Microiniezione Gonad: Un metodo di consegna composta direttamente nella linea germinale di C. elegans

- Per prepararsi all'iniezione, utilizzare un piccone per posare una traccia di olio di alocarbonio su un cuscinetto di agarosio. Posizionare i vermi nell'olio e immobilizzarli spingendoli delicatamente sul cuscinetto dell'agar. Assicurarsi che l'olio copra completamente gli animali. Consente all'ossigeno di raggiungere i vermi prevenendol'essiccazione. Successivamente, posizionare il cuscinetto di agarrose su un microscopio a iniezione e posizionare l'ago perpendicolare al verme, mirando all'estremità distale di un braccio gonad.  

Spingere delicatamente l'ago attraverso la cuticola e iniettare il braccio gonadico con l'acido nucleico o il composto di interesse. Ogni braccio gonadico contiene un sincizio germinale che si svilupperà in singoli ovociti. Il materiale iniettato nella gonadi distale verrà incorporato in tali ovociti e influenzerà la generazione successiva.

Dopo aver iniettato vermi, sostituire l&olio con il tampone M9. Una volta che i vermi iniziano a muoversi, trasferirli su una piastra di agar NGM con cibo batterico. Nel seguente protocollo, il metodo di microiniezione gonad viene utilizzato per fornire un complesso Cas9 per colpire e modificare il gene dpy-10.

- Iniziare con la preparazione di C. elegans e tamponi di agarosio come descritto nel protocollo di testo. Posizionare un cuscinetto di iniezione di agarosio e coprire lo slittamento su un mirino di dissezione. Utilizzare un piccone per posare una piccola traccia di olio di alocarbonio lungo un bordo del pad. Quindi, utilizzare il piccone del verme rivestito di olio per sollevare diversi vermi dalla piastra di agar NG e nella pista dell'olio. Con i capelli fini attaccati a una pipetta, ad esempio una ciglia o un baffo di gatto, posizionare i vermi in parallelo spingendo delicatamente i vermi nel tampone di agarosa. Fino a quando non sono a proprio agio con la procedura di microiniezione, solo montare e iniettare un verme alla volta.

Una volta in posizione e attaccati al pad, sovrapporre i vermi con altre poche gocce di olio di alocarbonio dalla punta del piccone del verme. Posizionare lo scivolo di copertura con i vermi montati sul microscopio a iniezione. Sotto un basso ingrandimento, posizionare i vermi perpendicolarmente all'ago di iniezione, che è stato riempito con la soluzione RNP, come descritto nel protocollo di testo.

Passare a un ingrandimento elevato e riposizionare l'ago adiacente al braccio gonad, corrispondente alla regione vicino ai nuclei a metà-tardo pachytene. Utilizzando il micromanipolatore, spostare l'ago contro il verme, deprimendo leggermente la cuticola. Quindi, con una mano, toccare il lato del palco del microscopio per scuotere l'ago attraverso la cuticola. Deprimere il pedale o il pulsante di iniezione, riempire lentamente il braccio gonad con la miscela di iniezione e rimuovere l'ago. Ripetere il passo con l'altro braccio gonad.

Una volta iniettati i vermi, rimuovere il coverslip nel tampone di agarosio e posizionarlo sotto un microscopio sezionante. Utilizzando una pipetta capillare tirata, spostare l'olio dai vermi pipettando un tampone M9 su di essi. Eseguire questo trattamento per rilasciare i vermi dall'agar. Dopo 10 minuti, quando i vermi si stanno thrashing nel tampone, spostarli su una piastra di agar NG con batteri OP50 utilizzando la pipetta capillare tirata. Posizionare la piastra a 20 gradi Celsius per due o tre ore fino a quando i vermi non si sono ripresi e si muovono. Una volta recuperati, trasferire singolarmente i vermi a NG piastre di agar con OP50 Quindi, trasferire le piastre in un incubatore di 25 gradi Celsius.