Larval lymfekjertel disseksjon: Isolerer Drosophila Hemocyte-produserende organ

Overview

Denne videoen beskriver Drosophila-lymfekjertelen – det primære stedet for hematopoiesis i fluelarven – og viser et eksempelprotokoll for å dissekere og montere orgelet for immunhiistokjemi og fluorescerende avbildning.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Reimels og Pfleger, Metoder for å undersøke lymfekjertel og hemocytter i Drosophila Larver, J. Vis. Exp. (2016).

1. Larval lymfekjertelimohistokjemi

MERK: Lymfekjertelen ligger omtrent en tredjedel lengde fra den fremre enden av en larve litt under hjernen på dorsalsiden. (Se pilen i figur 1B.) Lymfekjertelen flankerer dorsalkaret og er lettest dissekert festet til munnkrokene eller til hjernen. Wild-type, tredje instar lymfekjertler er svært små strukturer; de primære lobene er ca. 100 - 200 μm i lengde. (Se figur 2A.)

1. For å oppnå larver av omtrent samme utviklingsstadium for denne analysen, begrens eggsamlingen ved å la kvinner legge egg i en fast tidsperiode på 2 - 6 timer.
2. Lymfekjertel disseksjon
   1. For hver eksperimentell tilstand, tilsett 1 ml 1x PBS (Tabell 1) til en brønn på en 24-brønns plate.
   2. Tilsett 1 dråpe 0,1 % PBST (tabell 1) i hver brønn ved hjelp av en engangsoverføringspipet.
      MERK: Vaskemiddel, som Tween 20, tilsetts for å senke overflatespenningen, slik at vevet synker til bunnen av brønnen.
   3. Plasser platen flatt på isen.
   4. Samle larver i dissekering parabolen brønner fylt med 1x PBS.
   5. Plasser en ren dissekeringspute på en opplyst stereomikroskopbase. Bruk en engangsoverføringspipet til å plassere små dråper med 0,01 % PBST (tabell 1) på puten. Overfør en larve til en PBST-dråpe for disseksjon.
   6. Hold larven med ett par tang omtrent en fjerdedel lengde fra den bakre enden, dorsal side opp.
   7. Bruk et annet par tang for å ta tak i kutiklet umiddelbart fremre til tang som holder larven. Trekk neglebåndet forsiktig mot den fremre enden til munnkrokene er eksponert.
      MERK: Målet er å skrelle kutikalen uten å forstyrre noen indre strukturer.
   8. Slipp neglebåndet og bruk begge tangene til å kutte larven i to. Fjern den bakre enden fra PBST-dråpen.
      MERK: Hvis kutiklen ikke skreller helt til munnkrokene, kutt larven i to og fjern den bakre enden. Bruk ett par tang for å holde kanten av neglebåndet, og bruk det andre par tang for å skyve munnkrokene gjennom åpningen. Dette vil invertere kutiklen og eksponere munnkrokene. Dette kan også brukes som en alternativ disseksjonsmetode.
   9. Bruk ett par tang for å feste kutiklet (enten ventral kutikal, dorsal kutikal klaff, eller begge deler) for stabilitet.
   10. Bruk et annet par tang for å ta tak i de eksponerte munnkrokene og trekk dem forsiktig ut.
       MERK: Dette vil skille kutikalen fra de indre strukturene. Ideelt sett vil øye / antenne imaginal plater, hjerne, ringkjertel og lymfekjertel flankering dorsalbeholderen forbli festet til munnkrokene.
   11. Mens du fortsatt holder munnkrokene, fjern forsiktig uønskede strukturer som spyttkjertlene, fettkroppen og tarmen.
       MERK: Hvis hjernen skiller seg fra munnkrokene, kan lymfekjertelen fortsatt være festet til og samlet med hjernen. I dette tilfellet holder du ventral nerveledning i stedet for munnkrokene.
   12. Bruk munnkrokene eller ventral nerveledningen som håndtak, overfør det dissekerte komplekset som inneholder lymfekjertelen til brønnen på is. Må ikke overstige 30 minutter før fiksering.
3. Fiksering og immunhiistokjemi
   1. Plasser 24-brønnsplaten på stereomikroskopbasen.
   2. Bruk en p200 pipette for å fjerne PBST forsiktig fra brønnen.
      MERK: Tomme, nærliggende brønner er nyttige for å midlertidig deponere avfall.
   3. Tilsett forsiktig 200 μl 3,7% formaldehyd (Tabell 1) nedover siden av brønnen og virvle platen for å sikre at dissekert vev er helt nedsenket.
   4. Returner platen til is i 30 min. Hvis lymfekjertlene uttrykker fluorescerende protein(er), hold platen dekket for å forhindre fotobleking.
   5. Bruk en p200 pipette for å fjerne fikseringsmiddelet forsiktig.
   6. Vask ved å tilsette 200 μl 1x PBS til brønnen og plassere platen på en orbital shaker i 5 min ved romtemperatur. Bruk en p200 pipette for å fjerne PBS forsiktig.
      MERK: Faste lymfekjertler kan stå på is i PBS til lymfekjertler for alle eksperimentelle forhold er dissekert og festet.
   7. Gjenta vasketrinnene to ganger til.
   8. Tilsett 200 μl permeabiliseringsløsning (tabell 1) i brønnen. Sett platen på en orbital shaker i 45 min ved RT.
      MERK: 45 min er "gullstandarden" for lymfekjertelpermeabilisering, men forfatterne har suksess etter bare 20 minutter.
   9. Fjern oppløsningen med en p200 pipette.
   10. Fortynn primært antistoff med antistoffoppløsning (tabell 1) i henhold til leverandørens spesifikasjoner. Tilsett 300 μl primær antistoffløsning i brønnen og sørg for at dissekert vev er helt nedsenket. Inkuber ved 4 °C over natten.
   11. Bruk en p200 pipette for å fjerne det primære antistoffet.
   12. Vask ved å tilsette 200 μl 1x PBS til brønnen og plassere platen på en orbital shaker i 10 minutter ved romtemperatur. Bruk en p200 pipette for å fjerne PBS forsiktig.
   13. Gjenta vasketrinnene to ganger til.
   14. Fortynn sekundært antistoff med antistoffløsning i henhold til leverandørens spesifikasjoner. Tilsett 300 μl sekundær antistoffløsning til brønnen og sørg for at dissekert vev er helt nedsenket. Inkuber på en orbital shaker i minst 2 timer ved RT.
   15. Bruk en p200 pipette til å fjerne det sekundære antistoffet og vasken som beskrevet i trinn 1.3.12 og 1.3.13. Ikke fjern PBS etter den endelige vasken.
4. Montering av lymfekjertler
   1. Rengjør glassmikroskopet med 70 % etanol (tabell 1) og vevsservietter.
   2. For hver eksperimentelle tilstand plasserer du én dråpe monteringsbuffer (Tabell 1) på glassskuffen.
      MERK: To betingelser får plass på ett lysbilde. Monteringsbuffervolumet avhenger av antall lymfekjertler som skal monteres. Bruk 2 μl i ca. 18-20 lymfekjertler, 1 μl for 10-12 og 0,5 μl for 5 eller mindre.
   3. Plasser mikroskopsklien på en opplyst stereomikroskopbase.
   4. For opptil to forhold om gangen, overfør alle lymfekjertlene fra brønnen til monteringsbufferen med tang, ved hjelp av munnkrokene eller ventral nerveledning som håndtak.
   5. Fordel de dissekerte vevene jevnt i sirkulær eller rektangulær form, og spre monteringsbufferen i prosessen.
   6. For hvert av de dissekerte vevene, skyv individuelt en tang av tangene under dorsalbeholderen og trekk forsiktig mot periferien av monteringsbufferen.
      MERK: Dette vil trekke lymfekjertelen ut fra resten av dissekert vev og flate ut lymfekjertelen på glasset.
   7. Bruk en tang av tang og en sagbevegelse, kutt dorsalkaret mellom lymfekjertelen og hjernen.
   8. Flytt resten av dissekert vev til motsatt side av lymfekjertelen, ytterst i bufferen.
      MERK: Det uønskede dissekerte vevet vil til slutt danne en omkrets rundt lymfekjertlene og tjene som en støtte som dekslene vil hvile på.
   9. Gjenta til alle lymfekjertlene er skilt fra dissekert vev, og reserver et av de uønskede dissekerte vevene som skal plasseres i midten.
   10. Ta en deksle mellom to fingre. Kontroller at dekslene er fri for støv og fingeravtrykk. Bruk om nødvendig en vevsserviett og 70% etanol for å rengjøre dekslene.
   11. Sørg for at kanten på dekslene er parallell med kanten av glasssklie, senk dekslene forsiktig over monteringsbufferen.
       MERK: Mikroskopsklier kan oppbevares ved 4 °C før avbildning. Maksimal lagringstid avhenger av stabiliteten til antistoffene som brukes. 24-brønnsplater kan skylles og gjenbrukes.

