C. elegans Dissezione blastomero: un metodo per rimuovere il guscio d'uovo e dissociare le cellule embrionali

- Per questa dissezione, utilizzare due micropipette: una con un'apertura approssimativamente della stessa larghezza di un uovo e una che è due volte più ampia, e una serie di soluzioni organizzate in pozzi per facilitare il rapido trasferimento tra di loro.

In primo luogo, mettere gli ermafroditi adulti in una soluzione di sale d'uovo, che è osmoticamente bilanciata per evitare lo scoppio degli embrioni. Tagliare i vermi a metà per rilasciare gli embrioni in via di sviluppo.

Quindi, identificare gli embrioni a due cellule. Queste cellule sono i blastomeri formati dalla divisione dell'ovulo fecondato. Utilizzare la micropipetta con l'apertura più grande per trasferire un embrione alla soluzione di ipoclorito, candeggina, che inizierà a rompere il guscio d'uovo protettivo.

Dopo soli 40-55 secondi, trasferire l'embrione nel mezzo di crescita di Shelton, o SGM. Lavare ogni embrione brevemente in due pozzi di RLS per rimuovere tutte le tracce della candeggina prima di metterle in un terzo pozzo.

Ora, usate la micropipetta più piccola per pipettare ripetutamente l'embrione fornendo la forza meccanica per rimuovere il guscio d'uovo ed esporre i blastomeri. Continuate delicatamente a pipettare l'embrione per separare le singole cellule blastomere. Nel seguente protocollo, vedremo questa tecnica in azione.

- Tenere ogni estremità di un microcapillare ad una capacità di 10 microlitri con mano destra e sinistra. Tirare il microcapillare verso entrambe le estremità per applicare la tensione e portare il centro del capillare sopra un bruciatore per realizzare due capillari tirati a mano.

Al microscopio sezionato, tagliare le punte dei capillari tirati a mano con pini. Rendere le due dimensioni di apertura della punta circa due volte e una volta la lunghezza dell'asse corta degli embrioni C. elegans rispettivamente per il trasferimento dell'embrione e la rimozione del guscio d'uovo.

Attaccare il capillare tirato in un apparato di pipettazione della bocca. Pipetta 45 microlitri di soluzione di sale d'uovo su un pozzo di uno scivolo multi-pozzo.

Posizionare da 5 a 10 C. elegans adulti sul pozzo. Per ottenere embrioni c. elegans precoci, tagliare gli adulti a pezzi posizionando due aghi a destra e a sinistra del corpo di C. elegans e facendo scorrere gli aghi l'uno accanto all'altro.

Pipetta 45 microlitri di soluzione di ipoclorito su un pozzo vicino alla soluzione di sale d'uovo ben contenente e pipetta 45 microlitri del mezzo di crescita di Shelton sui tre pozzi successivi. Trasferire embrioni a uno stadio a una cellula e primi embrioni a due cellule nella soluzione di ipocorite dalla pipetta della bocca con apertura di dimensioni maggiori e attendere da 40 a 55 secondi.

Lavare gli embrioni trasferendoli nei tre pozzi successivi con il mezzo di crescita di Shelton con da 1 a 2 secondi in ciascuno dei primi due pozzi. Utilizzando il capillare disegnato a mano con un'apertura di dimensioni più piccole, ripetere accuratamente la pipettazione dell'embrione per la rimozione del guscio d'uovo.

Successivamente, pipetta continuamente con il capillare disegnato a mano per separare i blastomeri embrionali a due cellule.

- Dopo la rimozione del guscio d'uovo, ridurre al minimo la forza nella pipettazione degli embrioni su e giù per prevenire lo scoppio.