Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Lentivirüs, RNA genetik materyali içeren bir Retrovirüstür. Bu virüs kanser hücre hatlarına transgenes tanıtmak için etkili ve istikrarlı bir yöntem sağlar. Yeşil floresan proteini veya GFP'yi ifade eden Lentivirüs içeren bir tüpe neuraminidaz ekleyerek başlayın. Virüsün bağlayıcı verimliliğini artırmak için tüpü bir saat boyunca 37 santigrat derecede tutun.
Daha sonra, bir pelet oluşturmak için tümör hücresi süspansiyonu içeren bir tüpü santrifüj edin. Hücreleri yeniden gerçekleştirmek için polibren içeren mammosfer ortamı ekleyin. Polibren, Lentiviral enfeksiyon verimliliğini artıran katyonik bir polimerdir. Şimdi altı kuyu doku kültürü plakasında kuyu başına en uygun tümör hücresi sayısını plakala. Kültür plakasının her kuyusuna gerekli miktarda Lentivirüs ekleyin.
İçeriği karıştırmak için plakayı döndürün ve sürekli karbondioksit kaynağı ile 96 saat boyunca 37 santigrat derecede tutun. Lentivirüs hücreye girer ve RNA salgılar. Viral ters transkriptaz, RNA'yı konak genomuna entegre olan çift iplikli DNA'ya dönüştürür. Plakayı floresan mikroskop altına yerleştirin ve başarılı transdüksiyon için hücreleri izleyin. Transdüklenmiş hücreler GFP ekspresyine bağlı olarak floresandır.
Örnek protokolde, PDX-dissositasyonlu tümör hücrelerinin Lentiviral vektörlerle transdüksiyonunun gerçekleştirilmesini gerçekleştireceğiz.
Tümör hücrelerini transdüze etmek için, izole edilmiş hücreleri iki mililitre mammosfer ortamında yeniden doğuş için santrifüj edin. Saydıktan sonra, hücreleri tekrar santrifüj edin ve peletin 20 mikrolitre polibren ile desteklenmiş iki mililitre mammosfer ortamında yeniden biriktirin. Daha sonra, plaka 2 kez 10 ila beşinci uygulanabilir tümör hücreleri başına ultra düşük yapışma altı kuyu doku kültürü plakası ve Lentiviral parçacıklar hücrelere 10 enfeksiyon çokluğunda.
Virüsü hücrelerle karıştırmak ve ortak kültürleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksiti 96 saate kadar kuluçkaya yatırmak için plakayı döndürün ve ilk 24 saatten sonra 500 mikrolitre taze mammosfer ortamı ekleyin. Hücrelerin en az % 10'u GFP pozitif olduğunda, transdüklenmiş hücreleri en az bir kuyudan buz üzerindeki 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve kuyuyu bir mililitre mammosfer ortamı ile yıkayın.
Yıkamayı hücrelerle bir araya çıkarın ve tümör hücrelerini 10 mililitre HBSS artı HEPES'te santrifüj edin. Son olarak, hücreleri 50 mikrolitre bodrum matrisi özünde buz üzerinde yeniden biriktirin ve gömülü hücreleri yeniden dikim için 0,5 mililitrelik bir insülin şırıngasına yükleyin.
