Larvefilet forberedelse: En metode til at visualisere intakte sensoriske neuroner og tilhørende epidermale celler

- For at orientere en larve til filetdissektion skal du placere den i en silikonebelagt skål, der indeholder kold saltvand, og identificere dens dorsale og ventrale sider. Tracheal-rør, der løber langs dens længde, markerer den dorsale side, mens abdominale dentikelbælter identificerer ventralsiden.

Derefter, med den ventrale side op, forsigtigt strække larven og pin hver ende til bunden af fadet. Denne position vil holde dorsale klynger af sensoriske multi-dendritiske neuroner og de tilhørende epidermale celler intakt som dissektion fortsætter.

Brug dissekering saks til at skære langs den ventrale midterlinjen af larven. Pin neglebåndet til pladen for at flade præparatet og fjerne interne strukturer til at afsløre de underliggende muskelvæv. Derefter forsigtigt fjerne passende muskel til at udsætte epidermis og få adgang til tidligere tilslørede neuroner og samtidig bevare deres dendritiske morfologi.

I eksempelprotokollen vil vi se en detaljeret demonstration af larvefiletforberedelse og muskelfjernelse for at se sensoriske da neuroner og epidermale celler.

- Til at begynde med tilsættes nok kold saltvand til en silikoneelastomer skål til at dække bundoverfladen. Tilsæt emnet larve til skålen og læg den under stereomikroskopet, hvilket sikrer korrekt placering af lys. Placer larven med den ventrale side op, som kan identificeres ved abdominal denticle bælter.

Stræk larven i forreste-bageste retning, og ved hjælp af insekt ben, pin hovedet og halen til bunden af fadet.

Brug pinps, fjern de indre organer, herunder CNS, tarm og luftrør. Juster insektstifterne, så fileten er stram, men ikke maksimalt strakt.

Find larvens dorsale midterlinje, hvor muskelvævet er fraværende, og placer derefter en pincetlængde på det indre af denne grænse. Skub grenen mellem musklen og epidermis, og pas på at minimere kontakt med epidermis.

- For at minimere skader på epidermis, dissekere med flattest mulige ben. Og prøv dissekering i calcium-holdige saltvand. Det kan bidrage til at skabe plads mellem musklen og epidermis.

- Træk derefter tangen opad for at bryde fastgørelsen af musklen til kropsvæggen på et ankerpunkt. Gentag denne proces for de resterende muskelsegmenter af interesse.

Juster insektpennene for maksimalt at strække larvefileten i alle retninger.