Larval lymfekjertel disseksjon: Isolerer Drosophila Hemocyte-produserende organ

- Drosophila melanogaster larval lymfekjertel er ansvarlig for produksjon av hemocytter, eller blodceller, som sirkulerer i larval hemolymfen. For å identifisere lymfekjertelen, finn først dorsalkaret, eller hjertet, som pumper hemolymf gjennom hele kroppen. Følg dorsalkaret mot hodet til du finner hjernen. Lymfekjertelen er en liten, multi-lobed struktur ved siden av hjernen, flankerer dorsalkaret.

For å finne den primære lobe, identifiser den største loben i kjertelen. Denne loben inneholder tre soner, definert av ulike stadier av hemocyttutvikling. Medullærsonen nærmest dorsalfartøyet inneholder umoden hemocytt, mens kortikale sonen inneholder modne hemocytter. I den bakre enden av primærlobenet finner du det bakre signalsenteret, sammensatt av spesialiserte hemocytter.

For å dissekere lymfekjertelen trenger du et dissekerende mikroskop, to tang for å manipulere larver og en bufret saltløsning.

I dette eksemplet vil vi dissekere lymfekjertler for bruk i immunhiistokjemi.

- For å starte lymfekjertel disseksjon, tilsett 1 milliliter 1x PBS til 1 brønn av en 24-brønns plate for hver eksperimentelle innstilling som skal dissekeres. Deretter legger du til 1 dråpe 0,1 % PBST i hver brønn ved hjelp av en pipette for engangsoverføring. Plasser platen flatt på isen. Plasser en ren dissekeringspute på en opplyst stereomikroskopbase. Bruk en engangsoverføringspipette for å plassere en dråpe på 0,01 % PBST på puten.

Overfør en larve til PBST-dråpen for disseksjon. Hold lavaen med ett par tang, dorsal side opp, ca. 1/4 lengde fra den bakre enden. Med det andre par tang, ta tak i kutiklet umiddelbart fremre til det første paret og trekk forsiktig larval cuticle mot fremre, til munnkrokene er utsatt.

Løsne kutikylen og bruk begge tangene til å krysse larven. Fjern den bakre enden fra PBST-dråpen og kast. Fest kutiklet for stabilitet, og bruk deretter det andre par tang for å ta tak i de eksponerte munnkrokene og trekk dem forsiktig ut. Dette vil skille kutiklet fra de indre strukturene.

Hold tak i munnkrokene, fjern forsiktig uønskede strukturer, for eksempel spyttkjertlene, fettkroppen og tarmen. Plukk forsiktig opp det dissekerte vevskomplekset ved munnkrokene og overfør det til en brønn av platen på is. Gjenta disseksjonen med så mange larver som ønsket, men ikke overskrid en 30-minutters avhandlingstid før du fortsetter til fikseringstrinnet.

For å begynne vevsmontering, plasser en dråpe monteringsbuffer på et glasssklie. Bruk munnkrokene som håndtak, overfør lymfekjertelen til bufferdråpen. Plasser vevet jevnt og spre monteringsbufferen i prosessen.

Skyv forsiktig en tang av tangene under dorsalbeholderen, trekk forsiktig mot periferien av monteringsbufferen for å trekke ut og flate ut lymfekjertelen. Med en sagbevegelse, kutt dorsalkaret mellom lymfekjertelen og hjernen. Flytt resten av vevet bort fra lymfekjertelen til den ytterste kanten av bufferen.

Ta en ren dekselslipp og senk den forsiktig ned på monteringsbufferen. Lysbildene er nå klare for avbildning eller kan lagres ved 4 grader Celsius til det er nødvendig.