Disociación de células individuales de Caenorhabditis elegans: Un método para aislar las células vivas

- Comience con gusanos peletizados lavados y agregue el tampón de lisis que contiene SDS, un detergente y DDT, un agente reductor. Esto descompone la cutícula protectora del gusano que expone el cuerpo para la disociación celular. Evite la exposición prolongada al tampón de lisis para minimizar la lisis celular y la muerte.

A continuación, retire los reactivos de lisis con varios lavados de amortiguador de aislamiento frío. Es importante que este amortiguador sea de la osmolaridad correcta para prevenir la muerte celular.

Añadir medios que contengan suero para detener la reacción enzimática y los antibióticos para evitar la contaminación.

Por último, coloque el tubo sobre hielo para permitir la sedimentación por gravedad.

En el protocolo de ejemplo, disociaremos gusanos transgénicos que expresan GFP en neuronas de interés para aislar y analizar esas células.

- Después de recoger a los animales, centrífulos a 1.600 veces g durante cinco minutos. Retire todo el sobrenadante y vuelva a suspender los gusanos en 1 mililitro de medios M9.

Centrífuga a 1.600 veces g durante cinco minutos para peletizar los gusanos. Entonces, añadir 200 microlitros de amortiguador SDS-DDT e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.

A continuación, agregue 800 microlitros de amortiguador de aislamiento helado y mezcle moviendo suavemente el tubo. Centrifugadora a 13.000 veces g y a 4 grados Celsius durante un minuto para peletizar los gusanos. Retire el sobrenadante y lave con 1 mililitro de amortiguador de aislamiento.

Repita este proceso de centrifugación y lavado un total de cinco veces, asegurándose de eliminar cuidadosamente el búfer de aislamiento cada vez.

Incubar a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Asegúrese de aplicar la interrupción mecánica pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 60 a 70 veces con la punta de micropipette de 200 microlitros contra la parte inferior del tubo. Para determinar la etapa de la digestión, retire de 1 a 5 microlitros de la mezcla de digestión, colóquela en un tobogán de vidrio e inspeccione utilizando un microscopio de cultivo tisular.

Después de cinco a siete minutos, los fragmentos de gusano deben tener una cutícula visiblemente reducida y un lodo de células será fácilmente visible. Detener la reacción añadiendo 900 microlitros del medio L15 de Leibovitz disponible comercialmente complementado con 10% FBS y penicilina-estreptomicina.

Centrífuga a 10.000 veces g y a 4 grados Celsius durante 5 minutos para peletizar fragmentos y células aisladas. Lave las células peletadas dos veces más con medios suplementados L15 fríos usando 1 mililitro de medios por lavado. Vuelva a suspender las células peletadas en 1 mililitro de soportes complementados L15 y déjelas en hielo durante 30 minutos.

Luego, tome la capa superior, que es de aproximadamente 700 a 800 microlitros, y transfiérala a un tubo de microcentrífuga.