前所述。这将限制涂片过度脱色。接下来,再次按住幻灯片水平,应用革兰氏的沙夫兰宁反污,以完全覆盖染色的细菌。45 秒后,用水轻轻冲洗幻灯片中的沙夫兰,如前所述,然后用纸巾擦干。

最后,将一滴浸入油直接添加到幻灯片中,然后用带 100X 油镜镜的光学显微镜检查幻灯片。

要开始这种染色协议,首先穿上正确的个人防护设备,然后确保将使用的玻璃玻片清洁。

接下来,准备解决方案。要制作 1% 的水晶紫色溶液,将 0.25 克的水晶紫色粉末与 25 毫升蒸馏水混合,然后涡旋直至溶解。然后,通过将 0.25 克刚果红粉与 25 毫升蒸馏水和涡旋混合,直到溶解,制备 1% 刚果红色溶液。现在,移液器10微升的刚果红色溶液就滑上了。使用清洁无菌移液器尖端,从 LB 琼脂板中选择单个细菌菌落。然后,将细菌菌群涂抹到染料中,产生薄的、均匀的层。完全空气干燥细菌滑轨 5-7 分钟。一旦幻灯片干燥,用足够的1%的水晶紫罗兰覆盖涂片,让它坐1分钟。现在,以一定角度握住幻灯片,轻轻地将水流喷到幻灯片顶部,注意不要直接喷出细菌。继续以 45 度角握住滑轨,直到完全风干。最后,将一滴浸入油直接添加到幻灯片中,然后使用具有 100X 油镜的光学显微镜检查幻灯片。

要执行内孔染色,首先,通过混合 0 制备 0.5% 的麦芽绿溶液。125克马拉奇特绿色粉末与25毫升蒸馏水,然后涡旋溶液,直到溶解。接下来,将移液器 10 微升的 1X PBS 放在幻灯片的中心。然后,使用无菌移液器尖端从 LB 琼脂板中选择单个细菌菌落。将细菌涂抹到液体中,产生薄薄的均匀层。现在,将幻灯片放在工作台面上,使其完全晾干。干燥后,点燃邦森燃烧器加热固定细菌。通过蓝色燃烧器火焰几次的幻灯片,细菌侧朝上。然后,一旦幻灯片冷却,将一张预切透镜纸放在热固定涂片上。接下来,打开一个热板到最高设置,并带来水烧杯沸腾。

用麦芽绿溶液使透镜纸饱和,并使用钳子将幻灯片放在沸水烧杯顶部,蒸汽5分钟。根据需要添加更多染料,每次一滴,以保持透镜纸的湿润。接下来,再次使用钳子,从烧杯中取出幻灯片,取出并丢弃镜头纸。让幻灯片冷却 2 分钟。在水槽上工作,以一定角度握住幻灯片,然后轻轻地将水流喷到滑道顶部。现在,按住幻灯片水平并应用沙夫兰来完全覆盖幻灯片。然后,让它站立1分钟。接下来,以一定角度握住幻灯片,并冲洗,如前所述。让滑轨在工作台面上晾干。最后,将一滴浸入油直接添加到幻灯片中,然后用光学显微镜检查幻灯片,使用 100X 油镜。

在革兰染色协议中,可能会导致两种不同的颜色污渍。深紫色染色表明细菌是革兰氏阳性,并且它们保留了水晶紫罗兰色。相比之下,红粉染色是革兰氏阴性细菌的特征,相反,这种细菌将被沙夫兰蛋白计数器染色着色。此外,在革兰氏染色后,可以可视化细菌的不同形状和排列。例如,与通常聚集成团或单独发生的细菌相比,可以区分球菌或圆形细菌和棒状杆菌,或识别形成链的细菌。

在胶囊染色显微镜图像中,细菌细胞通常会被染成紫色,并且幻灯片的背景应暗色。在这种黑暗背景下,细菌的胶囊,如果存在,将表现为细胞周围的透明光晕。

最后,在内皮染色中,植物细胞将被沙夫兰林计数器染色染成红色。如果样品中存在内孢子,这些孢子将保留麦芽绿染色,并呈现出蓝绿色。

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