C. elegans Blastomere Dissection: Eine Methode, um die Eierschale zu entfernen und embryonale Zellen zu dissoziieren

- Für diese Sezierung verwenden Sie zwei Mikropipetten: eine mit einer Öffnung etwa die gleiche Breite wie ein Ei und eine, die doppelt so breit ist, und eine Reihe von Lösungen in Brunnen organisiert, um einen schnellen Transfer zwischen ihnen zu erleichtern.

Legen Sie zunächst erwachsene Hermaphrodite in Eine Eisalzlösung, die osmotisch ausbalanciert ist, um das Platzen von Embryonen zu verhindern. Schneiden Sie die Würmer in die Hälfte, um die sich entwickelnden Embryonen freizusetzen.

Identifizieren Sie dann zweizellige Stadium-Embryonen. Diese Zellen sind die Blastomere, die durch die Teilung der befruchteten Eizelle gebildet werden. Verwenden Sie die Mikropipette mit der größeren Öffnung, um einen Embryo auf Hypochloritlösung, Bleichmittel, zu übertragen, die beginnen, die schützende Eierschale zu brechen.

Nach nur 40 bis 55 Sekunden, übertragen Sie den Embryo auf Sheltons Wachstumsmedium, oder SGM. Waschen Sie jeden Embryo kurz in zwei Brunnen von SGM, um alle Spuren der Bleiche zu entfernen, bevor Sie sie in einem dritten Brunnen platzieren.

Verwenden Sie nun die kleinere Mikropipette, um den Embryo wiederholt zu pipetten und die mechanische Kraft zu liefern, um die Eierschale zu entfernen und die Blastomere freizulegen.

- Halten Sie jedes Ende einer Mikrokapillare bei einer Kapazität von 10 Mikrolitern mit rechter und linker Hand. Ziehen Sie die Mikrokapillare an beiden Enden, um Spannung anzuwenden und bringen Sie die Mitte der Kapillare über einen Brenner, um zwei handgezogene Kapillaren herzustellen.

Trimmen Sie unter dem Seziermikroskop die Spitzen der handgezogenen Kapillaren mit Zangen. Machen Sie die beiden Spitzenöffnungsgrößen etwa zweimal bzw. ein Mal die kurze Achslänge von C. elegans Embryonen für den Embryotransfer bzw. die Eischalenentfernung.

Befestigen Sie die gezogene Kapillare in einem Mundpipettiergerät. Pipette 45 Mikroliter Eisalzlösung auf einen Brunnen eines Multi-Well-Schlittens.

Legen Sie 5 bis 10 erwachsene C. elegans auf den Brunnen. Um frühe C. elegans Embryonen zu erhalten, schneiden Sie Erwachsene in Stücke, indem Sie zwei Nadeln rechts und links des C. elegans Körpers positionieren und die Nadeln aneinander vorbeischieben.

Pipette 45 Mikroliter Hypochloritlösung auf einen Brunnen neben der brunnenhaltigen Eisalzlösung und Pipette 45 Mikroliter Von Sheltons Wachstumsmedium auf die folgenden drei Brunnen. Übertragen Sie einzellige Und frühe zweizellige Embryos durch die Mundpipette mit größerer Öffnung in die Hypochoritlösung und warten Sie 40 bis 55 Sekunden.

Waschen Sie die Embryonen, indem Sie sie mit Sheltons Wachstumsmedium in die nächsten drei Brunnen mit 1 bis 2 Sekunden in jedem der ersten beiden Brunnen übertragen.

Danach kontinuierlich Pipette mit der handgezeichneten Kapillare, um die zweizelligen Stadium embryonale Blastomere zu trennen.

- Nach der Entnahme der Eierschale, minimieren Sie die Kraft in Pipettierembryonen nach oben und unten, um Platzzuhaben zu verhindern.