Enkelcellsdisociation av Caenorhabditis elegans: En metod för att isolera levande celler

- Börja med tvättade pelleterade maskar och tillsätt lysbuffert som innehåller SDS, ett tvättmedel och DDT, ett reducerande medel.

Ta sedan bort lysisreagenserna med flera tvättar av kall isoleringsbuffert. Det är viktigt att denna buffert är av rätt osmolaritet för att förhindra celldöd.

Tillsätt media som innehåller serum för att stoppa enzymreaktionen och antibiotika för att förhindra kontaminering. Pellet och tvätta provet flera gånger för att avlägsna det mesta av skräpet.

Placera slutligen röret på is för att möjliggöra gravitationssedimentering.

I exempelprotokollet kommer vi att skilja transgena maskar som uttrycker GFP i nervceller av intresse för att isolera och analysera dessa celler.

- Efter insamling av djuren, centrifugera dem vid 1 600 gånger g i fem minuter.

Centrifug vid 1 600 gånger g i fem minuter för att pelleta maskarna. Lägg sedan till 200 mikroliter SDS-DDT-buffert och inkubera vid rumstemperatur i fem minuter. Maskarna ska nu verka skrynkliga längs kroppen om de ses under ett lätt mikroskop.

Tillsätt sedan 800 mikroliter iskyl isoleringsbuffert och blanda genom att försiktigt snärta röret. Centrifuge vid 13 000 gånger g och vid 4 grader Celsius i en minut för att pelleta maskarna.

Upprepa denna centrifugation och tvättprocess totalt fem gånger, se till att försiktigt ta bort isoleringsbufferten varje gång.

Inkubera vid rumstemperatur i 10 till 15 minuter. Se till att applicera mekaniska störningar genom att leda upp och ner 60 till 70 gånger med 200 mikropipettespetsen för 200 mikroskop mot botten av röret. För att bestämma matsmältningsstadiet, ta bort 1 till 5 mikroskop i rötningsblandningen, släpp den på en glasrutschbana och inspektera den med hjälp av ett vävnadskulturmikroskop.

Efter fem till sju minuter bör maskfragment ha en synligt reducerad nagelband och en uppslamning av celler kommer att vara lätt synlig. Stoppa reaktionen genom att lägga till 900 mikroliter kommersiellt tillgängliga Leibovitz L15 medium kompletterat med 10% FBS och penicillin-streptomycin.

Centrifugera vid 10 000 gånger g och vid 4 grader Celsius i 5 minuter till pelletsisolerade fragment och celler. Tvätta de pelleterade cellerna två gånger till med kallt L15-kompletterat medium med 1 milliliter media per tvätt.

Ta sedan det översta lagret, som är cirka 700 till 800 mikroliter, och överför det till ett mikrocentrifugrör. Använd en automatiserad cellräknare eller hemocytometer för att mäta celltätheten på 10 till 25 mikroliter isolerade celler.