2. Bildebehandling

1. Bildet fikset hemocytter og monterte lymfekjertler på en passende standard fluorescens eller konfektmikroskop ved 20X eller høyere forstørrelse i henhold til produsentens bruksanvisning. Bilde hele larver på et standard stereomikroskop ved 2X forstørrelse i henhold til produsentens bruksanvisning.
2. Følg programvareleverandørens instruksjoner for dekonvolusjon, om ønskelig.

Representative Results

Figur 1: In Vivo Crystal Cell Melanization. A) Larver ble plassert individuelt i PCR-rør før oppvarming. Røde piler indikerer larver som ikke er på bunnen av rørene. B) Et typisk krystallcelle melaniseringsmønster etter oppvarming, som noen ganger avslører lymfekjertelen (pil; dorsal side vist, fremre er igjen). Skalalinjen representerer 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Larval lymfekjertelimohistokjemi. A) Et DIC-bilde av en tredje instar larval lymfekjertel som viser dorsalkaret (dv), primærlober (1°) og sekundære lober (2°). Skala bar representerer 100 μm. B) En representativ tredje instar larval lymfekjertel fra en larve genetisk uttrykke EBFP2 i medullær sone og GFP i bakre signalsenter. Lymfekjertelen ble farget med et antistoff mot Notch intracellulært domene (rødt). Uendret bilde tatt med et fluorescensmikroskop (topp). Det samme bildet etter dekonvolusjon (nederst). Skalastenger representerer 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
microscope cover glass, 18 mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1