Denne protokollen er et utdrag fra Reimels og Pfleger, Metoder for å undersøke lymfekjertel og hemocytter i Drosophila Larver, J. Vis. Exp. (2016).
1. Larval lymfekjertelimohistokjemi
MERK: Lymfekjertelen ligger omtrent en tredjedel lengde fra den fremre enden av en larve litt under hjernen på dorsalsiden. (Se pilen i figur 1B.) Lymfekjertelen flankerer dorsalkaret og er lettest dissekert festet til munnkrokene eller til hjernen. Wild-type, tredje instar lymfekjertler er svært små strukturer; de primære lobene er ca. 100 - 200 μm i lengde. (Se figur 2A.)
- For å oppnå larver av omtrent samme utviklingsstadium for denne analysen, begrens eggsamlingen ved å la kvinner legge egg i en fast tidsperiode på 2 - 6 timer.
- Lymfekjertel disseksjon
- For hver eksperimentell tilstand, tilsett 1 ml 1x PBS (Tabell 1) til en brønn på en 24-brønns plate.
- Tilsett 1 dråpe 0,1 % PBST (tabell 1) i hver brønn ved hjelp av en engangsoverføringspipet.
MERK: Vaskemiddel, som Tween 20, tilsetts for å senke overflatespenningen, slik at vevet synker til bunnen av brønnen.
- Plasser platen flatt på isen.
- Samle larver i dissekering parabolen brønner fylt med 1x PBS.
- Plasser en ren dissekeringspute på en opplyst stereomikroskopbase. Bruk en engangsoverføringspipet til å plassere små dråper med 0,01 % PBST (tabell 1) på puten. Overfør en larve til en PBST-dråpe for disseksjon.
- Hold larven med ett par tang omtrent en fjerdedel lengde fra den bakre enden, dorsal side opp.
- Bruk et annet par tang for å ta tak i kutiklet umiddelbart fremre til tang som holder larven. Trekk neglebåndet forsiktig mot den fremre enden til munnkrokene er eksponert.
MERK: Målet er å skrelle kutikalen uten å forstyrre noen indre strukturer.
- Slipp neglebåndet og bruk begge tangene til å kutte larven i to. Fjern den bakre enden fra PBST-dråpen.
MERK: Hvis kutiklen ikke skreller helt til munnkrokene, kutt larven i to og fjern den bakre enden. Bruk ett par tang for å holde kanten av neglebåndet, og bruk det andre par tang for å skyve munnkrokene gjennom åpningen. Dette vil invertere kutiklen og eksponere munnkrokene. Dette kan også brukes som en alternativ disseksjonsmetode.
- Bruk ett par tang for å feste kutiklet (enten ventral kutikal, dorsal kutikal klaff, eller begge deler) for stabilitet.
- Bruk et annet par tang for å ta tak i de eksponerte munnkrokene og trekk dem forsiktig ut.
MERK: Dette vil skille kutikalen fra de indre strukturene. Ideelt sett vil øye / antenne imaginal plater, hjerne, ringkjertel og lymfekjertel flankering dorsalbeholderen forbli festet til munnkrokene.
- Mens du fortsatt holder munnkrokene, fjern forsiktig uønskede strukturer som spyttkjertlene, fettkroppen og tarmen.
MERK: Hvis hjernen skiller seg fra munnkrokene, kan lymfekjertelen fortsatt være festet til og samlet med hjernen. I dette tilfellet holder du ventral nerveledning i stedet for munnkrokene.
- Bruk munnkrokene eller ventral nerveledningen som håndtak, overfør det dissekerte komplekset som inneholder lymfekjertelen til brønnen på is. Må ikke overstige 30 minutter før fiksering.
- Fiksering og immunhiistokjemi
- Plasser 24-brønnsplaten på stereomikroskopbasen.
- Bruk en p200 pipette for å fjerne PBST forsiktig fra brønnen.
MERK: Tomme, nærliggende brønner er nyttige for å midlertidig deponere avfall.
- Tilsett forsiktig 200 μl 3,7% formaldehyd (Tabell 1) nedover siden av brønnen og virvle platen for å sikre at dissekert vev er helt nedsenket.
- Returner platen til is i 30 min. Hvis lymfekjertlene uttrykker fluorescerende protein(er), hold platen dekket for å forhindre fotobleking.
- Bruk en p200 pipette for å fjerne fikseringsmiddelet forsiktig.
