Larvefilet forberedelse: En metode til at visualisere intakte sensoriske neuroner og tilhørende epidermale celler

Overview

Denne video beskriver, hvordan man forbereder larvefileter, der bruges til at visualisere sensoriske dendritiske arborization (da) neuroner og deres tilknyttede epidermale celler. Den fremhævede protokol viser i detaljer, hvordan man fjerner muskelvæv fra kropsvæggen og samtidig bevarer cellernes morfologi, hvilket forbedrer immunostaining og visualisering af de ellers tilslørede da neuroner og epidermale celler.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Tenenbaum og Gavis, Fjernelse af Drosophila Muskelvæv fra Larval Fileter til immunfluorescensanalyse af sensoriske neuroner og epidermale celler, J. Vis. Exp. (2016).

BEMÆRK: Proceduren for muskelfjernelse (figur 1) er en ændring af tidligere beskrevne metoder til tilberedning af larvefileter. De trin, der går forud for og følger muskelfjernelse, er skitseret kort, og læseren henvises til tidligere arbejde i Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) og Karim og Moore, J. Vis. Exp. (2011) for mere detaljerede beskrivelser.

1. Dissekere Larve i Cold Saline

1. Der fremstilles en arbejdsfortynding af kold HL3.1 saltvand eller kold Ca²⁺-fri HL3.1 saltvand (tabel 1). Placer larven i en silikone elastomer skål med lige nok kold saltvand til at dække bunden af skålen.
   BEMÆRK: Vi anbefaler at eksperimentere med brugen af Ca²⁺-fri HL3.1 saltvand versus standard HL3.1 saltvand under larvedissektion. I mangel af calcium reduceres larvemuskelsammentrækninger kraftigt. Således larvefileter kan være lettere at manipulere, når dissekeret i Ca^{2 +}-fri HL3.1 saltvand. Vi finder dog, at muskelsammentrækning skaber plads mellem musklen og epidermis, og dette kan lette indsættelsen af pincet mellem disse væv og samtidig minimere risikoen for skade på epidermis. Som følge heraf kan standard HL3.1 være at foretrække for at bevare integriteten af epidermis og da neuroner. Vi opnår gode resultater med enten saltvand og valget er overladt til brugeren.
2. Placer larven med den ventrale side op. Larvens ventrale overflade kan identificeres ved hjælp af de abdominale dentikale bælter og den dorsale side af de primære larvefiskerør, der løber fra forreste til bageste. Stræk larven i den forreste-bageste retning og pin hoved og hale til en silikone elastomer dissekere parabol ved hjælp af insekt ben. Brug fin dissekerende saks til at skære langs den ventrale midterlinje, der begynder i den ene ende og skrider mod den anden.
   BEMÆRK: Denne orientering bevarer den almindeligt studerede dorsale klynge af da neuroner.
3. Når larven er skåret op, fastgøres de fire hjørner til dissekeringsskålen, som om den åbnede en bog. Brug tang til at gribe og fjerne indre organer, herunder CNS, tarm og luftrør. Juster insektstifter, så fileten er stram, men ikke maksimalt strakt.
   BEMÆRK: Musklerne er forankret til kropsvæggen ved segmentgrænser. Selvom musklerne dækker det meste af kropsvæggen, er de fraværende i en smal region nær rygmidten.

2. Fjernelse af muskler

1. Find larvens dorsale midterlinje, hvor muskelvæv er fraværende. Placer en enkelt pincet gren sådan, at det kan indsættes under muskelvævet i flattest mulige orientering.
2. Start ved den dorsale midterlinje, nær segmentets forreste grænse, skub forsigtigt tangen mellem musklen og epidermis, og sørger for at minimere kontakten mellem pincet og epidermis.
3. Træk tangen opad for at bryde fastgørelsen af musklen til kropsvæggen på et ankerpunkt. Gentag denne proces for de resterende hemi-segmenter af interesse.
   BEMÆRK: Denne protokol optimerer bevarelsen af posterior af hver da neuron dendrite felt. For at bevare den forreste del af dendrite feltet, er det bedst at indsætte pincet gren i den bageste ende af hvert segment.
4. Juster insektstifterne igen, så larvefileten maksimalt strækkes i alle retninger.
5. Fastgør fileten, mens den stadig er fastgjort til dissekeringsskålen ved hjælp af koldt, frisklavet 4% formaldehyd i PBS i 25 minutter.
6. Skyl 5 gange i PBS.
7. Brug pincet til forsigtigt at trække væk muskelvæv fra de resterende ankerpunkter, idet man sørger for at minimere kontakt med epidermis.
8. Frigør og fjern fileten fra dissekeringsskålen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Udfør alle efterfølgende vask, blokering og immunfluorescens farvning trin, som tidligere beskrevet i Karim og Moore, J. Vis. Exp. (2011).

Representative Results

Figur 1: Oversigt over muskelfjernelsesprocedure. En larve dissekeres og fastgøres til en silikone elastomer dissekere parabol. For at fjerne muskelvæv indsættes en pincetprong mellem muskel- og epidermalcellelaget, startende fra den dorsale midterlinje nær en segmentgrænse (2.2). Tangen trækkes opad for at bryde fastgørelsen mellem musklen og kropsvæggen (2.3). Dette gentages for segmenter af interesse, og derefter fastsættes larven i formaldehyd (2.5). Efter fiksering bruges pincet til at adskille det resterende muskelvæv fra kropsvæggen (2,7 - 2,8) Larve-kutikula og epidermis er afbildet i orange, klasse IV da neuroner i grønt og muskler i rødt. Insets i (2.2) og (2.7) repræsenterer tværsnitssyn på et enkelt larve-hemi-segment. Klik her for at se en større version af dette tal.

1x HL3.1 saltvand (pH 7.2)

5 mM HEPES

70 mM NaCl

5 mM KCl

1,5 mM CaCl2 (udelade for Ca2 +-fri saltvand)

4 mM MgCl2

10 mM NaHCO3

5 mM trehalose

115 mM saccharose

Filteret steriliseres og opbevares ved 4 °C

Bemærk: Sammensætning efterligner insekt hæmolymph

Tabel 1: Sammensætning af kold saltvand.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 tweezers	Electron Microscopy Sciences	72701-D
Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning	3097358-1004	for dissecting plates
Austerlitz insect pins, 0.1 mm	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 light source	Artisan Technology Group	62792-4