Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Lentivirus er en Retrovirus, der indeholder RNA genetisk materiale. Denne virus giver en effektiv og stabil metode til at indføre transgener til kræft cellelinjer. Start med at tilsætte neuraminidase til et rør, der indeholder lentivirus, der udtrykker grønt fluorescerende protein, eller GFP. Hold røret ved 37 grader Celsius i en time for at øge virussens bindingseffektivitet.
Dernæst centrifuge et rør, der indeholder tumor celle suspension til at danne en pellet. Tilføj mammosfæren medier, der indeholder polybrene at genbruge cellerne. Polybrene er en kationisk polymer, der øger Lentiviral infektion effektivitet. Nu plade det optimale antal tumorceller per brønd i en seks godt væv kultur plade. Tilsæt den nødvendige mængde Lentivirus i hver brønd af kulturpladen.
Slyng pladen for at blande indholdet, og hold ved 37 grader Celsius i 96 timer med en kontinuerlig forsyning af kuldioxid. Lentivirus kommer ind i cellen og frigiver RNA. Den virale omvendte transskription konverterer RNA'et til dobbeltstrenget DNA, som integreres i værtsgenomet. Placer pladen under et fluorescerende mikroskop og overvåge celler for vellykket transduktion. De transducerede celler fluorescerer på grund af GFP-udtryk.
I eksempelprotokollen udfører vi transduktion af PDX-dissociated tumorceller med lentivirale vektorer.
For at transduce tumorcellerne, centrifuge de isolerede celler til resuspension i to milliliter mammosphere medium. Efter optælling, centrifuge cellerne igen og genbruge pellet i to milliliter mammosphere medium, suppleret med 20 mikroliter af polybrene. Dernæst plade 2 gange 10 til den femte levedygtige tumorceller per brønd i en ultra lav tilslutning seks godt væv kultur plade og Lentiviral partikler til cellerne ved en mangfoldighed af infektion på 10.
Slyng pladen for at blande virussen med cellerne og inkubere co-kulturer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i op til 96 timer, tilsæt 500 mikroliter af frisk mammosfære medium efter de første 24 timer. Når mindst 10% af cellerne er GFP positive, overføres de transducerede celler fra mindst et godt stykke ind i et 15 milliliter konisk rør på is og vask brønden med en milliliter mammosphere medium.
Pool vask med cellerne og centrifuge tumorcellerne i 10 milliliter HBSS plus HEPES. Endelig genbruges cellerne i 50 mikroliter af kælderen matrix ekstrakt på is og indlæse de indlejrede celler i en 0,5 milliliter insulin sprøjte til reimplantation.