- Vask ved å tilsette 200 μl 1x PBS til brønnen og plassere platen på en orbital shaker i 5 min ved romtemperatur. Bruk en p200 pipette for å fjerne PBS forsiktig.
MERK: Faste lymfekjertler kan stå på is i PBS til lymfekjertler for alle eksperimentelle forhold er dissekert og festet.
- Gjenta vasketrinnene to ganger til.
- Tilsett 200 μl permeabiliseringsløsning (tabell 1) i brønnen. Sett platen på en orbital shaker i 45 min ved RT.
MERK: 45 min er "gullstandarden" for lymfekjertelpermeabilisering, men forfatterne har suksess etter bare 20 minutter.
- Fjern oppløsningen med en p200 pipette.
- Fortynn primært antistoff med antistoffoppløsning (tabell 1) i henhold til leverandørens spesifikasjoner. Tilsett 300 μl primær antistoffløsning i brønnen og sørg for at dissekert vev er helt nedsenket. Inkuber ved 4 °C over natten.
- Bruk en p200 pipette for å fjerne det primære antistoffet.
- Vask ved å tilsette 200 μl 1x PBS til brønnen og plassere platen på en orbital shaker i 10 minutter ved romtemperatur. Bruk en p200 pipette for å fjerne PBS forsiktig.
- Gjenta vasketrinnene to ganger til.
- Fortynn sekundært antistoff med antistoffløsning i henhold til leverandørens spesifikasjoner. Tilsett 300 μl sekundær antistoffløsning til brønnen og sørg for at dissekert vev er helt nedsenket. Inkuber på en orbital shaker i minst 2 timer ved RT.
- Bruk en p200 pipette til å fjerne det sekundære antistoffet og vasken som beskrevet i trinn 1.3.12 og 1.3.13. Ikke fjern PBS etter den endelige vasken.
- Montering av lymfekjertler
- Rengjør glassmikroskopet med 70 % etanol (tabell 1) og vevsservietter.
- For hver eksperimentelle tilstand plasserer du én dråpe monteringsbuffer (Tabell 1) på glassskuffen.
MERK: To betingelser får plass på ett lysbilde. Monteringsbuffervolumet avhenger av antall lymfekjertler som skal monteres. Bruk 2 μl i ca. 18-20 lymfekjertler, 1 μl for 10-12 og 0,5 μl for 5 eller mindre.
- Plasser mikroskopsklien på en opplyst stereomikroskopbase.
- For opptil to forhold om gangen, overfør alle lymfekjertlene fra brønnen til monteringsbufferen med tang, ved hjelp av munnkrokene eller ventral nerveledning som håndtak.
- Fordel de dissekerte vevene jevnt i sirkulær eller rektangulær form, og spre monteringsbufferen i prosessen.
- For hvert av de dissekerte vevene, skyv individuelt en tang av tangene under dorsalbeholderen og trekk forsiktig mot periferien av monteringsbufferen.
MERK: Dette vil trekke lymfekjertelen ut fra resten av dissekert vev og flate ut lymfekjertelen på glasset.
- Bruk en tang av tang og en sagbevegelse, kutt dorsalkaret mellom lymfekjertelen og hjernen.
- Flytt resten av dissekert vev til motsatt side av lymfekjertelen, ytterst i bufferen.
MERK: Det uønskede dissekerte vevet vil til slutt danne en omkrets rundt lymfekjertlene og tjene som en støtte som dekslene vil hvile på.
- Gjenta til alle lymfekjertlene er skilt fra dissekert vev, og reserver et av de uønskede dissekerte vevene som skal plasseres i midten.
- Ta en deksle mellom to fingre. Kontroller at dekslene er fri for støv og fingeravtrykk. Bruk om nødvendig en vevsserviett og 70% etanol for å rengjøre dekslene.
- Sørg for at kanten på dekslene er parallell med kanten av glasssklie, senk dekslene forsiktig over monteringsbufferen.
MERK: Mikroskopsklier kan oppbevares ved 4 °C før avbildning. Maksimal lagringstid avhenger av stabiliteten til antistoffene som brukes. 24-brønnsplater kan skylles og gjenbrukes.
2. Bildebehandling
- Bildet fikset hemocytter og monterte lymfekjertler på en passende standard fluorescens eller konfektmikroskop ved 20X eller høyere forstørrelse i henhold til produsentens bruksanvisning. Bilde hele larver på et standard stereomikroskop ved 2X forstørrelse i henhold til produsentens bruksanvisning.
- Følg programvareleverandørens instruksjoner for dekonvolusjon, om ønskelig.
