Microinjeção gonad: um método de entrega composta diretamente na germinal de C. elegans

- Para se preparar para a injeção, use uma picareta de vermes para colocar uma faixa de óleo de halocarbono em uma almofada de agarose. Coloque vermes no óleo e imobilize-os suavemente empurrando-os para a almofada de ágar. Certifique-se de que o óleo cobre totalmente os animais. Permite que o oxigênio vá para os vermesenquanto previne a dessecação. Em seguida, coloque a almofada de agarose em um microscópio de injeção e posicione a agulha perpendicular ao verme, visando a extremidade distal de um braço gonad.  

Empurre suavemente a agulha através da cutícula e injete o braço de gônadas com o ácido nucleico ou composto de interesse. Cada braço de gônada contém um sincitium germina que se desenvolverá em oócitos individuais.

Depois de injetar vermes, substitua o óleo por tampão M9. Uma vez que os vermes comecem a se mover, transfira-os para uma placa de ágar NGM com alimentos bacterianos. No protocolo a seguir, o método de microinjeção de gônnas é usado para fornecer um complexo Cas9 para atingir e editar o gene dpy-10.

- Comece com a preparação de C. elegans e almofadas de agarose, conforme descrito no protocolo de texto. Coloque uma almofada de injeção de agarose e cubra deslize em um escopo de dissecção. Use uma picareta de vermes para colocar uma pequena faixa de óleo de halocarboneto ao longo de uma borda da almofada. Em seguida, use a picareta de vermes revestida em óleo para levantar vários vermes da placa de Ágar NG e para a trilha do óleo. Com um cabelo fino preso a uma pipeta, como um cílio ou bigode de gato, posicione os vermes em paralelo empurrando suavemente os vermes para a almofada de agarose. montar e injetar um verme de cada vez.

Uma vez posicionado e anexado ao bloco, sobreponha os vermes com outras gotas de óleo de halocarbono da ponta da picareta do verme. Coloque o deslizamento de tampa com os vermes montados no microscópio de injeção. Sob uma baixa ampliação, posicione os vermes perpendiculares à agulha de injeção, que foi preenchida com a solução RNP, conforme descrito no protocolo de texto.

Mude para uma alta ampliação e reposicione a agulha adjacente ao braço de gônada, correspondente à região próxima aos núcleos no meio do paquitene médio-tardio. Utilizando o micromanipulador, mova a agulha contra o verme, deprimindo ligeiramente a cutícula. Em seguida, com uma mão, toque na lateral do estágio do microscópio para sacudir a agulha através da cutícula. Depressão do pedal de injeção ou botão, lentamente encher para gonad braço com a mistura de injeção, e remover a agulha.

Uma vez que os vermes são injetados, remova a mancha de cobertura na almofada de agarose e coloque-a sob um microscópio dissecando. Usando uma pipeta capilar puxada, desloque o óleo dos vermes pipetando um tampão M9 sobre eles. Realize este tratamento para liberar os vermes do ágar. Após 10 minutos, quando os vermes estiverem batendo no tampão, mova-os para uma placa de ágar NG com bactérias OP50 usando a pipeta capilar puxada. Coloque a placa a 20 graus Celsius por duas a três horas até que os vermes se recuperem e estejam se movendo. placas de ágar com OP50 Em seguida, transfira as placas para uma incubadora de 25 graus Celsius.